Tümör Ilerlemesi ve anjiyogenezinin çift Bioluminescence görüntülenmesi
Summary
Bu protokol, Çift Bioluminesans görüntüleme ile tümör ilerlemesini ve anjiyogenezi gerçek zamanlı olarak izlemek için tümör taşıyan bir fare modelinin kurulması açıklanmaktadır.
Abstract
Anjiyogenezi, tümör ilerlemesinin önemli bir süreci olarak, anti-tümör tedavisinin bir araştırma Hotspot ve hedef haline gelmiştir. Ancak, görsel ve hassas bir şekilde aynı anda tümör ilerlemesi ve anjiyogenezi izlemek için güvenilir bir model yoktur. Bioluminescence görüntüleme, yüksek hassasiyet, güçlü özgüllük ve doğru ölçüm avantajları nedeniyle canlı görüntülemede benzersiz üstünlüğü gösterir. Burada sunulan, anjiyojenez kaynaklı Firefly Lusiferaz ifadesi ile transgenik fare içine Renilla Lusiferaz etiketli murine meme kanseri hücre hattı 4t1 enjekte ederek bir tümör taşıyan fare modeli kurmak için bir protokoldür. Bu fare modeli, tek bir fare içinde çift biyolüminesans görüntüleme tarafından gerçek zamanlı olarak tümör ilerlemesi ve anjiyogenezi aynı anda izlemek için değerli bir araç sağlar. Bu model yaygın anti-tümör ilaç taraması ve onkoloji araştırması uygulanabilir.
Introduction
Angiogenesis, küçük, lokalize neoplazmların daha büyük, potansiyel metastatik tümörlerden1,2‘ ye kadar kanserin ilerlemesini temel bir süreçtir. Tümör büyüme ve anjiyojenez arasındaki korelasyon Onkoloji araştırması alanında vurgu noktalarından biri haline gelir. Ancak, morfolojik değişikliklerin ölçülmesi için geleneksel yöntemler, görsel bir yaklaşım kullanarak yaşayan hayvanlarda tümör ilerlemesini ve anjiyogenezi aynı anda izlemez.
Tümör hücrelerinde biyoluminesans görüntüleme (Bli), invaziv olmayan, duyarlılık ve özgüllüğü nedeniyle tümör büyümesini izlemek için özellikle uygun bir deneysel yöntemdir3,4,5,6 . Bli teknolojisi, Lusiferaz ‘ın biyoluminesans yayan belirli bir substrat oksidasyonunu katalizleştirebilmesine temel alınarak tasarlanmıştır. İmplante edilen tümör hücrelerinde ifade edilen Lusiferaz, yaşayan bir görüntüleme sistemi tarafından tespit edilebilen enjekte edilmiş substrat ile tepki verir ve sinyaller, vivo6,7‘ deki hücre numarası veya hücre lokalizasyonunda yapılan değişiklikleri dolaylı olarak yansıtır.
Tümör büyümesi dışında, tümör anjiyogenezi (kanser progresyonunda kritik adım) Vegfr2-Fluc-kı transjenik fareler kullanarak Bli teknolojisi ile görselleştirilebilir8,9,10. Vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) reseptör 2 (Vegfr2), bir tür VEGF reseptörü, çoğunlukla yetişkin farelerin vasküler endotel hücrelerinde ifade edilir11. Vegfr2-Fluc-kı transjenik fareler, Firefly Lusiferaz (Fluc) DNA dizisi endojen Vegfr2 dizisinin ilk eXoN içine çarptı. Sonuç olarak, Fluc farelerde anjiyogenez düzeyine benzer bir şekilde (BLı sinyalleri olarak görünür) ifade edilir. Büyüklüğü birkaç milimetre ötesinde büyümek için, tümör mevcut kan damarlarından yeni vasculatures acemi, hangi son derece tümör hücrelerinden büyüme faktörleri tarafından tetiklenen Vegfr2 ifade1. Bu Vegfr2-Fluc-KI transjenik fareler kullanarak olasılığı açar-invazif BLı tarafından tümör anjiyojenezi izlemek.
Bu protokolde, sırasıyla Firefly Lusiferaz (Fluc) ve Renilla Lusiferaz (rluc) görüntüleme ile tek bir fare içinde tümör ilerlemesi ve anjiyojenezi izlemek için bir tümör taşıyan fare modeli kurulmuştur (Şekil 1). Bir 4T1 hücre hattı (4T1-RR), rluc ve kırmızı floresan proteini (RFP) r-görüntüleme ile hücre büyümesini takip etmek için stabil bir şekilde ifade eden oluşturulur. Tümör progresyon ve regresyon anjiyojenik dinamik değişiklikleri daha fazla araştırmak için, başka bir 4T1 hücre hattı (4T1-RRT) intihar gen herpes simpleks virüs kesilmiş tirosin kinaz ifade oluşturulur (HSV-TTK), Rluc, ve RFP. Gansiklovir (GCV) yönetimiyle, hücreleri ifade eden HSV-TTK seçici olarak ablasyona aittir. Bu hücre hatlarına dayanarak, Vegfr2-Fluc-KI farelerinde tümör taşıyan bir model, tümör progresyonu ve tümör anjiyogenezi içinde vivo olarak deneysel bir model olarak hizmet vermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde, tümör gelişimi ve anjiyogenezi izlemek için invaziv olmayan çift BLı yaklaşımı açıklanmıştır. BLı muhabiri sistemi ilk olarak HSV-TTK/GCV intihar geni ve Rluc görüntüleme tarafından tümör progresyonu ve regresyon in vivo takip için içerir geliştirilmiştir. Bu arada, tümör anjiyojenezi Fluc görüntüleme yoluyla Vegfr2-Fluc-KI fareler kullanılarak değerlendirilir. Bu tümör taşıyan fare modeli, sürekli ve non-invaziv izleme tümörü gelişimi için pratik bir platform ve y…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Çin Ulusal anahtar R & D programı (2017YFA0103200), Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (81671734) ve Tianjin bilim ve teknoloji destek programı (18YFZCSY00010) anahtar projeleri, temel araştırma fonları tarafından desteklenmektedir Merkezi üniversiteler (63191155). Biz Gloria Nance ‘s revizyonlar, bizim el yazması kalitesini iyileştirmek için değerli olduğunu kabul ediyoruz.
Materials
| 0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 1.5 mL Tubes | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
| 15 mL Tubes | Corning Glass Works | 601052-50 | |
| 293T | ATCC | CRL-3216 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
| 6-well Plate | Corning Glass Works | 3516 | |
| Biosafety Cabinet | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
| Blasticidine S Hydrochloride (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| Cell Counting Kit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
| CO2 Tegulated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
| Coelenterazine (CTZ) | NanoLight Technology | 479474 | |
| D-luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 119222 | |
| DMEM Medium | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Ti-E/U/S | |
| Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
| Graphics Software | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
| Insulin Syringe Needles | Becton Dickinson | 328421 | |
| Isoflurane | Baxter | 691477H | |
| Lentiviral Packaging System | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | |
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
| Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
| MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
| RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
| SORVALL ST 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
| Ultra-low Temperature Refrigerator | Haier | DW-86L338 | |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | XENOGEN Corporation | 7293 |
References
- Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).
- Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).
- Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).
- Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
- McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).
- Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC. Journal of Clinical Oncology. 26, 17006 (2008).
- Wang, R., et al. Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence. Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).
- Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. Tumor angiogenesis, from foe to friend. Science. 349, 694-695 (2015).
- Zhang, K., et al. Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment. ACS Applied Materials & Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).
- Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. , 70-81 (2017).
- Lee, S., et al. Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis. Cell. 130, 691-703 (2007).
- Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response. Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).
- Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer. Pharmacology & Therapeutics. 164, 152-169 (2016).
- Wong, P. P., et al. Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread. Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).
- Mezzanotte, L., van 't Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications. Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).
- Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy. Biochimie. 116, 43-51 (2015).
- Liu, J., et al. Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).
- Branchini, B. R., et al. Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments. Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).
- McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing "red-shifted" luciferase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571 (2013).
