Denne protokollen beskriver etablering av en tumor-bærende mus modell for å overvåke tumorprogresjon og angiogenese i sanntid av dual bioluminesens Imaging.
Angiogenese, som en viktig prosess med tumorprogresjon, har blitt et forsknings-hotspot og mål for anti-tumor terapi. Det er imidlertid ingen pålitelig modell for sporing tumorprogresjon og angiogenese samtidig i en visuell og følsom måte. Bioluminesens Imaging viser sin unike overlegenhet i levende Imaging på grunn av sine fordeler med høy følsomhet, sterk spesifisitet, og nøyaktig måling. Presentert her er en protokoll for å etablere en tumor-bærende mus modell ved å injisere en Renilla luciferase-merket murine brystkreft cellelinje 4T1 i transgene mus med Angiogenese-indusert Firefly luciferase uttrykk. Denne musen modell skaffer en kostbar verktøyet å samtidig dataskjerm svulst progresjon og angiogenese inne virkelig-tid av dobbelt bioluminesens tenkelig inne en enkelt musen. Denne modellen kan bli mye brukt i anti-tumor narkotika screening og onkologi forskning.
Angiogenese er en viktig prosess i utviklingen av kreft fra små, lokaliserte svulster til større, potensielt metastatisk svulster1,2. Sammenhengen mellom tumor vekst og angiogenese blir en av punktene i vekt på feltet av onkologi forskning. Men tradisjonelle metoder for å måle morfologiske endringer mislykkes i å overvåke tumorprogresjon og angiogenese samtidig i levende dyr ved hjelp av en visualisere tilnærming.
Bioluminesens Imaging (bli) av tumorceller er en spesielt hensiktsmessig eksperimentell metode for å overvåke tumor vekst på grunn av sin ikke-invasiveness, følsomhet, og spesifisitet3,4,5,6 . BLI-teknologi er basert på prinsippet om at luciferase kan katalysere oksidasjon av et bestemt substrat mens emitting bioluminesens. Luciferase uttrykt i implantert tumorceller reagerer med injisert substrat, som kan oppdages av en levende Imaging system, og signaler indirekte reflekterer endringene i celle nummer eller celle lokalisering i vivo6,7.
Med unntak av tumor vekst, kan tumor angiogenese (det kritiske trinnet i kreft progresjon) også bli visualisere gjennom bli-teknologi ved hjelp av Vegfr2-svingninger-KI transgene Mouse8,9,10. Den vaskulære endothelial vekstfaktor (Vegf) reseptor 2 (Vegfr2), en type Vegf reseptor, er stort sett uttrykt i den vaskulære endothelial celler av voksne mus11. I Vegfr2-svingninger-KI transgene mus blir DNA-sekvensen av Firefly luciferase (svingninger) slått inn i den første ekson av den endogene Vegfr2 sekvensen. Som et resultat, svingninger uttrykkes (som vises som BLI-signaler) på en måte som er identisk med nivået av angiogenese i mus. Å vokse utover noen få millimeter i størrelse, den tumor rekrutterer nye vasculatures fra eksisterende blodårer, som svært uttrykker Vegfr2 utløst av vekstfaktorer fra tumorceller1. Dette åpner muligheten for å bruke Vegfr2-svingninger-KI transgene mus til ikke-invasivt overvåke tumor angiogenese av BLI.
I denne protokollen, er en tumor-bærende mus modell etablert for å overvåke tumorprogresjon og angiogenese i en enkelt mus gjennom Firefly luciferase (svingninger) og Renilla luciferase (Rluc) Imaging, henholdsvis (figur 1). En 4T1 cellelinje (4T1-RR) er opprettet som stabilt uttrykker Rluc og rødt fluorescerende protein (RFP) å spore cellevekst ved Rluc Imaging. For ytterligere å undersøke dynamiske endringer av angiogenese i progresjon og regresjon av svulsten, en annen 4T1 cellelinje (4T1-RRT) er opprettet som uttrykker selvmords genet herpes simplex virus avkortet tymidin kinase (HSV-TTK), Rluc, og RFP. Ved administrering av ganciklovir (GCV), HSV-TTK uttrykker celler er selektivt ablated. Basert på disse cellelinjer, en svulst-bærende modell i Vegfr2-svingninger-KI mus er bygget som fungerer som en eksperimentell modell bygge bro tumorprogresjon og tumor angiogenese in vivo.
I denne protokollen er en ikke-invasiv dual BLI-tilnærming beskrevet for overvåking av tumor utvikling og angiogenese. BLI reporter systemet er først utviklet, som inneholder HSV-TTK/GCV selvmords genet for sporing av tumorprogresjon og regresjon i vivo av Rluc Imaging. I mellomtiden er tumor angiogenese vurderes ved hjelp av Vegfr2-svingninger-KI mus via svingninger Imaging. Denne svulst bærende musen modellen er i stand til å gi en praktisk plattform for kontinuerlig og ikke-invasiv sporing tumor utvikling og tumo…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av National Key R & D-programmet i Kina (2017YFA0103200), National Natural Science Foundation i Kina (81671734), og viktige prosjekter i Tianjin Science and Technology Support program (18YFZCSY00010), grunnleggende Research Funds for de sentrale universitetene (63191155). Vi anerkjenner Gloria vedlikeholds revisjoner, som var verdifulle i å forbedre kvaliteten på manuskriptet vårt.
0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
1.5 mL Tubes | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
15 mL Tubes | Corning Glass Works | 601052-50 | |
293T | ATCC | CRL-3216 | |
4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
6-well Plate | Corning Glass Works | 3516 | |
Biosafety Cabinet | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
Blasticidine S Hydrochloride (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
Cell Counting Kit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
CO2 Tegulated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
Coelenterazine (CTZ) | NanoLight Technology | 479474 | |
D-luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 119222 | |
DMEM Medium | Gibco | C11995500BT | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
Fluorescence Microscope | Nikon | Ti-E/U/S | |
Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
Graphics Software | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
Insulin Syringe Needles | Becton Dickinson | 328421 | |
Isoflurane | Baxter | 691477H | |
Lentiviral Packaging System | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
Liposome | Invitrogen | 11668019 | |
Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
SORVALL ST 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
Ultra-low Temperature Refrigerator | Haier | DW-86L338 | |
XGI-8 Gas Anesthesia System | XENOGEN Corporation | 7293 |