En protokoll for fremstilling av grafen-støttede mikrotiterplateleser væske celler for in situ Electron mikroskopi av gull nanokrystaller fra HAuCl4 forløper løsning presenteres. Videre presenteres en analyse rutine for å kvantifisere observert etsing og vekst dynamikk.
Fabrikasjon og fremstilling av grafen-støttede mikrotiterplateleser væske celler (GSMLCs) for in situ Electron mikroskopi er presentert i en trinnvis protokoll. Allsidigheten til GSMLCs er demonstrert i sammenheng med en studie om etsing og vekst dynamikk av gull nanostrukturer fra en HAuCl4 forløper løsning. GSMLCs kombinerer fordelene med konvensjonelle silisium-og grafen-baserte væske celler ved å tilby reproduserbar brønn dybder sammen med facile celle produksjon og håndtering av prøven under etterforskning. GSMLCs er fabrikkert på en enkelt silisium substrat som drastisk reduserer kompleksiteten i produksjonsprosessen i forhold til to-Wafer-baserte flytende celle design. Her kreves ingen bindings-eller justerings prosesstrinn. Videre kan det vedlagte væskevolumet skreddersys til de respektive eksperimentelle kravene ved ganske enkelt å justere tykkelsen på et silisium nitride lag. Dette gjør en betydelig reduksjon av vinduet svulmende i elektronmikroskop vakuum. Endelig, en State-of-the-art kvantitativ evaluering av enkelt partikkel sporing og dendrit dannelse i flytende celle eksperimenter med bare åpen kildekode-programvare presenteres.
Moderne materialer vitenskap, kjemi og cellebiologi krever en dyp forståelse av underliggende dynamiske prosesser og effekter på sub-mikron skala. Til tross for kraften i avanserte optiske mikroskopi teknikker som stimulert-utslipp-tømming fluorescens mikroskopi1, Direct Imaging teknikker for å få tilgang til detaljerte morfologier krever elektron mikroskopi. Spesielt in situ (skanning) overføring elektron mikroskopi (S) tem har vist seg å belyse verdifull innsikt i prosess dynamikk ved å innkapsle væsker i dedikerte, vakuum tette celler2. Ulike eksperimenter som kvantitative undersøkelser av nanostructure formasjon Kinetics og termodynamikk3,4,5,6, Imaging av biologiske prøver7, 8 på alle , 9 andre priser , 10 og studier av energilagring-relaterte mekanismer11,12 sammen med omfattende studier av korrosjon prosessen Dynamics13 eller nanobubble fysikk14,15, 16 har unraveled mange fenomener bruker (S) tem som ikke var tilgjengelig ved hjelp av standard mikroskopi teknikker.
I løpet av det siste tiåret har det blitt etablert to store tilnærminger for å realisere in situ VÆSKE celle tem (LCTEM). I den første tilnærmingen, er væsken innkapslet i et hulrom mellom to si3N4 membraner produsert via si prosessteknologi17, mens i den andre, små flytende lommer dannes mellom to grafen eller grafenoksid ark 10,18. Håndteringen av både silisium-baserte væske celler (SiLCs) og grafen-baserte flytende celler (GLCs) har blitt demonstrert19,20,21. Selv om begge tilnærminger har gjennomgått betydelige forbedringer22,23,24,25, de fortsatt mangler i kombinasjon av de respektive fordeler. Generelt finnes det en hestekreftene mellom innkapsle av prøven i ofte udefinert grafen lommer med et lite flytende volum som muliggjør Høyoppløselig bilde18, og veldefinerte celle volumer som resulterer i tykkere membraner og flytende lag, som gir et miljø nærmere den naturlige situasjonen i bulk flytende26 på bekostning av oppløsning2. Videre er noen eksperimenter avhengig av en flytende Flow26,27 som bare har blitt realisert i SiLC arkitekturer og krever en dedikert tem holder28.
Her presenterer vi fabrikasjon og håndtering av en væske celle tilnærming for høy ytelse in situ LCTEM via statiske grafen-støttede mikrotiterplateleser væske celler (GSMLCs) for tem-analyser. En skisse av GSMLC er presentert i figur 1. GSMLCs har vist seg å være i stand til å muliggjøre in situ høyoppløselige Transmission Electron MIKROSKOPI (HRTEM) resultater6 og er også gjennomførbart for in situ Scanning Electron mikroskopi29. Deres si teknologi-basert ramme gjør det mulig for masseproduksjon av reproduserbar formede celler med skreddersydd væske tykkelse og ekstra tynne membraner fra en enkelt wafer. Grafen membran som dekker disse cellene også begrenser elektronstråle-indusert forstyrrelser8,30,31 siden elektron strålen passerer gjennom den øverste grafen membranen først. Den flate topografi av cellene gir mulighet for komplementære analysemetoder som energi-dispersive X-ray spektroskopi (EDXS)6 uten noen skygging effekter som følge av væske cellen selv, slik at en rekke av høy kvalitet in situ flytende celle elektron mikroskopi eksperimenter.
I motsetning til kommersielt tilgjengelige flytende celler, skreddersydde GSMLCs har den fordelen at de kan utformes for å passe inn i lett tilgjengelige TEM holdere og ikke krever en kostbar, dedikert væske celle TEM holderen.
GSMLC-arkitekturen som er vist her, kombinerer aspekter ved SiLCs og GLCs som potensielt kan føre til unike fordeler. På den ene siden, SiLCs tillate en presis bestemmelse av celle posisjon og form, men krever relativt tykk si3N4 membraner for å redusere svulmende effekter mens slutt redusere oppnåelig oppløsning. GLCs, derimot, viser eksepsjonelt tynne membran vegger bestående av grafen, men lider av tilfeldige Pocket størrelser og posisjoner. Ved å kombinere disse to membran tilnærminger via GSMLCs, oppløsning begrensningen forårsaket av cellegrensene35 kan omgås. Som brønnen strukturen er fabrikkert direkte inn i si3n4 Layer, den faktiske si3n4 membran kan KONSTRUERES enda mindre enn i SiLCs, forenkle HRTEM analyser som allerede er påvist i GSMLCs6 . Likevel bør det bemerkes at HRTEM generelt er mulig med SiLCs også48. Videre kan store visningsområder realiseres uten alvorlig vindu svulmende på grunn av de små membran områder av de enkelte prøve kamre. Dermed kan svulmende-relaterte tykkelse øke35 utelukkes i stor grad, som vist ved Dukes et al.49. Dette er demonstrert i figur 7, der en representativ høy vinkel Ringformet mørkt felt (HAADF) Stem bilde av Al lastet GSMLC vises. Dette bildet ble anskaffet ved hjelp av en dual-Beam system. Siden bildets lysstyrke ervervet i dette oppsettet er direkte relatert til prøven tykkelse, er det klart synlig at den forseglede microwells viser bare små negative svulmende. Kelly et al.24 har vist at de negative svulmende og delvis godt tørking synlig i figur 7 avhenger av brønn diameter. Å redusere brønn diameteren er derfor en mulig tilnærming for å homogenisere væske tykkelsen ytterligere.
På grunn av likevekt lommen form av GLCs, er væsken tykkelse også sterkt område avhengig35. SiLCs følger utformingen av to membraner som stammer fra ulike si wafere. Ved å erstatte toppen si3N4 membran med grafen, er flytende celle fabrikasjon forenklet. Dette betyr at mulig delaminering av to bundet si-wafere under påfølgende våte etsing trinnene kan unngås og justeringen av to wafer brikker under celle lasting er utelatt. Den flate overflaten på den ene siden av denne celle arkitekturen muliggjør komplementære in situ analysemetoder som EDXS analyse av prøven6, som er begrenset i konvensjonelle SiLC arkitekturer med skyggeeffekter på bratte si kanter50 .
Tetting prepatterned microwells med grafen på både bunn og topp brønn området har blitt demonstrert før24,25. Påføring av to grafen membraner kan forbedre oppnåelig oppløsning. En todelt grafen overføring vil imidlertid komplisere forberedelsesprosessen videre; spesielt siden dette har vist seg å være den mest følsomme Forberedelses trinn (se nedenfor). Videre er det over diskutert membran svulmende ventes å bli enda mer kritisk i tilfelle av to grafen membraner, fordi grafen er mye mer fleksibelt enn en si3N4 Layer. I disse arkitekturer, ble microwells konstruert ved hjelp av sekvensiell fokusert ion Beam (LØGN) fresing. Mens denne tilnærmingen har vist seg å gi resultater av høy kvalitet, er LØGN fresing komplisert og kostbar celle produksjon teknikk. Ved å benytte massivt parallelle enkelt-shot mønster teknikker som allerede er standard i dagens halvleder industri som nanoimprint-eller Foto litografi, har imidlertid den store fordelen av å være rask, billig og skalerbar for masseproduksjon.
Det bør bemerkes at tilnærmingen som presenteres her ikke tillater flytende flyt drift, som er oppnåelig av andre design28. Siden lasting og væske volum er sammenlignbare for GSMLCs og GLCs, en forurensning av høy vakuum på grunn av brudd på membranen kan unngås19. Dette eliminerer behovet for en tungvint sel sjekk. Selv om fordelene med SiLCs og GLCs har blitt kombinert, er ulempene ved begge tilnærmingene fortsatt til stede i GSMLCs. Fabrikasjon av cellene krever et rent rom infrastruktur for silisium-teknologi, som ikke nødvendigvis er til stede i TEM laboratorier. I tillegg er væsken lasting ikke trivielt. Det krever en dedikert opplæring, ligner på grafen celler. Dette gjelder imidlertid også for kommersielt tilgjengelige systemer. Her er den mest følsomme Forberedelses trinn TEM-Grid fjerning etter grafen overføringen fordi hud bevegelser eller variasjonsprosent er sannsynlig å bryte si3N4 Layer. De redundante membran vinduene øker imidlertid sjansene for å bevare minst ett membran område. Som en konsekvens av utbyttet (mengden av operativ GSMLC chips) oppnås ved en utdannet eksperimentator er tre av fire6, og dermed overstiger den oppnådde med grafen-baserte celler (en til to av fire)19.
Som med GLCs, den flytende innkapsling i GSMLCs er basert på Van-der-Waals interaksjoner18. Følgelig kan grensesnitt forurensning senke suksessraten i behandlingen av GSMLCs19. Videre, avhengig av Hamaker konstant av å-være-innkapslet flytende fase, fukting egenskaper under lasting prosedyren (og dermed oppnåelig yield) kan avvike51 og derfor preparatet kan være komplisert. Vår erfaring viser at dette er tilfelle hvis for eksempel amfifile arter er til stede.
GSMLC-arkitekturen muliggjør fleksibel konfigurering av brønn dybder, noe som åpner for tilpasning til ulike eksperimentelle forutsetninger. Videre er arkitekturen egnet for elektron tomografi undersøkelser over et bredt vippe vinkel område på ± 75 °, som også vil muliggjøre in situ electron tomografi52. Derfor kan det også etableres in situ og obduksjon tomografi av prøven i væske med GSMLCs.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker tilo Schmutzler for utarbeidelse av HAuCl4 løsning. Videre takker vi R. Christian Martens for bevis lesing. Økonomisk støtte av den tyske Forskningsstiftelsen (DFG) via Research Training Group GRK 1896 “in situ mikroskopi med elektroner, røntgen og skanning sonder” og gjennom Cluster of Excellence eks 315/2 EAM “engineering av avanserte materialer” er takknemlig erkjent.
Acetone | VWR Chemicals | 50488858 | VLSI |
Deionized water | own production | ||
Dumont Anti-Capillary tweezers | Carl Roth GmbH + Co. KG | LH72.1 | 0203-N5AC-PO Dumoxel alloyed |
Ethanol | VWR Chemicals | 85651.360 | VLSI |
FIJI Is Just ImageJ | FIJI.sc | Version 1.51 | |
Gold Quantifoil, Amorphous Carbon TEM Grids | Plano GmbH | S173-8 | R 2/2 Au 300 mesh |
HAuCl4 · 3 H2O crystal | Alfa Aesar | 36400.06 | 5 g |
Jupyter Notebook | Project Jupyter | Version 5.7.2 | |
Matplotlib-Package | John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom and the Matplotlib development team | Version 3.0.2 | |
NumPy-Package | NumPy developers | Version 1.15.4 | |
Pandas-Package | AQR Capital Management, LLC, Lambda Foundry, Inc. and PyData Development Team | Version 0.23.4 | |
Python | Python Software Foundation | Version 3.7 | |
Scipy-Package | SciPy developers | Version 1.1.0 | |
Seaborn-Package | Michael Waskom | Version 0.9.0 | |
Si wafer | Siegert Wafer GmbH | Thin silicon (100) wafer 175 +/-5 µm, 4", p-type, boron doped (1-30 Ohm cm), double-sided polished | |
single tilt TEM holder | Philips | Ensure that cell fits | |
Transmission Electron Microscope | Philips | CM 30 (S)TEM | 300 kV |
Trivial Transfer Graphene | ACS Material | TTG60011 | PMMA-covered, 6 — 8 MLs |