Summary

Dual bioluminesens Imaging av tumor progresjon og angiogenese

Published: August 01, 2019
doi:

Summary

Denne protokollen beskriver etablering av en tumor-bærende mus modell for å overvåke tumorprogresjon og angiogenese i sanntid av dual bioluminesens Imaging.

Abstract

Angiogenese, som en viktig prosess med tumorprogresjon, har blitt et forsknings-hotspot og mål for anti-tumor terapi. Det er imidlertid ingen pålitelig modell for sporing tumorprogresjon og angiogenese samtidig i en visuell og følsom måte. Bioluminesens Imaging viser sin unike overlegenhet i levende Imaging på grunn av sine fordeler med høy følsomhet, sterk spesifisitet, og nøyaktig måling. Presentert her er en protokoll for å etablere en tumor-bærende mus modell ved å injisere en Renilla luciferase-merket murine brystkreft cellelinje 4T1 i transgene mus med Angiogenese-indusert Firefly luciferase uttrykk. Denne musen modell skaffer en kostbar verktøyet å samtidig dataskjerm svulst progresjon og angiogenese inne virkelig-tid av dobbelt bioluminesens tenkelig inne en enkelt musen. Denne modellen kan bli mye brukt i anti-tumor narkotika screening og onkologi forskning.

Introduction

Angiogenese er en viktig prosess i utviklingen av kreft fra små, lokaliserte svulster til større, potensielt metastatisk svulster1,2. Sammenhengen mellom tumor vekst og angiogenese blir en av punktene i vekt på feltet av onkologi forskning. Men tradisjonelle metoder for å måle morfologiske endringer mislykkes i å overvåke tumorprogresjon og angiogenese samtidig i levende dyr ved hjelp av en visualisere tilnærming.

Bioluminesens Imaging (bli) av tumorceller er en spesielt hensiktsmessig eksperimentell metode for å overvåke tumor vekst på grunn av sin ikke-invasiveness, følsomhet, og spesifisitet3,4,5,6 . BLI-teknologi er basert på prinsippet om at luciferase kan katalysere oksidasjon av et bestemt substrat mens emitting bioluminesens. Luciferase uttrykt i implantert tumorceller reagerer med injisert substrat, som kan oppdages av en levende Imaging system, og signaler indirekte reflekterer endringene i celle nummer eller celle lokalisering i vivo6,7.

Med unntak av tumor vekst, kan tumor angiogenese (det kritiske trinnet i kreft progresjon) også bli visualisere gjennom bli-teknologi ved hjelp av Vegfr2-svingninger-KI transgene Mouse8,9,10. Den vaskulære endothelial vekstfaktor (Vegf) reseptor 2 (Vegfr2), en type Vegf reseptor, er stort sett uttrykt i den vaskulære endothelial celler av voksne mus11. I Vegfr2-svingninger-KI transgene mus blir DNA-sekvensen av Firefly luciferase (svingninger) slått inn i den første ekson av den endogene Vegfr2 sekvensen. Som et resultat, svingninger uttrykkes (som vises som BLI-signaler) på en måte som er identisk med nivået av angiogenese i mus. Å vokse utover noen få millimeter i størrelse, den tumor rekrutterer nye vasculatures fra eksisterende blodårer, som svært uttrykker Vegfr2 utløst av vekstfaktorer fra tumorceller1. Dette åpner muligheten for å bruke Vegfr2-svingninger-KI transgene mus til ikke-invasivt overvåke tumor angiogenese av BLI.

I denne protokollen, er en tumor-bærende mus modell etablert for å overvåke tumorprogresjon og angiogenese i en enkelt mus gjennom Firefly luciferase (svingninger) og Renilla luciferase (Rluc) Imaging, henholdsvis (figur 1). En 4T1 cellelinje (4T1-RR) er opprettet som stabilt uttrykker Rluc og rødt fluorescerende protein (RFP) å spore cellevekst ved Rluc Imaging. For ytterligere å undersøke dynamiske endringer av angiogenese i progresjon og regresjon av svulsten, en annen 4T1 cellelinje (4T1-RRT) er opprettet som uttrykker selvmords genet herpes simplex virus avkortet tymidin kinase (HSV-TTK), Rluc, og RFP. Ved administrering av ganciklovir (GCV), HSV-TTK uttrykker celler er selektivt ablated. Basert på disse cellelinjer, en svulst-bærende modell i Vegfr2-svingninger-KI mus er bygget som fungerer som en eksperimentell modell bygge bro tumorprogresjon og tumor angiogenese in vivo.

Protocol

Eksperimenter må være i samsvar med nasjonale og institusjonelle bestemmelser om bruk av dyr til forskningsformål. Tillatelser til å utføre eksperimenter må innhentes. Behandlingen av dyr og eksperimentelle prosedyrer av studien overholder Nankai University Animal Care og bruk komité retningslinjer som samsvarer med retningslinjene for Animal Care godkjent av National Institutes of Health (NIH). 1. LV-Rluc-RFP (RR) og LV-Rluc-RFP-HSV-TTK (RRT) lentiviral emballasje og produksjon <p cl…

Representative Results

I dette eksperimentet ble en brystkreft mus modell etablert ved hjelp av 4T1 celler for å undersøke forholdet mellom tumor vekst og tumor angiogenese (figur 1). For det første ble to lentivirus pakket, som bar gen sekvenser uttrykker Rluc/RFP (LV-RR) og Rluc/RFP/HSV-TTK (LV-RRT), henholdsvis som tidligere rapportert7. Så, to annerledes 4T1 cellen linjer, benevnt 4T1-RR og 4T1-RRT, var skapt av transducing LV-RR og LV-RRT respective…

Discussion

I denne protokollen er en ikke-invasiv dual BLI-tilnærming beskrevet for overvåking av tumor utvikling og angiogenese. BLI reporter systemet er først utviklet, som inneholder HSV-TTK/GCV selvmords genet for sporing av tumorprogresjon og regresjon i vivo av Rluc Imaging. I mellomtiden er tumor angiogenese vurderes ved hjelp av Vegfr2-svingninger-KI mus via svingninger Imaging. Denne svulst bærende musen modellen er i stand til å gi en praktisk plattform for kontinuerlig og ikke-invasiv sporing tumor utvikling og tumo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne forskningen ble støttet av National Key R & D-programmet i Kina (2017YFA0103200), National Natural Science Foundation i Kina (81671734), og viktige prosjekter i Tianjin Science and Technology Support program (18YFZCSY00010), grunnleggende Research Funds for de sentrale universitetene (63191155). Vi anerkjenner Gloria vedlikeholds revisjoner, som var verdifulle i å forbedre kvaliteten på manuskriptet vårt.

Materials

0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA Gibco 25200072
1.5 mL Tubes Axygen Scientific MCT-105-C-S
15 mL Tubes Corning Glass Works 601052-50
293T ATCC CRL-3216
4T1 ATCC CRL-2539
60 mm Dish Corning Glass Works 430166
6-well Plate Corning Glass Works 3516
Biosafety Cabinet Shanghai Lishen Scientific Hfsafe-900LC
Blasticidine S Hydrochloride (BSD) Sigma-Aldrich 15205
Cell Counting Kit-8 MedChem Express HY-K0301
CO2 Tegulated Incubator Thermo Fisher Scientific 4111
Coelenterazine (CTZ) NanoLight Technology 479474
D-luciferin Potassium Salt Caliper Life Sciences 119222
DMEM Medium Gibco C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS) BIOIND 04-001-1A
Fluorescence Microscope Nikon Ti-E/U/S
Ganciclovir (GCV) Sigma-Aldrich Y0001129
Graphics Software GraphPad Software Graphpad Prism 6
Insulin Syringe Needles Becton Dickinson 328421
Isoflurane Baxter 691477H
Lentiviral Packaging System Biosettia cDNA-pLV03
Liposome Invitrogen 11668019
Living Imaging Software Caliper Life Sciences Living Imaging Software 4.2
Living Imaging System Caliper Life Sciences IVIS Lumina II
MEM Medium Invitrogen 31985-070
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning Glass Works R21031399
Polybrene Sigma-Aldrich H9268-1G
RPMI1640 Medium Gibco C11875500BT
SORVALL ST 16R Centrifuge Thermo Fisher Scientific Thermo Sorvall ST 16 ST16R
Ultra-low Temperature Refrigerator Haier DW-86L338
XGI-8 Gas Anesthesia System XENOGEN Corporation 7293

References

  1. Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).
  2. Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).
  3. Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).
  4. Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
  5. McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).
  6. Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC. Journal of Clinical Oncology. 26, 17006 (2008).
  7. Wang, R., et al. Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence. Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).
  8. Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. Tumor angiogenesis, from foe to friend. Science. 349, 694-695 (2015).
  9. Zhang, K., et al. Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment. ACS Applied Materials & Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).
  10. Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. , 70-81 (2017).
  11. Lee, S., et al. Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis. Cell. 130, 691-703 (2007).
  12. Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response. Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).
  13. Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer. Pharmacology & Therapeutics. 164, 152-169 (2016).
  14. Wong, P. P., et al. Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread. Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).
  15. Mezzanotte, L., van 't Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications. Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).
  16. Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy. Biochimie. 116, 43-51 (2015).
  17. Liu, J., et al. Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).
  18. Branchini, B. R., et al. Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments. Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).
  19. McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing "red-shifted" luciferase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571 (2013).

Play Video

Cite This Article
Zhang, K., Wang, C., Wang, R., Chen, S., Li, Z. Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (150), e59763, doi:10.3791/59763 (2019).

View Video