Ett protokoll för beredning av grafenstödd mikrobrunn flytande celler för in situ elektronmikroskopi av guld nanokristaller från haucl4 prekursorer lösning presenteras. Dessutom presenteras en analys rutin för att kvantifiera observerad etsning och tillväxtdynamik.
Tillverkning och beredning av grafenstödda mikrobrunn-vätskeceller (GSMLCs) för in situ -elektronmikroskopi presenteras i ett stegvis protokoll. Mångsidigheten i GSMLCs visas i samband med en studie om etsning och tillväxtdynamik av guldnanostrukturer från en HAuCl4 prekursorer lösning. GSMLCs kombinerar fördelarna med konventionella kisel-och grafenbaserade vätske celler genom att erbjuda reproducerbara borrdjup tillsammans med facile cell tillverkning och hantering av preparatet under utredning. GSMLCs tillverkas på ett enda kisel substrat som drastiskt minskar komplexiteten i tillverkningsprocessen jämfört med två-wafer-baserade flytande cell konstruktioner. Här krävs inga bindnings-eller justerings processteg. Dessutom kan den medföljande vätskevolymen anpassas till respektive experimentella krav genom att helt enkelt justera tjockleken på ett kisel nitridskikt. Detta möjliggör en signifikant minskning av fönster utbuktning i elektronmikroskopet vakuum. Slutligen presenteras en State-of-the-art kvantitativ utvärdering av Single partikel Tracking och Dendrit formation i flytande cell experiment med endast öppen källkod.
Modern materialvetenskap, kemi och cellbiologi kräver en djup förståelse för underliggande dynamiska processer och effekter i den sub-micron skalan. Trots kraften i avancerade optiska mikroskopi tekniker såsom stimulerade-emission-utarmning fluorescens mikroskopi1, direkt avbildning tekniker för att komma åt detaljerade morfologier kräver elektronmikroskopi. I synnerhet, in situ (skanning) transmission elektronmikroskopi (S) tem har visat sig belysa värdefulla insikter i processdynamik genom att kapa vätskor i dedikerade, vakuum-tight celler2. Olika experiment, såsom kvantitativa undersökningar av nanostrukturbildande kinetik och termodynamik3,4,5,6, avbildning av biologiska preparat7, 8 , 9 , 10 och studier av energilagringsrelaterade mekanismer11,12 tillsammans med omfattande studier av korrosion process Dynamics13 eller nanobubble physics14,15, 16 har avslöjad många fenomen med (S) tem som inte var tillgängliga med hjälp av standard mikroskopi tekniker.
Under det senaste decenniet har två viktiga metoder för att realisera in situ Liquid cell tem (LCTEM) fastställts. I den första metoden är vätskan inkapslad i en hålighet mellan två si3N4 membran som produceras via si process Technology17, medan i den andra, små vätske fickor bildas mellan två grafen eller grafen oxid ark 10,18. Hanteringen av både kisel-baserade vätske celler (Silcs) och grafenbaserade vätske celler (glcs) har visats19,20,21. Även om båda metoderna har genomgått betydande förbättringar22,23,24,25, saknar de fortfarande i kombinationen av respektive fördelar. I allmänhet finns en kompromiss mellan att kapta provet i ofta odefinierade grafenfickor med en liten vätskevolym som möjliggör högupplöst avbildning18, och väl definierade cell volymer som resulterar i tjockare membran och flytande skikt, som ger en miljö som ligger närmare den naturliga situationen i bulk Liquid26 på bekostnad av resolution2. Dessutom beror vissa experiment på ett flytande flöde26,27 som endast har realiserats i SiLC-arkitekturer och kräver en dedikerad tem-hållare28.
Här presenterar vi tillverkning och hantering av en flytande cell metod för högpresterande in situ lctem via statisk grafenstödda mikrobrunn flytande celler (gsmlcs) för tem analyser. En skiss av GSMLC presenteras i figur 1. GSMLCs har visat sig kunna möjliggöra in situ högupplöst transmission elektronmikroskopi (hrtem) resultat6 och är också genomförbara för in situ scanning elektronmikroskopi29. Deras si-teknikbaserade ram möjliggör massproduktion av reproducerbara formade celler med skräddarsydd flytande tjocklek och extra tunna membran från en enda wafer. Grafenmembranet som täcker dessa celler dämpar också elektronstrålen-inducerad störningar8,30,31 eftersom elektronstrålen passerar genom det översta grafen membranet först. Cellernas plana topografi möjliggör kompletterande analysmetoder såsom energidispersiv röntgenspektroskopi (EDXS)6 utan skuggeffekter som uppkommer från själva vätske cellen, vilket möjliggör en mängd olika högkvalitativa in situ – flytande cellelektronmikroskopi experiment.
I motsats till kommersiellt tillgängliga vätske celler, skräddarsydda GSMLCs har fördelen att de kan utformas för att passa in lätt tillgängliga TEM innehavare och inte kräver en dyr, dedikerad flytande cell TEM Holder.
Den GSMLC arkitektur som demonstreras här kombinerar aspekter av SiLCs och GLCs som potentiellt kan leda till unika fördelar. Å ena sidan, SiLCs möjliggöra en exakt bestämning av cell position och form, men kräver relativt tjocka si3N4 membran för att minska utbuktande effekter samtidigt i slutändan minska den uppnåeliga upplösningen. GLCs, å andra sidan, uppvisar exceptionellt tunna membran väggar bestående av grafen, men lider av slumpmässiga fickstorlekar och positioner. Genom att kombinera dessa två membran metoder via GSMLCs, kan den resolution begränsning som orsakas av cell gränser35 kringgås. Eftersom brunnen struktur tillverkas direkt i si3n4 skikt, kan den faktiska si3n4 membran konstrueras ännu mindre än i Silks, förenkla Hrtem analyser som redan har visats i gsmlcs6 . Det bör dock noteras att HRTEM i allmänhet är möjligt med SiLCs samt48. Dessutom kan stora visningsområden realiseras utan allvarliga fönster utbuktning på grund av de små membran områden av enskilda preparat kammare. Därmed, svällande-relaterade tjocklek ökning35 kan uteslutas i stor utsträckning, som visas av Dukes et al.49. Detta visas i figur 7, där en representativ hög vinkel ringformig mörk fält (haadf) stam bilden av Al Loaded GSMLC är visad. Denna bild förvärvades med hjälp av ett Dual-beam-system. Eftersom bildens ljusstyrka som förvärvas i denna inställning är direkt relaterad till preparat tjockleken, är det tydligt att de förseglade mikrobrunnarna uppvisar endast små negativa utbuktning. Kelly et al.24 har visat att den negativa utbuktning och delvis väl torkning synlig i figur 7 beror på brunnen diameter. Att minska brunnen diameter är därför en genomförbar metod för att homogenisera den flytande tjockleken ännu längre.
Tack vare som equilibriumen fick form av GLCs, är vätske tjockleken också starkt plats-anhörigen35. SiLCs följa utformningen av två membran som härrör från olika si wafers. Genom att ersätta den övre si3N4 -membranet med grafen, är flytande cell tillverkning förenklad. Detta innebär att möjligt delaminering av två bundna si-rån under de efterföljande våt etsning steg kan undvikas och anpassningen av två wafer bitar under cell lastning utelämnas. Den plana ytan på ena sidan av denna cell arkitektur möjliggör kompletterande in situ -analysmetoder såsom edxs-analys av preparat6, som är begränsad i konventionella SiLC-arkitekturer genom skuggeffekter vid branta si-kanter50 .
Tätning premönstrade mikrobrunnar med grafen på både botten och övre brunnen plats har visats före24,25. Applicering av två grafenmembran kan förbättra den uppnåeliga upplösningen. En tvådelad grafenöverföring skulle emellertid försvåra förberedelseprocessen ytterligare. särskilt eftersom detta har visat sig vara det känsligaste förberedelsesteget (se nedan). Vidare, den ovan diskuterade membran utbuktande förväntas bli ännu mer kritisk vid två grafenmembran, eftersom grafen är mycket mer flexibel än en SI3N4 skikt. I dessa arkitekturer konstruerades mikrobrunnarna med hjälp av sekventiellt fokuserad jonstråle (FIB) fräsning. Även om detta tillvägagångssätt har visat sig ge högkvalitativa resultat, FIB fräsning är komplicerad och dyr cell produktion teknik. Använda massivt parallella Single-Shot mönster teknik som redan är standard i dagens halvledarindustrin såsom Nanoimprint-eller Photolithography, dock har den stora fördelen att vara snabb, billig och skalbar för massproduktion.
Det bör noteras att det tillvägagångssätt som presenteras här inte medger vätske flödes drift, vilket kan uppnås med andra konstruktioner28. Eftersom lastning och vätskevolym är jämförbara för GSMLCs och GLCs, kan en förorening av högvakuum på grund av bristning av membranet undvikas19. Detta eliminerar behovet av en besvärlig tätning kontroll. Även om fördelarna med SiLCs och GLCs har kombinerats, nackdelarna med båda metoderna är fortfarande närvarande i GSMLCs. Tillverkningen av cellerna kräver en ren rums infrastruktur för kiselteknik, som inte nödvändigtvis finns i TEM laboratorier. Dessutom är flytande lastning inte trivialt. Det kräver en dedikerad utbildning, liknande grafenceller. Detta gäller dock även för kommersiellt tillgängliga system. Här är det mest känsliga förberedelsesteget TEM-Grid avlägsnande efter grafen överföringen eftersom hudutslag rörelser eller nervositet är sannolikt att bryta si3N4 skikt. De redundanta membran Fönstren ökar dock chanserna att bevara minst ett membran område. Som en följd av detta är avkastningen (mängden operabla GSMLC chips) som uppnåtts av en utbildad försöksledaren tre av fyra6, och därmed överskrider den som uppnås med grafenbaserade celler (en till två av fyra)19.
Som med GLCs, är den flytande inkapsling i GSMLCs baserad på Van-der-Waals interaktioner18. Följaktligen kan gränssnitts förorening sänka framgångs graden vid bearbetning av GSMLCs19. Dessutom, beroende på hamaker konstant i att-vara-inkapslad flytande fas, vätning egenskaper under lastning förfarande (och därmed uppnåeliga avkastning) kan skilja51 och därför preparatet kan vara komplicerat. Vår erfarenhet visar att så är fallet om exempelvis amfifila arter förekommer.
GSMLC-arkitekturen möjliggör flexibel konfiguration av väl djup, vilket möjliggör anpassning till olika experimentella förutsättningar. Dessutom lämpar sig arkitekturen för elektron tomografi-undersökningar över ett brett lutningsvinkel område på ± 75 °, vilket också skulle möjliggöra in situ -elektrontomografi52. Därför kan också in situ -och Postmortem -tomografi av preparat i vätska fastställas med gsmlcs.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Tilo Schmutzler för beredningen av HAuCl4 -lösningen. Dessutom tackar vi R. Christian Martens för korrekturläsning. Finansiellt stöd från den tyska Research Foundation (DFG) via forskarutbildningsgruppen GRK 1896 “in situ mikroskopi med elektroner, röntgenstrålar och scanning sonder” och genom Cluster of Excellence EXC 315/2 EAM “Engineering av avancerade material” är tacksamt erkänt.
Acetone | VWR Chemicals | 50488858 | VLSI |
Deionized water | own production | ||
Dumont Anti-Capillary tweezers | Carl Roth GmbH + Co. KG | LH72.1 | 0203-N5AC-PO Dumoxel alloyed |
Ethanol | VWR Chemicals | 85651.360 | VLSI |
FIJI Is Just ImageJ | FIJI.sc | Version 1.51 | |
Gold Quantifoil, Amorphous Carbon TEM Grids | Plano GmbH | S173-8 | R 2/2 Au 300 mesh |
HAuCl4 · 3 H2O crystal | Alfa Aesar | 36400.06 | 5 g |
Jupyter Notebook | Project Jupyter | Version 5.7.2 | |
Matplotlib-Package | John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom and the Matplotlib development team | Version 3.0.2 | |
NumPy-Package | NumPy developers | Version 1.15.4 | |
Pandas-Package | AQR Capital Management, LLC, Lambda Foundry, Inc. and PyData Development Team | Version 0.23.4 | |
Python | Python Software Foundation | Version 3.7 | |
Scipy-Package | SciPy developers | Version 1.1.0 | |
Seaborn-Package | Michael Waskom | Version 0.9.0 | |
Si wafer | Siegert Wafer GmbH | Thin silicon (100) wafer 175 +/-5 µm, 4", p-type, boron doped (1-30 Ohm cm), double-sided polished | |
single tilt TEM holder | Philips | Ensure that cell fits | |
Transmission Electron Microscope | Philips | CM 30 (S)TEM | 300 kV |
Trivial Transfer Graphene | ACS Material | TTG60011 | PMMA-covered, 6 — 8 MLs |