Dual bioluminesens Imaging av tumor progresjon og angiogenese
Summary
Denne protokollen beskriver etablering av en tumor-bærende mus modell for å overvåke tumorprogresjon og angiogenese i sanntid av dual bioluminesens Imaging.
Abstract
Angiogenese, som en viktig prosess med tumorprogresjon, har blitt et forsknings-hotspot og mål for anti-tumor terapi. Det er imidlertid ingen pålitelig modell for sporing tumorprogresjon og angiogenese samtidig i en visuell og følsom måte. Bioluminesens Imaging viser sin unike overlegenhet i levende Imaging på grunn av sine fordeler med høy følsomhet, sterk spesifisitet, og nøyaktig måling. Presentert her er en protokoll for å etablere en tumor-bærende mus modell ved å injisere en Renilla luciferase-merket murine brystkreft cellelinje 4T1 i transgene mus med Angiogenese-indusert Firefly luciferase uttrykk. Denne musen modell skaffer en kostbar verktøyet å samtidig dataskjerm svulst progresjon og angiogenese inne virkelig-tid av dobbelt bioluminesens tenkelig inne en enkelt musen. Denne modellen kan bli mye brukt i anti-tumor narkotika screening og onkologi forskning.
Introduction
Angiogenese er en viktig prosess i utviklingen av kreft fra små, lokaliserte svulster til større, potensielt metastatisk svulster1,2. Sammenhengen mellom tumor vekst og angiogenese blir en av punktene i vekt på feltet av onkologi forskning. Men tradisjonelle metoder for å måle morfologiske endringer mislykkes i å overvåke tumorprogresjon og angiogenese samtidig i levende dyr ved hjelp av en visualisere tilnærming.
Bioluminesens Imaging (bli) av tumorceller er en spesielt hensiktsmessig eksperimentell metode for å overvåke tumor vekst på grunn av sin ikke-invasiveness, følsomhet, og spesifisitet3,4,5,6 . BLI-teknologi er basert på prinsippet om at luciferase kan katalysere oksidasjon av et bestemt substrat mens emitting bioluminesens. Luciferase uttrykt i implantert tumorceller reagerer med injisert substrat, som kan oppdages av en levende Imaging system, og signaler indirekte reflekterer endringene i celle nummer eller celle lokalisering i vivo6,7.
Med unntak av tumor vekst, kan tumor angiogenese (det kritiske trinnet i kreft progresjon) også bli visualisere gjennom bli-teknologi ved hjelp av Vegfr2-svingninger-KI transgene Mouse8,9,10. Den vaskulære endothelial vekstfaktor (Vegf) reseptor 2 (Vegfr2), en type Vegf reseptor, er stort sett uttrykt i den vaskulære endothelial celler av voksne mus11. I Vegfr2-svingninger-KI transgene mus blir DNA-sekvensen av Firefly luciferase (svingninger) slått inn i den første ekson av den endogene Vegfr2 sekvensen. Som et resultat, svingninger uttrykkes (som vises som BLI-signaler) på en måte som er identisk med nivået av angiogenese i mus. Å vokse utover noen få millimeter i størrelse, den tumor rekrutterer nye vasculatures fra eksisterende blodårer, som svært uttrykker Vegfr2 utløst av vekstfaktorer fra tumorceller1. Dette åpner muligheten for å bruke Vegfr2-svingninger-KI transgene mus til ikke-invasivt overvåke tumor angiogenese av BLI.
I denne protokollen, er en tumor-bærende mus modell etablert for å overvåke tumorprogresjon og angiogenese i en enkelt mus gjennom Firefly luciferase (svingninger) og Renilla luciferase (Rluc) Imaging, henholdsvis (figur 1). En 4T1 cellelinje (4T1-RR) er opprettet som stabilt uttrykker Rluc og rødt fluorescerende protein (RFP) å spore cellevekst ved Rluc Imaging. For ytterligere å undersøke dynamiske endringer av angiogenese i progresjon og regresjon av svulsten, en annen 4T1 cellelinje (4T1-RRT) er opprettet som uttrykker selvmords genet herpes simplex virus avkortet tymidin kinase (HSV-TTK), Rluc, og RFP. Ved administrering av ganciklovir (GCV), HSV-TTK uttrykker celler er selektivt ablated. Basert på disse cellelinjer, en svulst-bærende modell i Vegfr2-svingninger-KI mus er bygget som fungerer som en eksperimentell modell bygge bro tumorprogresjon og tumor angiogenese in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen er en ikke-invasiv dual BLI-tilnærming beskrevet for overvåking av tumor utvikling og angiogenese. BLI reporter systemet er først utviklet, som inneholder HSV-TTK/GCV selvmords genet for sporing av tumorprogresjon og regresjon i vivo av Rluc Imaging. I mellomtiden er tumor angiogenese vurderes ved hjelp av Vegfr2-svingninger-KI mus via svingninger Imaging. Denne svulst bærende musen modellen er i stand til å gi en praktisk plattform for kontinuerlig og ikke-invasiv sporing tumor utvikling og tumo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av National Key R & D-programmet i Kina (2017YFA0103200), National Natural Science Foundation i Kina (81671734), og viktige prosjekter i Tianjin Science and Technology Support program (18YFZCSY00010), grunnleggende Research Funds for de sentrale universitetene (63191155). Vi anerkjenner Gloria vedlikeholds revisjoner, som var verdifulle i å forbedre kvaliteten på manuskriptet vårt.
Materials
| 0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 1.5 mL Tubes | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
| 15 mL Tubes | Corning Glass Works | 601052-50 | |
| 293T | ATCC | CRL-3216 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
| 6-well Plate | Corning Glass Works | 3516 | |
| Biosafety Cabinet | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
| Blasticidine S Hydrochloride (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| Cell Counting Kit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
| CO2 Tegulated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
| Coelenterazine (CTZ) | NanoLight Technology | 479474 | |
| D-luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 119222 | |
| DMEM Medium | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Ti-E/U/S | |
| Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
| Graphics Software | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
| Insulin Syringe Needles | Becton Dickinson | 328421 | |
| Isoflurane | Baxter | 691477H | |
| Lentiviral Packaging System | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | |
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
| Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
| MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
| RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
| SORVALL ST 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
| Ultra-low Temperature Refrigerator | Haier | DW-86L338 | |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | XENOGEN Corporation | 7293 |
References
- Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).
- Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).
- Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).
- Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
- McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).
- Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC. Journal of Clinical Oncology. 26, 17006 (2008).
- Wang, R., et al. Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence. Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).
- Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. Tumor angiogenesis, from foe to friend. Science. 349, 694-695 (2015).
- Zhang, K., et al. Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment. ACS Applied Materials & Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).
- Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. , 70-81 (2017).
- Lee, S., et al. Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis. Cell. 130, 691-703 (2007).
- Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response. Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).
- Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer. Pharmacology & Therapeutics. 164, 152-169 (2016).
- Wong, P. P., et al. Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread. Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).
- Mezzanotte, L., van 't Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications. Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).
- Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy. Biochimie. 116, 43-51 (2015).
- Liu, J., et al. Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).
- Branchini, B. R., et al. Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments. Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).
- McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing "red-shifted" luciferase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571 (2013).
