Summary

In vitro generatie van muis Hartveld-specifieke hart voorlopercellen

Published: July 03, 2019
doi:

Summary

Het doel van deze methode is het genereren van hartgebied-specifieke cardiale stamcellen in vitro om de stamvader cel specificatie en functionele eigenschappen te bestuderen, en het genereren van kamer specifieke cardiale cellen voor hart-en vaatziekten modellering.

Abstract

Pluripotente stamcellen bieden een groot potentieel voor het begrijpen van Hartontwikkeling en ziekte en voor regeneratieve geneeskunde. Hoewel de recente ontwikkelingen in de ontwikkelingsstoornissen cardiologie hebben geleid tot het genereren van hartcellen uit pluripotente stamcellen, is het onduidelijk of de twee cardiale velden-de eerste en tweede hart velden (FHF en SHF)-worden geïnduceerd in pluripotente stamcellen systemen. Om dit aan te pakken, genereerden we een protocol voor in vitro specificatie en isolatie van hartveld-specifieke cardiale stamcellen. We gebruikten embryonale stamcellen lijnen die Hcn4-GFP en Tbx1-CRE; Rosa-offerte reporters van de FHF en de SHF, respectievelijk, en levende cel immunokleuring van de celmembraan eiwit Cxcr4, een SHF marker. Met deze aanpak genereerden we voorlopercellen die de functionele eigenschappen en transcriptoom van hun in vivo recapituleren. Ons protocol kan worden gebruikt om vroege specificatie en scheiding van de twee hart gebieden te bestuderen en kamer-specifieke hartcellen voor de modellering van de hartkwaal te produceren. Aangezien dit een in vitro organite systeem is, kan het geen nauwkeurige anatomische informatie verstrekken. Echter, dit systeem overwint de slechte bereikbaarheid van gastrulation embryo’s en kan worden opgeschaald voor high-throughput schermen.

Introduction

Het gebruik van pluripotente stamcellen (psc’s) heeft een revolutie teweeggebracht in het gebied van cardiale regeneratie en gepersonaliseerde geneeskunde met patiënt-specifieke myocytes voor ziektemodel lering en drugs therapieën1,2,3, 4. meer recentelijk, in vitro protocollen voor de generatie van atriale VS ventriculaire evenals pacemaker-achtige PSC-afgeleide cardiomyocytes zijn ontwikkeld5,6. Echter, of cardiogenesis kan worden herschapen in vitro om cardiale ontwikkeling te bestuderen en vervolgens te genereren ventriculaire kamer-specifieke cardiale cellen is nog steeds onduidelijk.

Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling, mesodermaal cellen onder invloed van afgescheiden morphogens zoals BMP4, Wnts en Activin een vorm van de primitieve streak7. Cardiale mesodermaal cellen gekenmerkt door de expressie van Mesp1, migreren naar voren en de laatste tijd om de hart sikkel en vervolgens de primitieve hart buis7,8te vormen. Deze migrerende groep van cellen omvat twee zeer verschillende populaties van cardiale stamcellen (cpc’s), namelijk de eerste en de tweede hartveld (fhf en SHF)9,10. Cellen uit de SHF zijn zeer proliferative en trekkende en zijn primair verantwoordelijk voor de rek-en lus van de hart buis. Bovendien, SHF cellen differentiëren tot cardiomyocytes, fibroblasten, gladde spieren en endothelial cellen als ze in het hart buis om de rechter ventrikel, rechter ventrikel uitstroom tractus en een groot deel van beide atria7,10te vormen. In tegenstelling, FHF cellen zijn minder proliferatie en trekkende en differentiëren vooral om cardiomyocytes als ze aanleiding geven tot de linker ventrikel en een kleiner deel van de atria11. Bovendien SHF progenitoren worden gekenmerkt door de expressie van Tbx1, FGF8, FGF10 en Six2, terwijl fhf cellen Express Hcn4 en Tbx511, 12,13,14,15.

Psc’s kan aan alle drie kiem lagen en later aan om het even welk type van cel in lichaam4,16onderscheiden. Daarom bieden ze een enorm potentieel voor het begrijpen van Hartontwikkeling en voor het modelleren van specifieke ontwikkelingsstoornissen resulteert in aangeboren hart-en vaatziekten, de meest voorkomende oorzaak van aangeboren afwijkingen17. Een grote subgroep van aangeboren hartziekte omvat kamer-specifieke cardiale afwijkingen18,19. Nochtans, is het nog onduidelijk of deze uit abnormale hart gebiedsontwikkeling voortkomen. Bovendien, gezien het onvermogen van cardiomyocytes te vermenigvuldigen na de geboorte, zijn er uitgebreide inspanningen om cardiale weefsel te creëren voor hart regeneratie1,7,20. Gezien de fysiologische en morfologische verschillen tussen hartkamers, is het genereren van kamer-specifieke cardiale weefsels met behulp van Psc’s van groot belang. Hoewel de recente ontwikkelingen in de ontwikkelingsstoornissen cardiologie hebben geleid tot een robuuste generatie van cardiale cellen van Psc’s, is het nog onduidelijk of de twee hart velden kunnen worden geïnduceerd in PSC-systemen.

Om recapituleren cardiogenesis in vitro en de studie van de specificatie en de eigenschappen van cpc’s, hebben we eerder gebruik gemaakt van een systeem op basis van differentiëren PSC-afgeleide cardiale sferoïden21,22,23,24. Onlangs hebben we gegenereerd muis embryonale stamcellen (mESCs) met GFP en offerte verslaggevers onder de controle van de FHF gen Hcn4 en de SHF gen Tbx1, respectievelijk (mESCsTbx1-CRE; Rosa-offerte; HCN4-GFP) 25. In vitro gedifferentieerde mESCs gevormd cardiale sferoïden waarin GFP + en offerte + cellen verschenen uit twee verschillende gebieden van mesodermaal cellen en patroon in een complementaire wijze. De resulterende GFP + en offerte + cellen tentoongesteld FHF en SHF kenmerken, respectievelijk, bepaald door RNA-sequencing en klonale analyses. Belangrijk is, met behulp van mESCs die de Isl1-offerte Reporter (mESCIsl1-offerte), ontdekten we dat SHF cellen getrouw werden gekenmerkt door de cel-oppervlakte-eiwit CXCR4, en dit kan de isolatie van hartgebied-specifieke cellen mogelijk te maken zonder transgenen. Het huidige protocol beschrijft de generatie en isolatie van hart-specifieke Cpc’s van mESCs, die als waardevol instrument kunnen dienen voor het bestuderen van kamer-specifieke hartziekten.

Protocol

Opmerking: In vitro generatie van hartgebied-specifieke muis hart voorlopercellen (Figuur 1). 1. onderhoud van de muis Ser’s Grow mESCs (mESCsTbx1-CRE; Rosa-offerte; HCN4-GFP, MESCISL1-offerte)25 op 0,1% (w/v) gelatine gecoate T25 kolven in 2i medium (870 ml van GLASCOW minimale essentiële medium (GMEM), 100 ml foetale boviene serum (FBS), 10 ml GlutaMAX, 10 ml niet-essenti…

Representative Results

Na ongeveer 132 h van differentiatie, Tbx1-offerte en Hcn4-GFP Cpc’s kan worden gedetecteerd met behulp van een fluorescerende Microscoop (Figuur 2). Over het algemeen, GFP en offerte cellen verschijnen ongeveer rond dezelfde tijd. De twee populaties van Cpc’s blijven groeien in de nabijheid en vaak in een complementair patroon. Aanpassing van de concentraties van Activin A en BMP4 zal veranderen de percentages van FHF VS SHF Cpc’s (Figuur 3). De CPC-specificati…

Discussion

In ons protocol beschrijven we een methodologie om cardiale sferoïden en geïsoleerde hartveld-specifieke Cpc’s te genereren. Die kunnen worden gebruikt om mechanismen van CPC-specificatie en hun eigenschappen te bestuderen, evenals voor cardiale kamer-specifieke ziektemodel lering. Één eerder gepubliceerd werk gebruikte een mESC lijn met twee fluorescente verslaggevers (Mef2c/Nkx 2.5) om cardiogenesis in vitro te bestuderen, echter, worden beide markeringen uitgedrukt bij embryonale dag 9.5-10 wanneer cardiomyocytes …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

E. T. werd ondersteund door de magie die telt en AHA. C. K. werd gesteund door toelagen van NICHd/NIH (R01HD086026), AHA, en MSCRF.

Materials

β-mercaptoethanol Sigma M6250
0.1% (w/v) Gelatin EMD Millipore ES-006-B
100mM Sodium Pyruvate Gibco 11360
100X Pen/Strep Gibco 15070-063
1X PBS w/o Calcium and Magnesium Thermo Fisher Scientific 21-040-CV
20% Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 50-980-493
5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer BD Falcon 35223
Activin A R & D Systems 338-AC-010
Ascorbic Acid Sigma A-4544
B27 minus vitamin A (50x) Thermo Fisher Scientific 12587010
BMP4 R & D Systems 314-BP
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
Cell sorter Sony SH800 Sony or any other fluorescence-activated cell sorter
Cell strainer 70μm Thermo Fisher Scientific 08-771-2
Centrifuge Sorvall Legend XT Thermo Fisher Scientific 75004508
CHIR99021 Selleck chemicals S2924
CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 51030285
Corning Ultra Low Attachment T75 flask Corning 07-200-875
Countless II FL automated cell counter Thermo Fisher Scientific
Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate Thermo Fisher Scientific A-31571, Lot #1757130
Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) Gibco 11965-092
EDTA Sigma E6758
ESGRO (LIF) Millipore ESG1106
EVOS FL microscope Thermo Fisher Scientific AMF4300
Fetal Bovine Serum Invitrogen SH30071.03
Glasgow’s MEM (GMEM) Gibco 11710035
GlutaMAX (100 x) Gibco 35050-061
Ham’s F12 Gibco 10-080-CV
HEPES Sigma H3375
IMDM Gibco 12440053
Monothioglycero (MTG) Sigma M-6145
Mouse anti-Troponin T antibody Thermo Fisher Scientific MS-295-P1
N2-SUPPLEMENT Gibco 17502-048
Non-essential amino acid solution (NEAA Invitrogen 11140-050
PD0325901 Selleckchem S1036
PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody Thermo Fisher Scientific 46-9991-82
Suspension culture dish 150 mm x 25mm Corning 430597
T25 flasks Corning 353109
TrypLE (Trypsin) Gibco 12604
Y-27632 (ROCK inhibitor) Stem cell technologies 72304

References

  1. Laflamme, M. A., Murray, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
  2. Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
  3. Birket, M. J., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors–a developmental perspective. Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).
  4. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
  5. Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
  6. Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
  7. Galdos, F. X., et al. Cardiac Regeneration: Lessons From Development. Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).
  8. Lescroart, F., et al. Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development. Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).
  9. Bruneau, B. G. Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).
  10. Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).
  11. Bruneau, B. G., et al. Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome. Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).
  12. Watanabe, Y., et al. Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).
  13. Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field. Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).
  14. Zhou, Z., et al. Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease. Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).
  15. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
  16. Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).
  17. Bruneau, B. G., Srivastava, D. Congenital heart disease: entering a new era of human genetics. Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).
  18. Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).
  19. Li, L., et al. HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle. International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).
  20. Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
  21. Uosaki, H., et al. Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).
  22. Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).
  23. Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, 02164 (2014).
  24. Morita, Y., et al. Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).
  25. Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).
  26. Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326 (5951), 426-429 (2009).

Play Video

Cite This Article
Tampakakis, E., Miyamoto, M., Kwon, C. In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (149), e59826, doi:10.3791/59826 (2019).

View Video