HAuCl4前駆体溶液から金ナノ結晶のその中の電子顕微鏡検査用グラフェン支持マイクロウェル液体細胞の調製のためのプロトコルが提示される。さらに、観察されたエッチングと成長ダイナミクスを定量化するための分析ルーチンが提示されます。
その中の電子顕微鏡検査用グラフェン支持マイクロウェル液体細胞(GSMLC)の製造および調製は、段階的なプロトコルで提示される。GSMLCsの汎用性は、HAuCl4前駆体溶液からの金ナノ構造のエッチングおよび成長ダイナミクスに関する研究の文脈で実証される。GSMLCは、従来のシリコンおよびグラフェン系液体セルの利点を組み合わせることで、樹脂細胞の製造と調査中の試料の取り扱いと共に、再生可能な深さを提供します。GSMLCは単一のシリコン基板で製造され、2ウエハベースの液体セル設計と比較して製造プロセスの複雑さを大幅に軽減します。ここでは、接合またはアライメントプロセスステップは必要ありません。さらに、封じられた液体体積は、窒化ケイ素層の厚さを調整するだけで、それぞれの実験要件に合わせて調整することができる。これにより、電子顕微鏡真空中の窓の膨らみを大幅に低減できます。最後に、オープンソースソフトウェアのみを用いた液体細胞実験における単一粒子追跡およびデンドライト形成の最先端の定量的評価を提示する。
現代の材料科学、化学、細胞生物学は、サブミクロンスケールでの基礎となる動的プロセスと効果を深く理解する必要があります。刺激放出・枯渇蛍光顕微鏡1などの高度な光学顕微鏡技術の力にもかかわらず、詳細な形態にアクセスするための直接イメージング技術は電子顕微鏡を必要とする。特に、その場所(走査)透過電子顕微鏡(S)TEMは、専用の真空密閉細胞2に液体を封入することにより、プロセスダイナミクスに関する貴重な洞察を照らすことが示されている。ナノ構造形成運動学および熱力学3,4,5,6,生物標本のイメージング7の定量的研究などの様々な実験、8,9,10およびエネルギー貯蔵関連メカニズムの研究11,12腐食プロセスダイナミクス13またはナノバブル物理学の包括的な研究14,15, 16は、標準的な顕微鏡検査技術を用いてアクセスできなかった(S)TEMを用いて多くの現象を解明した。
この10年間で、液体セルTEM(LCTEM)を実現するための2つの主要なアプローチが確立されました。最初のアプローチでは、液体はSiプロセス技術17を介して製造された2つのSi3N4膜の間の空洞に封入され、2番目のアプローチでは、小さな液体ポケットが2つのグラフェンまたはグラフェン酸化物シートの間に形成される。10、18.シリコン系液体セル(SiLC)とグラフェン系液体細胞(GLC)の両方の取り扱いが19,20,21で実証されている。いずれのアプローチも22、23、24、25の大幅な改善を受けているが、それぞれの利点の組み合わせにはまだ欠けている。一般に、高分解能イメージング18を可能にする小さな液体体積を持つ未定義のグラフェンポケットにサンプルを封入することと、より厚い膜および液体層をもたらす細胞容積との間にはトレードオフが存在し、これは、解像度2を犠牲にしてバルク液体26の自然な状況に近い環境を提供します。さらに、いくつかの実験は、SiLCアーキテクチャでのみ実現され、専用のTEMホルダー28を必要とする液体流れ26、27に依存する。
ここでは、TEM分析用の静的グラフェン支持マイクロウェル液体細胞(GSMLC)を用いて、LCTEMにおける高性能化のための液体セルアプローチの製造と取り扱いを紹介する。GSMLC のスケッチを図 1に示します。GSMLCは、高分解能透過電子顕微鏡(HRTEM)結果6において可能であることが証明されており、その中で電子顕微鏡29を走査することも可能である。 Si技術ベースのフレームは、単一のウエハから調整された液体の厚さと超薄膜を持つ再現可能な形状の細胞の大量生産を可能にします。これらの細胞を覆うグラフェン膜はまた、電子ビームが最初に上のグラフェン膜を通過するので、電子ビーム誘発摂動8、30、31を緩和する。細胞の平坦な地形は、液体細胞自体から生じる影の影響なしにエネルギー分散X線分光法(EDXS)6などの相補的な分析方法を可能にし、その場で様々な高品質を可能にします。液体細胞電子顕微鏡実験。
市販の液体セルとは対照的に、カスタムメイドのGSMLCは、容易に入手可能なTEMホルダーに収まるように設計することができ、高価な専用の液体セルTEMホルダーを必要としないという利点があります。
ここで示した GSMLC アーキテクチャは、SiLC と GLC の側面を組み合わせることで、独自の利点につながる可能性があります。一方、SiLCは細胞の位置および形の精密な決定を可能にするが、最終的に達成可能な決断を減らしながら膨らみ効果を減らすために比較的厚いSi3N4膜を要求する。一方、GLCはグラフェンからなる非常に薄い膜壁を示すが、ランダムなポケットサイズと位置に苦しんでいる。GSMLCを介してこれら2つの膜アプローチを組み合わせることにより、細胞境界35によって引き起こされる分解能制限をバイパスすることができる。ウェル構造がSi3 N4層に直接分解されるため、実際のSi3N4膜はSiLCよりもさらに小さく構築でき、GSMLC 6で既に実証されているHRTEM解析を簡素化.それでも、HRTEMは一般的にSiLCでも48でも可能である。さらに、個々の標本室の小さい膜区域による重度の窓の膨らみなしで大きい観覧区域は実現することができる。それによって、膨らみ関連の厚み35は、Dukes et al.49に示すように、大部分に除外することができる。これは図 7で示されています。この画像はデュアルビームシステムを使用して取得されました。この設定で得られた画像の明るさは、試料の厚さに直接関係しているので、密閉されたマイクロウェルは小さな負の膨らみしか示さなことがはっきりと分かっています。Kelly et al.24は、図7に示す負の膨らみおよび部分的な井戸乾燥が井戸直径に依存することを実証した。したがって、井戸径を小さくすることは、液体の厚さをさらに均質化するための実現可能なアプローチです。
GLCの平衡ポケット形状に起因して、液体の厚さも強く部位依存35である。SiLCは異なったSiウエハから起因する2つの膜の設計に従う。上部Si 3N4膜をグラフェンに置き換えることにより、液体細胞の製造が簡素化される。これは、後続のウェットエッチングステップ中に2つの接合されたSi-ウェーハの可能性をデアミネーションすることができ、細胞ローディング中に2つのウエハ片の位置合わせを省略できることを意味します。このセルアーキテクチャの片側の平坦な表面は、急なSiエッジでのシャドウ効果によって従来のSiLCアーキテクチャで制限されている試料6のEDXS解析などの現場分析方法で補完を可能にします50.
底部および上部ウェル部位の両方にグラフェンを使用したプレパターン化されたマイクロウェルのシールは、24,25の前に実証されている。2つのグラフェン膜を適用すると、達成可能な分解能を高めることができる。しかし、グラフェンの二重の転写は、準備プロセスをさらに複雑にします。これは最も敏感な準備ステップであることが証明されているので、特に(下記参照)。さらに、グラフェンはSi3 N4層よりもはるかに柔軟であるため、2つのグラフェン膜の場合には、上記の膜膨らみがさらに重要であることが予想されます。これらのアーキテクチャでは、マイクロウェルは、シーケンシャルフォーカスイオンビーム(FIB)ミリングを使用して構築されました。このアプローチは、高品質の結果を生み出すことを証明していますが、FIBフライス加工は複雑で高価な細胞製造技術です。しかし、ナノインプリントやフォトリソグラフィーなど、今日の半導体業界で既に標準となっている並列シングルショットパターニング技術を活用することは、大量生産に対して高速、安価、スケーラブルであるという大きな利点があります。
ここで提示されるアプローチは、他の設計28によって達成可能である液体流れ動作を可能にしないことに留意すべきである。積載量と液体容積はGSMLCおよびGLCに匹敵するので、膜の破裂による高真空の汚染は19を避けることができる。これは面倒なシールの点検のための必要性を除去する。SiLC と GLC の利点は組み合わされていますが、両方のアプローチの欠点は GSMLC にまだ存在します。細胞の製造には、シリコン技術のためのクリーンルームインフラストラクチャが必要であり、必ずしもTEMラボに存在するとは限りません。また、液体の負荷は些細ではありません。グラフェン細胞と同様に、専用のトレーニングが必要です。ただし、市販のシステムにも当てはまります。ここで、最も敏感な調製工程は、発疹運動またはジッタリングがSi3N4層を破壊する可能性があるため、グラフェン転写後のTEMグリッド除去である。しかし、冗長な膜窓は、少なくとも1つの膜領域を保存する可能性を高めます。その結果、訓練を受けた実験者によって達成される収量(作動可能なGSMLCチップの量)は、4つの6のうち3つであり、したがってグラフェン系細胞(4つのうち1~2個)で達成されたものを超える19。
GLC と同様に、GSMLC の液体カプセル化は、ファン デル・ワールス相互作用18に基づいています。その結果、インターフェイスの汚染は、GSMLC19の処理の成功率を低下させる可能性があります。さらに、封入される液体相のHamaker定数に応じて、積載手順中の湿式特性(したがって達成可能な収率)は51と異なる可能性があるため、調製が複雑になる可能性があります。我々の経験は、例えば、親和性種が存在する場合に、これがそうであることを示しています。
GSMLC アーキテクチャを使用すると、深度の柔軟な構成が可能になり、さまざまな実験的前提条件への適応が可能になります。さらに、このアーキテクチャは±75°の広い傾斜角範囲にわたる電子断層撮影の調査に適しており、その場で電子断層撮影52を可能にする。したがって、液体中の標本の死後断層撮影においても、GSMLCsで確立することができる。
The authors have nothing to disclose.
我々は、HAuCl4ソリューションの準備のためにティロ・シュムツラーに感謝します。さらに、R.クリスチャン・マルテンスに対して、校正を行ってくださってありがとうございます。ドイツ研究財団(DFG)による研究研修グループGRK 1896「電子、X線、走査プローブによる顕微鏡検査」とエクセレンスEXC 315/2 EAM「先端材料の工学」を通じて、ドイツ研究財団(DFG)による財政的支援感謝の気持ちを認める。
Acetone | VWR Chemicals | 50488858 | VLSI |
Deionized water | own production | ||
Dumont Anti-Capillary tweezers | Carl Roth GmbH + Co. KG | LH72.1 | 0203-N5AC-PO Dumoxel alloyed |
Ethanol | VWR Chemicals | 85651.360 | VLSI |
FIJI Is Just ImageJ | FIJI.sc | Version 1.51 | |
Gold Quantifoil, Amorphous Carbon TEM Grids | Plano GmbH | S173-8 | R 2/2 Au 300 mesh |
HAuCl4 · 3 H2O crystal | Alfa Aesar | 36400.06 | 5 g |
Jupyter Notebook | Project Jupyter | Version 5.7.2 | |
Matplotlib-Package | John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom and the Matplotlib development team | Version 3.0.2 | |
NumPy-Package | NumPy developers | Version 1.15.4 | |
Pandas-Package | AQR Capital Management, LLC, Lambda Foundry, Inc. and PyData Development Team | Version 0.23.4 | |
Python | Python Software Foundation | Version 3.7 | |
Scipy-Package | SciPy developers | Version 1.1.0 | |
Seaborn-Package | Michael Waskom | Version 0.9.0 | |
Si wafer | Siegert Wafer GmbH | Thin silicon (100) wafer 175 +/-5 µm, 4", p-type, boron doped (1-30 Ohm cm), double-sided polished | |
single tilt TEM holder | Philips | Ensure that cell fits | |
Transmission Electron Microscope | Philips | CM 30 (S)TEM | 300 kV |
Trivial Transfer Graphene | ACS Material | TTG60011 | PMMA-covered, 6 — 8 MLs |