Summary
Este protocolo describe el establecimiento de un modelo de ratón con tumores para monitorear la progresión tumoral y la angiogénesis en tiempo real mediante imágenes de bioluminiscencia dual.
Abstract
La angiogénesis, como un proceso crucial de progresión tumoral, se ha convertido en un punto crítico de investigación y objetivo de la terapia antitumoral. Sin embargo, no existe un modelo fiable para rastrear la progresión tumoral y la angiogénesis simultáneamente de una manera visual y sensible. Las imágenes de bioluminiscencia muestran su superioridad única en las imágenes vivas debido a sus ventajas de alta sensibilidad, fuerte especificidad y medición precisa. Aquí se presenta un protocolo para establecer un modelo de ratón con tumores mediante la inyección de una línea 4T1 de células de cáncer de mama murina con etiqueta de Renilla luciferasse en el ratón transgénico con expresión de luciferasa de luciérnaga inducida por angiogénesis. Este modelo de ratón proporciona una valiosa herramienta para monitorear simultáneamente la progresión tumoral y la angiogénesis en tiempo real mediante imágenes de bioluminiscencia dual en un solo ratón. Este modelo puede aplicarse ampliamente en la detección de fármacos antitumorales y la investigación oncológica.
Introduction
La angiogénesis es un proceso esencial en la progresión del cáncer de neoplasias pequeñas y localizadas a tumores más grandes y potencialmente metastásicos1,2. La correlación entre el crecimiento tumoral y la angiogénesis se convierte en uno de los puntos de énfasis en el campo de la investigación oncológica. Sin embargo, los métodos tradicionales para medir los cambios morfológicos no monitorean la progresión tumoral y la angiogénesis simultáneamente en animales vivos utilizando un enfoque visualizado.
La imagen de bioluminiscencia (BLI) de las células tumorales es un método experimental particularmente apropiado para controlar el crecimiento tumoral debido a su no invasividad, sensibilidad y especificidad3,4,5,6 . La tecnología BLI se basa en el principio de que la luciferasa puede catalizar la oxidación de un sustrato específico mientras emite bioluminiscencia. La luciferasa expresada en células tumorales implantadas reacciona con el sustrato inyectado, que puede ser detectado por un sistema de imágenes vivo, y las señales reflejan indirectamente los cambios en el número de células o localización celular in vivo6,7.
A excepción del crecimiento tumoral, la angiogénesis tumoral (el paso crítico en la progresión del cáncer) también se puede visualizar a través de la tecnología BLI utilizando ratones transgénicos Vegfr2-Fluc-KI8,9,10. El receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (Vegf), un tipo de receptor Vegf, se expresa principalmente en las células endoteliales vasculares de ratones adultos11. En los ratones transgénicos Vegfr2-Fluc-KI, la secuencia de ADN de La luciérnaga de luciérnaga (Fluc) se golpea en el primer exón de la secuencia endógena Vegfr2. Como resultado, el Fluc se expresa (que aparece como señales BLI) de una manera que es idéntica al nivel de angiogénesis en ratones. Para crecer más allá de unos pocos milímetros de tamaño, el tumor recluta nuevas vasculaturas de los vasos sanguíneos existentes, que expresan altamente el Vegfr2 desencadenado por factores de crecimiento de las células tumorales1. Esto abre la posibilidad de usar ratones transgénicos Vegfr2-Fluc-KI para monitorear no invasivamente la angiogénesis tumoral por BLI.
En este protocolo, se establece un modelo de ratón con tumores para monitorear la progresión tumoral y la angiogénesis en un solo ratón a través de la luciferasa de luciérnaga (Fluc) y la imagen de Renilla luciferase (Rluc), respectivamente (Figura1). Se crea una línea celular 4T1 (4T1-RR) que expresa establemente Rluc y proteína fluorescente roja (RFP) para rastrear el crecimiento celular por imágenes Rluc. Para investigar más a fondo los cambios dinámicos de la angiogénesis en la progresión y regresión del tumor, se crea otra línea celular 4T1 (4T1-RRT) que expresa el virus del herpes simple suicida truncado por timidasquina (HSV-ttk), Rluc y RFP. Mediante la administración de ganciclovir (GCV), las células que expresan el VHS-ttk se ablan selectivamente. Basado en estas líneas celulares, se construye un modelo de portador de tumores en ratones Vegfr2-Fluc-KI que sirve como un modelo experimental que une la progresión tumoral y la angiogénesis tumoral in vivo.
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Protocol
Los experimentos deben cumplir con las regulaciones nacionales e institucionales relativas al uso de animales con fines de investigación. Se deben obtener permisos para llevar a cabo experimentos. El tratamiento de los animales y los procedimientos experimentales del estudio se adhieren a las Directrices del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Nankai que se ajustan a las Directrices para el Cuidado de los Animales aprobadas por los Institutos Nacionales de Salud (NIH).
1. Envases y producciones lentivirales LV-Rluc-RFP (RR) y LV-Rluc-RFP-HSV-ttk (RRT)
NOTA: El pLV-RR lleva las secuencias genéticas de Renilla luciferasa (Rluc) y proteína fluorescente roja (RFP) bajo el promotor EF1, mientras que el pLV-RRT lleva las secuencias genéticas que codifican Rluc, RFP y el virus del herpes simple truncada por timidas quinasa (HSV-ttk) ( Figura 2).
- Semilla 1 x 106 de 293T células por pozo en una placa de 6 pozos y cultivo durante la noche en una incubadora humidificada con 5% co2 a 37 oC con el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS).
- Preparar la suspensión de liposomas: mezclar 7,5 ml de liposoma y 0,25 ml de medio esencial mínimo (MEM) en un tubo de 1,5 ml después de la incubación durante 5 min a temperatura ambiente (RT) para dispersar los liposomas por igual.
- Prepare la solución DNAs (DNAs-RR): por separado, agregue el vector pLV-RR y los plásmidos auxiliares a 0,25 ml de MEM en un tubo de 1,5 ml como se describe en la Tabla1.
- Obtener el liposoma/ DNAs-RR compuesto: añadir suavemente la solución DNAs-RR en liposoma preparado suspensión gota a gota e incubar durante 20 minutos a RT para que el ADN se adhiera a la membrana lipídica.
- Reemplace el medio de las células 293T por 1 ml de DMEM que contenga 10% FBS y agregue suavemente el compuesto liposoma/DNAs-RR al medio de las células 293T.
- Después de incubar en una incubadora humidificada con 5% de CO2 a 37oC durante 12–16 h, sustituya el compuesto liposoma/DNAs-RR que contenga un medio de las células 293T con 1 ml de DMEM que contenga 10% de FBS y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina.
- Continúe el cultivo de las células 293T en la incubadora humidificada durante 48 h después de la transfección. A continuación, recoger el sobrenadante de las células 293T y centrifugar el medio a 300 x g durante 5 minutos para peletizar las células 293T. Transfiera el sobrenadante que contiene el lentivirus-RR (LV-RR) en tubos de almacenamiento de polipropileno estéril de 1,5 ml y guárdelo a -80 oC.
NOTA: Se requiere una instalación de nivel 2 de bioseguridad (BSL-2) para trabajar con lentivirus recombinante. - Repita los pasos 1.1–1.7 y utilice el vector pLV-RRT en lugar del vector pLV-RR en el paso 1.3 para obtener el lentivirus-RRT (LV-RRT). Conservar el LV-RRT a -80oC.
NOTA: El stock lentiviral no purificado puede inhibir el crecimiento celular en algunos casos. Es posible que sea necesario purificar las existencias lentivirales. Las reservas lentivirales que contienen partículas LV-RR o LV-RRT deben dividirse en tubos de 1,5 ml (1 ml por tubo) para su almacenamiento con el fin de evitar múltiples ciclos de descongelación libre.
2. Transducción lentiviral LV-RR y LV-RRT para la expresión génica en células 4T1
- Setransforme las células 4T1 en una placa de 6 pocillos (5 x 105 células/pozo) y el cultivo con medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 que contenga 10% de FBS durante la noche en una incubadora humidificada con 5% de CO2 a 37 oC.
- Retire el medio de la placa de cultivo y reemplácelo por 1 ml de rpm i/m.1 mL medio, así como 1 ml de stock lentiviral (LV-RR o LV-RRT) a cada pocto. Agregue el polibrino de 8 g/ml y mezcle suavemente el medio que contiene partículas lentivirales pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
NOTA: Tenga en cuenta que el medio contiene partículas lentivirales, que podrían transducir las células humanas. - Solución de transducción de giro en una centrífuga a 1.000 g durante 60 minutos a RT para ayudar a aumentar la eficiencia de transducción. Después de la centrifugación, el cultivo de células 4T1 durante 4-12 h y mantener en una incubadora humidificada con 5% de CO2 a 37 oC.
NOTA: Para algunas líneas celulares, el polibrino puede ser tóxico para el cultivo a largo plazo. Por lo tanto, el tiempo de incubación para transducir diferentes células puede ser cambiante. Compruebe el estado de la celda varias veces para encontrar el tiempo de incubación adecuado. - Refresque el medio de las células 4T1 transducidas con 2 ml de medio RPMI 1640 que contiene 10% FBS y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina para eliminar partículas lentivirales y polibrino.
3. Examen e identificación de drogas de células 4T1 transducidas por LV-RR y LV-RRT
- Seleccione células transducidas con medio que contenga blasticidina (BSD) de acuerdo con el gen de resistencia BSD transportado por LV-RR o LV-RRT como se describen en los siguientes pasos.
NOTA: Alternativamente, las células transducidas que son RFP-positivas podrían ser seleccionadas por citometría de flujo de acuerdo con el gen RFP transportado por LV-RR o LV-RRT. - 48 h después de la transducción, paso de células 4T1 en la proporción de 1:3 a 1:4 con medio de selección (medio RPMI 1640 que contiene 10% FBS, 100 U/ml penicilina-estreptomicina, y 5 g/ml DE BSD). Cambie el medio cada 2 o 3 días.
NOTA: La concentración óptima de BSD puede variar de una línea de celda a una línea celular. Por lo tanto, se debe realizar un experimento piloto de curva de muerte para determinar la concentración óptima de BSD antes del experimento inicial. - 7 días después de la detección de fármacos, observe las células 4T1 transducidas por LV-RR (4T1-RR) y las células 4T1 transducidas por LV-RRT (4T1-RRT) bajo el microscopio de contraste de fase invertido por fluorescencia. Cuente el número de celdas RFP+ 4T1 y todas las celdas 4T1 en tres campos de visión para estimar la relación RFP-positiva, respectivamente (Figura2).
NOTA: Alternativamente, la relación RFP-positiva de las células 4T1 transducidas podría identificarse mediante citometría de flujo. - Mida las señales de renilla de las células 4T1-RR y las células 4T1-RRT utilizando un sistema de imágenes vivo para detectar la relación lineal entre los números de celda y las señales de renilla (Figura3).
- Expanda las células 4T1-RR y 4T1-RRT con pantalla BSD 4T1-RR y 4T1-RRT con medio de selección en relaciones de división entre 1:3 y 1:4 y almacene las existencias de línea celular en nitrógeno líquido.
4. Ratones Vegfr2-Fluc-KI y modelo de ratón con tumores
NOTA: Los ratones transgénicos Vegfr2-Fluc-KI, de 6 a 8 semanas de edad y hembras, se utilizan en este experimento para monitorear no invasivamente la angiogénesis in vivo por BLI.
- Células 4T1-RR de cultivo y células 4T1-RRT en platos Petri de 60 mm en una incubadora humidificada con 5% deCO2 a 37oC, respectivamente. Cuando las células estén al 80% de confluencia, retire el medio y enjuague con solución salina tamponada de fosfato (PBS).
- Retire el PBS y agregue 2 mL adicionales de 0.25% trypsin-0.53 mM EDTA solución respectivamente. Mantenga el plato a RT (o a 37 oC) hasta que las células se sequen.
- Agregue 5-10 ml de medio fresco que contenga 10% FBS, luego aspire y dispensará células para resuspender las células 4T1-RR y 4T1-RRT en tubos centrífugos de 15 ml, respectivamente. Cuente dos tipos de células 4T1 usando una cámara de conteo y prepare las suspensiones celulares a una concentración de 1 x 106 por 100 l en medio RPMI 1640.
- Anestetizar los ratones Vegfr2-Fluc-KI con 1%-3% de isoflurano en oxígeno 100% en la cámara de inducción de anestesia con un caudal de 1 L/min. Monitorear la respuesta de pellizcar del dedo del pie del ratón para confirmar el estado de la anestesia. Luego, aplica pomada oftálmica a los ojos del ratón para prevenir la deshidratación.
- Retire el ratón de la cámara y la posición en nosecone. Retire por completo el pelo del hombro del ratón mediante el uso de la afeitadora eléctrica y la crema de depilación, lo que podría proporcionar una buena vista del campo quirúrgico y evitar bloquear las señales BLI en los experimentos de seguimiento.
- Inyecte subcutáneamente células 4T1-RR (1 x 106 células a un volumen total de 100 ol) y células 4T1-RRT (1 x 106 celdas a un volumen total de 100 l) en los hombros izquierdo y derecho de cada ratón, respectivamente (registro como día 0). Coloque los ratones en el área de recuperación con soporte térmico hasta que estén completamente recuperados.
- Después de la implantación de las células 4T1-RR y 4T1-RRT, toque las masas tumorales para comprobar que los ratones son portadores de tumores todos los días (FiguraS1). En el día 7 después de la implantación, inyectar por vía intraperitoneal 50 mg/kg de ganciclovir (GCV) a los ratones portadores de tumores dos veces al día hasta el final del experimento.
NOTA: Antes de este experimento, se debe detectar el citotóxico de GCV en células 4T1-RRT. La eficiencia de matanza de GCV podría evaluarse mediante el ensayo de recuento celular con diferente concentración de GCV (FiguraS2). - En los días 0, 3, 7, 14 y 21 después de la implantación 4T1, controlar el crecimiento tumoral y la angiogénesis de ratones portadores de tumores y evaluar por imágenes Rluc y Fluc (Figura4).
5. Imagen de bioluminiscencia dual del tumor (Rluc) y la angiogénesis (Fluc)
- Abra el sistema de imágenes vivas, inicialice el software de imágenes vivo y, a continuación, inicialice el sistema.
NOTA: La inicialización del sistema tardará unos minutos en enfriar la cámara del dispositivo acoplado a carga (CCD) a -90 oC antes de poder iniciar la creación de imágenes. La temperatura se volverá verde cuando se enfríe la cámara CCD. - Utilice los siguientes ajustes de cámara:
Compruebe la Luminiscencia y fotografía.
Compruebe Superposición.
Ajustes de luminiscencia:
El tiempo de exposición establece AUTO en condiciones normales.
Binning se establece en 8.
F/Stop se establece en 1.
Conjuntos de filtros de emisión Abiertos.
Ajustes de fotografía:
Binning se establece en medio.
F/Stop se establece en 8.
Configuración del sistema IVIS:
Campo de visión: Vista del ratón C-1, Vista de ratones D-5.
La altura del sujeto establece 1,5 cm. - Pesar y registrar los ratones y calcular el volumen de coelenterazina (CTZ; 2,5 mg/kg) y D-luciferina (150 mg/kg) necesarios.
- Anestetiza el ratón portador de tumores en 1%–3% de isoflurano en oxígeno 100% en la cámara de inducción de anestesia con un caudal de 1 L/min. Monitoree la respuesta de pellizcar del dedo del pie del ratón para confirmar el estado de la anestesia. Luego, dispensar una gota de pomada lubrial en ambos ojos para evitar daños corneales.
- Inyectar 2,5 mg de CTZ (3,33 mg/ml) por kilogramo de peso corporal en el retrobulbar del ratón (por ejemplo, para un ratón de 20 g, inyectar 15 ml para administrar 50 g de CTZ) utilizando una aguja de jeringa de insulina.
- Mueva el ratón portador de tumores a la cámara de la cámara con su nariz en el cono de anestesia suavemente y adquiera varias imágenes de la dorsal del ratón inmediatamente para obtener las señales Rluc de las células 4T1 hasta que las señales BLI se desvanezcan.
NOTA: La vida media de CTZ es muy corta y las señales de Rluc caen precipitadamente 30 s. Para garantizar que cualquier señal Rluc residual se haya disipado y que el intervalo entre las imágenes Rluc y Fluc sea superior a 10 minutos. - Inyecte por vía intraperitoneal 150 mg/kg de D-luciferina (30 mg/ml) utilizando una aguja de jeringa de insulina (por ejemplo, para un ratón de 20 g, inyecte 100 ml para administrar 3 mg de D-luciferina). Mantenga el ratón en RT durante 10 minutos antes de la toma de imágenes de Fluc.
- Mueva este ratón a la cámara de la cámara con la nariz en el cono de anestesia de nuevo y adquiera varias imágenes de la dorsal del ratón para obtener las señales Fluc de la angiogénesis.
NOTA: El monitor cinético Fluc debe realizarse para cada ratón hasta que las señales alcancen el máximo y luego se desvanezcan. - Repita los procedimientos 5.4–5.8 para cada ratón.
- Después de la toma de imágenes, mantenga a los ratones en un ambiente cálido hasta que los animales despierten.
- En el punto de tiempo deseado (día 3, 7, 14 y 21), repita los procedimientos anteriores (paso 5.3–5.10) para detectar la progresión tumoral y la angiogénesis tumoral con el tiempo.
- Analizar los datos de señales Rluc y Fluc para investigar la relación entre el crecimiento tumoral y la angiogénesis en la progresión tumoral.
NOTA: Las regiones de interés (ROI) que cubren el sitio de la señal BLI se utilizan para analizar los datos. Mida el resplandor total (fotones) del ROI en la unidad de fotones/segundos/cm2/steradian (p/s/cm2/sr) para cada punto de tiempo. - Analice las señales Rluc y Fluc del ROI utilizando el software gráfico (Figura4).
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Representative Results
En este experimento, se estableció un modelo de ratón de cáncer de mama utilizando células 4T1 para investigar la relación entre el crecimiento tumoral y la angiogénesis tumoral (Figura 1). En primer lugar, se empaquetaron dos lentivirus, que llevaban secuencias genéticas que expresaban Rluc/RFP (LV-RR) y Rluc/RFP/HSV-ttk (LV-RRT), respectivamente, como se informó anteriormente7. Luego, dos líneas celulares 4T1 diferentes, llamadas 4T1-RR y 4T1-RRT, fueron creadas transduciendo LV-RR y LV-RRT respectivamente. Después de la detección de drogas durante 3 días, el 4T1-RR y el 4T1-RRT se observaron bajo un microscopio de fluorescencia para detectar la eficiencia de transducción. Como se muestra en las imágenes de fluorescencia, más del 99% de las células 4T1-RR o 4T1-RRT fueron RFP positivas, lo que sugirió que las líneas celulares 4T1-RR y 4T1-RRT fueron establecidas por transducción LV-RR y LV-RRT (Figura2A,B). Mientras tanto, no se encontraron diferencias en la morfología celular y el crecimiento entre el tipo salvaje 4T1 y 4T1-RR o 4T1-RRT durante el tiempo de cultivo. En resumen, construimos con éxito líneas celulares 4T1-RR y 4T1-RRT sin influir en los estados celulares. Posteriormente, se capturaron imágenes de bioluminiscencia (BLI) de células 4T1-RR y 4T1-RRT para detectar las señales Rluc. Las imágenes BLI revelaron que las células 4T1-RR y 4T1-RRT emitían señales bioluminiscentes fuertes de la misma fuerza (Figura3A). Además, se observaron las relaciones lineales entre las señales de Rluc y los números de células tanto en las células 4T1-RR (R2 a 0.9974) como en las células 4T1-RRT (R2 a 0,9989), lo que sugería que las señales Rluc podrían utilizarse para reflejar el crecimiento tumoral in vivo (Figura3B) ).
Sobre esta base, utilizando los ratones transgénicos Vegfr2-Fluc-KI, se estableció un modelo de ratón con tumores para investigar la angiogénesis a medida que crece el cáncer de mama. Como resultado de golpear la secuencia de Fluc en el primer exón de la secuencia Vegfr2 en murino, el Fluc fue expresado (que aparece como señales bioluminiscentes) de una manera idéntica a la angiogénesis en ratones durante la progresión del tumor. Después de la inyección subcutánea de células 4T1-RR y 4T1-RRT, el crecimiento celular fue monitoreado por señales Rluc en presencia de CTZ en los días 0, 3, 7, 14 y 21 (Figura4A). Al mismo tiempo, la angiogénesis inducida por el crecimiento tumoral fue evaluada por señales Fluc en presencia de D-luciferina en el mismo ratón. En el día 7 después de la implantación de 4T1-RR y 4T1-RRT, gCV se administró a los ratones portadores de tumores, lo que llevó a las células 4T1-RRT a morir. Las imágenes BLI revelaron que las señales Rluc de las células 4T1-RR y 4T1-RRT aumentaron a la misma velocidad antes del tratamiento con GCV; sin embargo, las señales Rluc de células 4T1-RRT disminuyeron bruscamente el tratamiento post GCV. mientras que las señales Rluc de 4T1-RR todavía aumentaba suavemente. Obviamente, existía una relatividad significativa entre las señales Rluc y el tamaño del tumor (FiguraS1).
Mientras tanto, según las imágenes de Fluc, las señales de Fluc aumentaron de acuerdo con el aumento de Rluc y disminuyeron tras la disminución de Rluc (Figura4B). Estos resultados sugieren que hubo una correlación directa entre la angiogénesis tumoral y el crecimiento tumoral. La muerte de las células tumorales inducidas por el fármaco GCV puede conducir a la inhibición de la angiogénesis tumoral (Figura4C). Para demostrar que la señal de Fluc estaba detectando la angiogénesis dentro de los tumores, los animales fueron sacrificados después de terminar la toma de imágenes en el día 21 para obtener evidencia histológica de vasculatura. Según las imágenes de inmunomancha anti-VEGFR2, las estructuras microvasculares en el tejido tumoral 4T1-RR fueron significativamente más evidentes que en el tejido tumoral 4T1-RRT, que eran consistentes con las señales Fluc (Figura5). En resumen, esta estrategia de imágenes de bioluminiscencia dual se puede utilizar para monitorear la progresión tumoral y la angiogénesis, así como evaluar los efectos antitumorales de diferentes fármacos en el crecimiento tumoral y la angiogénesis en el microambiente tumoral.
Figura 1: Mapa esquemático de imágenes de bioluminiscencia dual del crecimiento tumoral y la angiogénesis. Las células 4T1 transducidas por LV-RR y LV-RRT se implantaron en ratones transgénicos Vegfr2-Fluc-KI. Durante el crecimiento del tumor, BLI de Rluc y Fluc se realizaron simultáneamente en un solo ratón para reflejar el crecimiento tumoral y el estado de la angiogénesis, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Eficiencia de transducción de células 4T1-RR y 4T1-RRT identificadas por imágenes por fluorescencia. (A) El dibujo esgráfico de pLV-RR mostró que las secuencias Rluc y RFP se expresaban bajo el promotor EF1. Las imágenes brillantes y fluorescentes de un campo de visión revelaron que las células 4T1-RR eran RFP-positivas. (B) El diagrama de diagrama de pLV-RRT mostró que el único promotor EF1 activó los genes Rluc, RFP y HSV-ttk. Las imágenes brillantes y fluorescentes de un campo de visión revelaron que las células 4T1-RRT eran rFP positivas. Barra de escala a 200 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes de bioluminiscencia de células transducidas 4T1-RR y 4T1-RRT. (A) Imágenes de bioluminiscencia de células 4T1-RR y 4T1-RRT en presencia de CTZ. (B) Las señales Rluc medidas de las células 4T1-RR y 4T1-RRT mantuvieron una relación lineal con los números de celda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Visualización de los procesos dinámicos de crecimiento tumoral y angiogénesis en un animal vivo. (A) Diagrama de flujo del experimento y detección de BLI dual de Rluc y Fluc. (B) Imágenes representativas de Rluc de progresión tumoral e imágenes fluc de angiogénesis durante el desarrollo tumoral en un ratón transgénico. (C) La medición de las señales de Rluc demostró que las células tumorales implantadas crecieron rápidamente, mientras que las células 4T1-RRT se retrocedieron significativamente después de la administración del GCV. (D) La cuantificación de las señales de Fluc mostró que la angiogénesis se produjo después de la implantación de las células tumorales, siguiendo una tendencia paralela con el crecimiento tumoral y la muerte inducida por GCV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Inmunomanchación VEGFR2 de los tejidos 4T1-RR y 4T1-RRT en el día 21. Imágenes representativas de las secciones de tejidos tumorales manchadas para VEGFR2 (verde) en el día 21. Los núcleos fueron contramanchados con DAPI (azul). Barra de escala a 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura S1: Curva del tamaño del tumor durante la progresión del tumor in vivo. El tamaño del tumor de las células 4T1-RR y 4T1-RRT aumentó después de la implantación, pero el tamaño del tumor de las células 4T1-RRT comenzó a disminuir el tratamiento post-GCV. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura S2: Efecto citotóxico del GCV en células 4T1-RRT. Las células 4T1-RRT murieron con la concentración elevada de GCV. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura S3: Imagen BLI de células 4T1-RR en el pulmón. Después de la inyección de la vena de cola de las células 4T1-RR, la señal Rluc de las células fue detectada por BLI. Haga clic aquí para descargar este archivo.
| Condiciones de envasado LV-RR y LV-RRT | |||
| Componentes | Medio MEM | Sistema de 3 plásmidos | Sistema de 4 plásmidos |
| vector pLV-RR/pLV-RRTA | 0,25 ml | 1.5 g | 1.5 g |
| Gag-Pol + Rev vector de expresiónB | 1.0 g | ||
| Vector de expresión Gag-PolC | 0,75 g | ||
| Vector de expresión de revolucionesD | 0,3 g | ||
| Vector de expresión VSV-GE | 0,5 g | 0,45 g | |
| Liposoma | 0,25 ml | 7,5 l | 7,5 l |
Tabla 1: Condiciones de transfección del sistema de envasado lentiviral para la producción de reservas virales LV-RR y LV-RRT en células 293T. (A) El vector pLV-cDNA fue pLV-RR y pLV-RRT, respectivamente. (B) El vector de expresión Gag-Pol + Rev puede ser pCMV-deltaR8.91 (TRC) o psPAX2 (Addgene). (C) El vector de expresión Gag-Pol puede seleccionar cualquiera de pMDLg/pRRE (Addgene), pLP1 (Invitrogen) y pPACKH1-GAG (SBI). (D) El vector de expresión Rev debe ser pRSV-REV (Addgene), pLP2 (Invitrogen) o pPACKH1-REV (SBI). (E) el vector de expresión VSV-G puede seleccionar pMD.G (TRC), pMD2.G (Addgene), pCMV-VSV-G (Addgene), pVSV-G (SBI) o pLP/VSVG (Invitrogen). En este protocolo, se utilizó el sistema de tres plásmidos, incluyendo psPAX2, pMD2.G, y pLV-RR o pLV-RRT.
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Discussion
En este protocolo, se describe un enfoque de BLI dual no invasivo para monitorear el desarrollo tumoral y la angiogénesis. El sistema de reporteros bli se desarrolla por primera vez, que contiene el gen suicida HSV-ttk/GCV para rastrear la progresión del tumor y la regresión in vivo por imágenes Rluc. Mientras tanto, la angiogénesis tumoral se evalúa utilizando ratones Vegfr2-Fluc-KI a través de imágenes de Fluc. Este modelo de ratón con tumores es capaz de proporcionar una plataforma práctica para el desarrollo continuo y no invasivo del tumor y la angiogénesis tumoral mediante un doble BLI en un solo ratón con alta relevancia, reproducibilidad y traducibilidad.
La angiogénesis se refiere a la progresión tumoral a largo plazo y, por lo tanto, es de gran importancia1. Es necesario estudiar la relación entre la progresión tumoral y la angiogénesis. Se ha investigado un número cada vez mayor de estrategias anti-angiogénesis para el tratamiento del cáncer, que se basan en enfoques de monitor visualizados para evaluar con precisión los resultados del tratamiento. Además, la neovascularización del tejido tumoral después de la radioterapia tradicional y la quimioterapia es otra área popular de la investigación oncológica12,13,14. Estos estudios requieren un modelo animal que permita el seguimiento del crecimiento tumoral y la angiogénesis en tiempo real. Los cambios patológicos de los tejidos tumorales en los modelos animales tradicionales suelen depender del examen histopatológico, que requiere sacrificio animal. Estos modelos de ratón BLI duales ayudan a abordar los problemas de rangos de error más grandes y mayores costos del sacrificio de animales.
En este modelo de ratón BLI dual, el paso más crítico es el uso de dos tipos de luciferasas, incluyendo Fluc y Rluc, para rastrear respectivamente células y angiogénesis al mismo tiempo. La especificidad del sustrato de estas dos luciferasas permite realizar dos tipos de BLI en un solo host. Además, la vida media de la coelenterazina (el sustrato de Rluc) es muy corta, lo que hace que las señales Rluc se desvanezquen rápidamente sin influir en la próxima detección de señal Fluc15. Por lo tanto, en el proceso de operación, la imagen De Rluc debe implementarse antes de la toma de imágenes fluc debido a la vida media más larga de D-luciferin (el sustrato de Fluc). Además, averiguar el tiempo de incubación de los sustratos es la clave para adquirir imágenes BLI perfectas. El metabolismo de los sustratos puede cambiar la concentración de sustratos in vivo, lo que conduce a la variación en la intensidad de la señal BLI.
Además de los avances tecnológicos, se han aplicado otras modalidades de diagnóstico por imágenes para el seguimiento in vivo de ciertos eventos celulares y subcelulares en investigaciones preclínicas y clínicas, como imágenes fluorescentes, imágenes por resonancia magnética (RM) y positrones tomografía por emisión (PET)16,17. En comparación con estas estrategias de imagen, la imagen de bioluminiscencia tiene alta sensibilidad, fuerte especificidad y medición precisa, mostrando su superioridad única en el campo de los estudios de imágenes vivas15. La toma de imágenes DeRluc empleada permite visualizar dinámicamente el crecimiento tumoral y los efectos antitumorales del sistema profármaco HSV-ttk/GCV en un animal vivo. Excepto para monitorear los tejidos subcutáneos, Rluc se ha utilizado para rastrear células en los pulmones por la tecnología BLI en otras investigaciones. Después de la inyección de la vena de cola de 4T1-RR en un ratón, hemos movido este ratón en el sistema de imágenes vivas para detectar las señales Rluc después de la administración de CTZ. La imagen de la señal Rluc mostró que las células inyectadas se encontraban principalmente en el pulmón (FiguraS3). Como se mencionó anteriormente, el gen del informe Rluc puede rastrear varias células cancerosas en diferentes lugares, lo que fomenta la utilización completa de este modelo de ratón en la investigación de la biología del cáncer.
Además de estas ventajas, la tecnología BLI se puede utilizar para detectar los niveles de expresión de moléculas específicas. Anteriormente, los genes de reportero de fluoróforos, que se expresan bajo los promotores pertinentes, se han utilizado para medir el desarrollo de los vasos en tumores subcutáneos. Durante la progresión del tumor, la estructura vascular y las moléculas se pueden observar a través de las cámaras de ventana implantadas quirúrgicamente en ratones. Sin embargo, este método todavía tiene limitaciones, incluyendo invasión inevitable, enfriamiento de fluoróforo y ruido de fondo fuerte. El modelo de ratón con tumores establecido en el ratón Vegfr2-Fluc-KI crea una observación no invasiva del nivel de expresión de Vegfr2, que es la molécula más importante en la angiogénesis tumoral. Mientras tanto, las imágenes BLI muestran una gran especificidad sin ruido. El modelo de ratón BLI dual puede tener aplicaciones más amplias en el estudio de los mecanismos moleculares potenciales en la progresión y regresión tumoral.
La tecnología BLI, basada en la expresión de Rluc (emisión 480 nm) y Fluc (emisión 562 nm), se ha adoptado en varios modelos de enfermedad in vivo. El uso generalizado de la tecnología BLI in vivo ha sido restringido debido a la baja sensibilidad de la bioluminiscencia a longitudes de onda inferiores a 600 nm en la detección de tejido profundo. Esto es causado por la absorción y dispersión de la luz, que disminuye la señal detectable hasta diez veces por centímetro de tejido. Para abordar esta pregunta, algunos investigadores han centrado los estudios en las variantes de emisor rojo de Fluc que emiten luz por encima de 600 nm18. Debido a que la absorción y dispersión de la luz se puede reducir notablemente mediante el uso de estas variantes de Fluc18,19, las aplicaciones de las variantes de luciferasa extenderán este protocolo a un campo más grande de investigación oncológica.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el Programa Nacional Clave de I+D de China (2017YFA0103200), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81671734), y los Proyectos Clave del Programa de Apoyo a la Ciencia y Tecnología de Tianjin (18YFZCSY00010), Fondos De Investigación universidades centrales (63191155). Reconocemos las revisiones de Gloria Nance, que fueron valiosas para mejorar la calidad de nuestro manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 1.5 mL Tubes | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
| 15 mL Tubes | Corning Glass Works | 601052-50 | |
| 293T | ATCC | CRL-3216 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
| 6-well Plate | Corning Glass Works | 3516 | |
| Biosafety Cabinet | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
| Blasticidine S Hydrochloride (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| Cell Counting Kit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
| CO2 Tegulated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
| Coelenterazine (CTZ) | NanoLight Technology | 479474 | |
| D-luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 119222 | |
| DMEM Medium | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Ti-E/U/S | |
| Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
| Graphics Software | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
| Insulin Syringe Needles | Becton Dickinson | 328421 | |
| Isoflurane | Baxter | 691477H | |
| Lentiviral Packaging System | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | |
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
| Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
| MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
| RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
| SORVALL ST 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
| Ultra-low Temperature Refrigerator | Haier | DW-86L338 | |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | XENOGEN Corporation | 7293 |
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