Generazione in vitro di cellule progenitrici cardiache specifiche del campo del cuore del mouse
Summary
Lo scopo di questo metodo è quello di generare cellule progenitrici cardiache specifiche del campo cardiaco del campo cardiaco in vitro al fine di studiare le specifiche delle cellule progenitrici e le proprietà funzionali, e di generare cellule cardiache specifiche della camera per la modellazione delle malattie cardiache.
Abstract
Le cellule staminali pluripotenti offrono un grande potenziale per comprendere lo sviluppo e la malattia del cuore e per la medicina rigenerativa. Sebbene i recenti progressi nella cardiologia dello sviluppo abbiano portato a generare cellule cardiache da cellule staminali pluripotenti, non è chiaro se i due campi cardiaci – il primo e il secondo campo cardiaco (FHF e SHF) – siano indotti nei sistemi di cellule staminali pluripotenti. Per risolvere questo problema, abbiamo generato un protocollo per la specifica in vitro e l’isolamento delle cellule progenitrici cardiache specifiche del campo cardiaco. Abbiamo usato linee di cellule staminali embrionali che trasportano Hcn4-GFP e Tbx1-Cre; I giornalisti Rosa-RFP del FHF e dello SHF, rispettivamente, e l’immunostaining delle cellule vive della proteina della membrana cellulare Cxcr4, un marcatore SHF. Con questo approccio, abbiamo generato cellule progenitrici che ricapitolano le proprietà funzionali e il trascrittoma delle loro controparti in vivo. Il nostro protocollo può essere utilizzato per studiare le specifiche iniziali e la segregazione dei due campi cardiaci e per generare cellule cardiache specifiche della camera per la modellazione delle malattie cardiache. Poiché si tratta di un sistema organoide in vitro, potrebbe non fornire informazioni anatomiche precise. Tuttavia, questo sistema supera la scarsa accessibilità degli embrioni dello stadio di gasastrulation e può essere scalato per schermi ad alta velocità.
Introduction
L’uso di cellule staminali pluripotenti (PSC) ha rivoluzionato il campo della rigenerazione cardiaca e della medicina personalizzata con miociti specifici per il paziente per la modellazione della malattia e le terapie farmacologiche1,2,3, 4.Più recentemente, sono stati sviluppati i protocolli in vitro per la generazione di cardiomiociti atriale vs ventricolare e di un pacemaker derivato da PSC5,6. Tuttavia, se la cardiogenesi può essere ricreata in vitro per studiare lo sviluppo cardiaco e successivamente generare cellule cardiache ventricolare specifiche della camera non è ancora chiaro.
Durante lo sviluppo embrionale precoce, le cellule mesodermiche sotto l’influenza di morfogeni secreti come BMP4, Wnts e Activin A formano la striscia primitiva7. Le cellule mesodermiche cardiache segnate dall’espressione di Mesp1 migrano anteriormente e ultimamente per formare la mezzaluna cardiaca e poi il tubo cardiaco primitivo7,8. Questo gruppo migratorio di cellule comprende due distinte popolazioni di cellule progenitrici cardiache (CPC), vale a dire il primo e il secondo campo cardiaco (FHF e SHF)9,10. Le cellule del SHF sono altamente proliferanti e migratorie e sono principalmente responsabili dell’allungamento e del looping del tubo cardiaco. Inoltre, le cellule SHF si differenziano per cardiomiociti, fibroblasti, muscoli lisci e cellule endoteliali mentre entrano nel tubo cardiaco performare il ventricolo destro, il tratto di deflusso ventricolare destro e gran parte di entrambi atri atri,10. Al contrario, le cellule FHF sono meno proliferanti e migratorie e si differenziano principalmente per i cardiomiociti in quanto danno origine al ventricolo sinistro e una parte più piccola degli atri11. Inoltre, i progenitori SHF sono contrassegnati dall’espressione di Tbx1, FGF8, FGF10 e Six2 mentre le cellule FHF esprimono Hcn4 e Tbx511,12,13,14,15.
I PSC possono differenziarsi a tutti e tre glistrati germinali e successivamente a qualsiasi tipo di cellula nel corpo 4,16. Pertanto, offrono un enorme potenziale per comprendere lo sviluppo del cuore e per modellare difetti specifici dello sviluppo con conseguente malattia cardiaca congenita, la causa più frequente di difetti alla nascita17. Un grande sottogruppo di malattie cardiache congenite include anomalie cardiache specifiche della camera18,19. Tuttavia, non è ancora chiaro se questi provengano dallo sviluppo anomalo del campo cardiaco. Inoltre, data l’incapacità dei cardiomiociti di proliferare dopo la nascita, ci sono stati ampi sforzi per creare tessuto cardiaco per la rigenerazione cardiaca1,7,20. Considerando le differenze fisiologiche e morfologiche tra le camere cardiache, la generazione di tessuto cardiaco specifico della camera utilizzando i PSC è di notevole importanza. Mentre i recenti progressi nella cardiologia dello sviluppo hanno portato a una solida generazione di cellule cardiache da PSC, non è ancora chiaro se i due campi cardiaci possano essere indotti nei sistemi PSC.
Per ricapitolare cardiogenesi in vitro e studiare le specifiche e le proprietà dei CPC, in precedenza abbiamo usato un sistema basato sulla differenziazione degli sferoidi cardiaci derivati da PSC21,22,23,24. Recentemente, abbiamo generato cellule staminali embrionali di topo (mESC) con gFP e reporter RFP sotto il controllo del gene FHF Hcn4 e del gene SHF Tbx1, rispettivamente (mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. Gli mESC differenziati in vitro formavano sferoidi cardiaci in cui le cellule GFP e RFP sono apparse da due aree distinte di cellule mesodermiche e modellate in modo complementare. Le cellule di GFP e RFP e RFP risultanti hanno mostrato caratteristiche FHF e SHF, determinate rispettivamente dalle analisi di sequenziamento dell’RNA e clonali. È importante sottolineare che, utilizzando mESC che trasportano il reporter Isl1-RFP (mESCIsl1-RFP), abbiamo scoperto che le cellule SHF sono state contrassegnate fedelmente dalla proteina della superficie cellulare CXCR4, e questo può consentire l’isolamento delle cellule specifiche del campo cardiaco senza transgeni. Il presente protocollo descriverà la generazione e l’isolamento di CPC specifici sul campo cardiaco da mESC, che possono fungere da valido strumento per studiare le malattie cardiache specifiche della camera.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel nostro protocollo, descriviamo una metodologia per generare sferoidi cardiaci e CPC isolati specifici sul campo del cuore. Questi possono essere utilizzati per studiare i meccanismi di specifica CPC e le loro proprietà, così come per la modellazione della malattia della camera cardiaca specifica. Un lavoro pubblicato in precedenza ha utilizzato una linea mESC con due reporter fluorescenti (Mef2c/Nkx2.5) per studiare cardiogenesi in vitro, tuttavia, entrambi questi marcatori sono espressi al giorno embrionale 9,5-10…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E. T. è stato supportato da The Magic That Matters e AHA. C. K. è stato supportato da sovvenzioni da NICHD/NIH (R01HD086026), AHA e MSCRF.
Materials
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100X Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1X PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100 x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
References
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