Summary
이 방법의 목적은 전구 세포 사양 및 기능적 특성을 연구하기 위해 시험관 내에서 심장 필드 특이적 심장 전구 세포를 생성하고 심장 질환 모델링을 위한 챔버 특정 심장 세포를 생성하는 것이다.
Abstract
만능 줄기 세포는 심장 발달과 질병을 이해하고 재생 의학에 대한 큰 잠재력을 제공합니다. 발달 심장학에 있는 최근 어드밴스는 다능성 줄기 세포에서 심장 세포를 생성하는 지도하는 동안, 두 개의 심장 필드 - 첫번째와 두 번째 심장 필드 (FHF 및 SHF) - 만능 줄기 세포 시스템에서 유도되는 경우에 불분명합니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 시험관 내 사양 및 심장 필드 특정 심장 전구 세포의 격리를위한 프로토콜을 생성했다. 우리는 Hcn4-GFP 및 Tbx1-Cre를 운반하는 배아 줄기 세포 라인을 사용; FHF 및 SHF의 로사-RFP 리포터는 각각 세포막 단백질 Cxcr4의 세포 면역염색, SHF 마커의 살아있는 세포 면역염색. 이 접근법으로, 우리는 생체 내 대응물의 기능적 특성 및 전사체를 재량화시키는 전구 세포를 생성하였다. 우리의 프로토콜은 두 심장 필드의 초기 명세 및 분리를 연구하고 심장 질환 모델링을위한 챔버 특정 심장 세포를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 시험관 내 오르가노이드 시스템이기 때문에 정확한 해부학 정보를 제공하지 않을 수 있습니다. 그러나, 이 시스템은 가위 단계 배아의 가난한 접근성을 극복하고 높은 처리량 스크린을 위해 업스케일링될 수 있습니다.
Introduction
만능 줄기 세포 (PSC)의 사용은 질병 모델링 및 약물 치료를위한 환자 별 근세포와 심장 재생 및 개인화된 의학의 분야에 혁명을 일으켰습니다 1,2,3, 4.최근에는 심방 대 심실 생성을 위한 시험관내 프로토콜뿐만 아니라 심박동기 유사 PSC 유래 심근세포가 5,6으로개발되었다. 그러나, 심장 발생이 심실 발달을 연구하고 이어서 심실 챔버 특이적 심장 세포를 생성하기 위해 시험관 내에서 재현될 수 있는지 여부는 여전히 불분명하다.
초기 배아 발달 동안, BMP4, Wnts 및 Activin A와 같은 분비 된 모르포겐의 영향으로중피 세포는 원시 적 줄무늬 7을 형성한다. Mesp1의 발현에 의해 표시된 심장 중피 세포는 전방 및 후후반에 이동하여 심장 초승달을 형성한 다음 원시 심장 튜브 7,8을형성합니다. 세포의 이 철새 군은 심장 전구 세포 (CPC) 즉 제 1 및 제 2 심장 필드 (FHF및 SHF) 9,10의두 개의 매우 뚜렷한 집단을 포함한다. SHF에서 세포는 높게 증식하고 철새이고 심장 관의 신장 그리고 반복에 1 차적으로 책임 있습니다. 또한, SHF 세포는 심근세포, 섬유아세포, 평활근 및 내피 세포가 심장관에 진입하여 우심실, 우심실 유출관 및 아트리아7,10의큰 부분을 형성함에 따라 분화한다. 대조적으로, FHF 세포는 덜 증식하고 철새이며 주로 심근세포로 분화하여 좌심실과 심방의 작은 부분을 발생시며11. 더욱이, SHF 전구체는 Tbx1, FGF8, FGF10 및 식스2의 발현에 의해 표시되고 FHF 세포는 Hcn4 및 Tbx511,12,13,14,15를발현한다.
PSCs는 3개의 세균 층 모두를 분화하고 그후에 바디에 있는 어떤 세포 모형든지4,16로분화할 수 있습니다. 그러므로, 그(것)들은 선천적인 심장병, 출생 결함의 가장 빈번한 원인17의결과로 심장 발달을 이해하고 특정 발달 결함을 모델링을 위한 엄청난 잠재력을 제안합니다. 선천성 심장 질환의 큰 하위 그룹은 챔버 특정 심장 이상을 포함18,19. 그러나, 그것은 여전히 불분명 여부 이러한 비정상적인 심장 필드 개발에서 유래. 또한, 출생 후 증식하는 심근세포의 무능력을 감안할 때, 심장 재생을 위한 심장조직을 만들기 위한 광범위한 노력이 있었다 1,7,20. 심장 챔버 사이의 생리적 및 형태학적 차이를 고려할 때, PSC를 사용하는 챔버 특이적 심장 조직의 생성은 매우 중요하다. 발달 심장학에 있는 최근 어드밴스는 PSC에서 심장 세포의 강력한 생성으로 이끌어 냈습니다 그러나, 2개의 심혼 필드가 PSC 시스템에서 유도될 수 있는지 아직도 불분명합니다.
시험관내 심장 발생을 재량화하고 CPC의 사양 및 특성을 연구하기 위해 이전에는 PSC 유래 심장 스페로이드21,22,23,24를차별화하는 시스템을 사용했습니다. 최근, 우리는 FHF 유전자 Hcn4 및 SHF 유전자 Tbx1의 통제 하에 GFP 및 RFP 리포터를 가진 마우스 배아 줄기 세포(mESCs)를 각각 생성하였다(mESCsTbx1-Cre; 로사-RFP; HCN4-GFP) 25. 시험관 내 분화 mESCs는 GFP+ 및 RFP + 세포가 중피 세포의 두 개의 별개의 영역에서 나타나고 상보적인 방식으로 패턴화 된 심장 스페로이드를 형성했습니다. 생성된 GFP+ 및 RFP+ 세포는 각각 RNA 시퀀싱 및 클론 분석에 의해 결정된 FHF 및 SHF 특성을 나타내었다. 중요한 것은, Isl1-RFP 리포터 (mESCIsl1-RFP)를운반하는 mESCs를 사용하여, 우리는 SHF 세포가 세포 표면 단백질 CXCR4에 의해 충실하게 표시되었다는 것을 것을을 발견하고, 이것은 형질 전환 없이 심혼 필드 특정 세포의 격리를 가능하게 할 수 있습니다. 본 프로토콜은 mcCS에서 심장 필드 특정 CPC의 생성 그리고 격리를 기술할 것입니다, 이는 챔버 특정 심장 병을 공부하기위한 귀중한 도구로 봉사 할 수있다.
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Protocol
참고: 심장 필드 특정 마우스 심장 전구 세포의 시험관내 생성 (그림 1).
1. 마우스 ESC의 유지 보수
- mESCs 성장 (mESCsTbx1-Cre; 로사-RFP; HCN4-GFP,mESCIsl1-RFP)25 에 0.1% (w/v) 젤라틴 코팅 T25 플라스크 2i 매체 (870 mL의 글래스코우 최소 필수 배지 (GMEM), 태아 소 혈청 (FBS), 100 mL의 글루타맥스, 10 mL의 비 필수 ml, 10 mL pyruvate, 3 μL의 베타 메르카프토에탄올, 20 μL의 Lif (200 U/mL), 0.3 μM CHIR99021 및 0.1 μM PD0325901).
- 세포가 70-80% 합류에 도달하면 인산완충액(PBS)으로 세포를 한 번 헹구고 트립신 1mL를 추가하고 37°C에서 3분 동안 배양하여 단일 세포로 해리합니다.
- 덜베코의 수정 된 독수리 매체 (DMEM)에 10 % FBS의 4 mL을 추가하여 트립신을 중화하십시오. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀을 계산합니다.
- 원심 분리기 ~ 3 x 105 세포 270 x g 및 실온에서 3 분 동안.
- 상판을 흡인하고, 세포를 2i 배지의 5 mL로 재중단하고 0.1% (w/v) 젤라틴 코팅 T25 플라스크에 재플레이트하여 유지보수를 한다.
2. 심장 전구체를 이용한 심장 전구 세포 생성
- 원심분리기 2.5 x 106 세포 단계 1.3 에서 3 분 동안 270 x g 및 실온.
- 상판을 흡인하고 SFD 배지 의 25 mL (105 세포 / mL)에서 세포를 다시 중단합니다. 실험의 규모에 따라, mESC 수는 그에 따라 조정될 수 있다.
참고: SFD 매체에는 이스코브의 수정된 덜베코 미디엄(IMDM), 250 mL의 햄 F12, 5 mL의 N2 보충, B27마이너스 비타민 A의 10 mL, 5 mL의 10% (w/v) BSA (PBS), 7.5 글루타맥스의 mL 과 7.5 페니실린-스트렙 토마이신의 mL. 사용 전에 아스코르브산(50 mg/mL)과 3.9 x 10-3%(v/v)의 모노티오글리세롤을 첨가하십시오. - 세포 현탁액을 150 mm x 25 mm 멸균 플레이트에 플레이트하고 48 시간 동안 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배양하여 심장 스페로이드를 24시간 내에 형성해야 한다.
- 145 x g및 실온에서 3 분 동안 형성 된 모든 심장 스페로이드 및 원심 분리기를 수집하여 선택적으로 스페로이드를 분리하고 단일 세포를 피하십시오.
- 상판을 흡인하고 분화 유도를 위해 액티빈 A의 1 ng/mL 및 BMP4의 1.5 ng/mL로 SFD 배지의 25 mL에서 스페로이드를 다시 일시 중단합니다. 동일한 150 mm x 25mm 멸균 플레이트에 스페로이드를 플레이트하고 40시간 동안 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다.
참고: 액티빈 A(0-3 ng/mL) 및 BMP4(0.5-2 ng/mL)의 다양한 농도는 mESC 라인에 따라 분화 최적화에 사용될 수 있습니다. - 모든 심장 스페로이드와 원심 분리기를 145 x g 및 실온에서 3 분 동안 수집하십시오.
- 상판을 흡인하고 SFD 배지의 25 mL에서 스페로이드를 다시 중단합니다. 재부유 된 EB를 초저 부착 75 cm2 플라스크로 옮기고 48 시간 동안 5 % CO2 인큐베이터에서 37 °C에서 배양하십시오.
3. 형광 기자를 사용하여 심장 필드 특정 심장 전조 세포의 격리
- 145 x g에서 심장 스페로이드를 3 분 동안 실온에서 원심 분리기 및 상수흡기. 트립신 1 mL을 넣고 37°C에서 3분 동안 배양합니다.
- DMEM에 10% FBS 의 4mL를 추가하여 트립신을 비활성화하고 파이펫팅으로 잘 섞습니다. 비해리 된 EB를 제거하려면 70mm 스트레이너를 사용하여 혼합물을 걸러내고 270 x g 및 실온에서 3 분 동안 여과 된 세포를 원심 분리합니다.
- 형광 리포터(mESCs Tbx1-Cre에서 파생된 CPC)를 운반하는 CPC를 정렬하기위해; 로사-RFP; HCN4-GFP)상월체를 흡인하고 FACS 선별 용액 500 μL(1% (v/v) FBS, 200 mM HEPES 및 PBS에서 EDTA 10 mM)를 추가하여 다시 중단합니다.
- 선별하기 전에 모든 세포 클러스터를 제거하려면 40 μm 셀 스트레이너가있는 5 mL 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브를 사용하여 세포를 다시 필터링하십시오. 선별될 때까지 세포를 얼음 위에 보관하십시오.
- Tbx1-Cre를 분리하기 위해 세포를 정렬; 형광 활성화 세포 선별기(FACS)를 이용한 로사-RFP 및 HCN4-GFP 양성 CPC. FBS의 1 mL에서 정렬 된 세포를 수집합니다. 세포 샘플과 선별된 세포를 4°C로 유지합니다.
4. 세포 표면 단백질 마커로 Cxcr4를 사용하여 심장 필드 특정 심장 전구 세포의 격리
- 표면 단백질 수용체 Cxcr4의 발현에 기초하여 제1 대 제2 심장 필드 CPC를 분리하려면, mESCIsl1-RFP라인을사용한다. 3.3단계에서 상월체를 흡인하고 1:200(vol/vol) PerCP-efluor 710 공액 항 Cxcr4 항체를 함유하는 PBS에서 10% FBS의 300 μL에서 단일 CPC를 재중단한다.
- 실온에서 5분 동안 배양하고 1-2 mL의 차가운 PBS를 추가하여 세척합니다. 270 x g및 실온에서 3 분 동안 단일 CPC를 원심 분리하고 원심 분리후 2 회 더 세척하십시오.
- 상급을 흡인하고 500 μL의 FACS 선별 솔루션을 추가하여 3.4 단계에서와 같이 단일 CPC 및 필터를 다시 중단합니다.
- FACS를 사용하여 Cxcr4+ 및 Cxcr4 세포를 분리합니다. FBS의 1 mL에서 정렬 된 세포를 수집합니다. 세포 샘플과 선별된 세포를 4°C로 유지합니다.
5. 고립 된 심장 필드 특정 심장 전구 세포의 분석
- 원심분리기는 270 x g 및 실온에서 3분 동안 CPC를 분류했습니다. 정렬된 세포는 유전자 및 단백질 발현 분석을 위해 이용될 수 있거나 나중에 분석을 위해 배양될 수 있습니다.
- 분리 된 CPC를 다시 배양하기 위해, 상월체를 흡인하고, 0.1 % (w / v) 젤라틴으로 코팅 된 384 웰 플레이트의 웰 당 3 x 104 세포당 SFD 배지 및 재플레이트에서 세포를 재중단합니다. 선별 후 세포 사멸이 증가하면, Y-27632(ROCK 억제제)의 10 μM을 시료에 첨가한다. 재문화 후 이틀 후, 자발적인 구타는 주목해야한다.
- 심근세포로 분화하는 도금 된 CPC의 능력을 분석하려면 분화 12 일째에 세포를 수집하십시오. 1.2-1.5 단계에 설명된 대로 트립신을 사용하여 단일 CM을 분리합니다.
- 세포를 895 x g에서 3 분 동안 원심 분리하고 실온에 대 고 있습니다. 상월체를 흡인하고 PFA를 세척하기 위해 PBS에서 세포를 재중단한다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.
- 상급체를 흡인하고 PBS에서 10 % FBS에서 세포를 다시 중단합니다. 마우스 항 트로포닌 T 항체(1:500)로 세포 샘플의 절반을 인큐베이션하고 나머지 샘플을 음성 대조군으로 사용한다. 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.
- PBS를 사용하여 5.4단계에서 설명한 대로 세포를 2회 세척한다. 상월체를 흡인하고 1:500 당나귀 항마우스 IgG(H+L) 이차 항체, 알렉사 플루어 647 컨쥬게이트를 사용하여 PBS에서 10% FBS에서 두 세포 샘플을 재중단한다. 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 5.6단계에서와 같이 PBS로 두 번 씻으세요. 상월체를 흡인하고 PBS의 200 μL에서 세포를 재중단한다. 유세포계를 사용하여 세포를 분석합니다.
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Representative Results
분화의 대략 132 시간 후에, Tbx1-RFP 및 Hcn4-GFP CPC는 형광 현미경을 사용하여 검출될 수 있습니다(그림2). 일반적으로, GFP 및 RFP 세포는 대략 같은 시간에 나타납니다. CPC의 두 인구는 근접하고 일반적으로 상호 보완적인 패턴으로 계속 확장됩니다. 액티빈 A 및 BMP4의 농도를 조정하면 FHF 대 SHF CPC의 백분율이 변경됩니다(그림 3). 시험관내 CPC 사양은 주로 BMP4의 농도에 의해 결정되었다. 따라서, 우리의 심장 스페로이드 시스템은 CPC 사양을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
마찬가지로 Isl1-RFP 리포터 mESC 라인을 사용하여 132시간 분화 후 Isl1-RFP+ CPC가 나타납니다. CXCR4, Isl1-RFP+, Cxcr4+ 대 Isl1-RFP+에 대한 CPC의 면역 염색 후, Cxcr4-세포를 단리할 수 있다(그림 4).
심근세포로 분화하는 mESC 유래 CPC의 능력을 분석하기 위해, 심장 트로포닌 T에 대한 면역 염색은 분화의 12일째에 수행될 수 있다. FHF 세포가 주로 근세포와 분화하는 모델과 일치하여, Hcn4-GFP+ CPC로부터 유래된 세포는 주로 근생성이다(그림5A,B). 유사하게, Isl1+, CXCR4-CPC에서 유래된 세포는 또한 Isl1+, CXCR4-CPC (그림5C)에 비해 훨씬 더 높은 백분율로 심근세포를 발생시게 한다.
때때로, mESCs는 효율적으로 분화하지 못하고 매우 낮은 수의 심장 필드 특정 CPC를 형성합니다(그림6).
그림 1 : 심장필드 특이적 심장 전구세포의 시험관내 사양의 개략적 표현. mESCs는 48 시간 안에 스페로이드를 형성합니다. 그런 다음 40 시간 동안 액티빈 A 및 BMP4에 노출되면 중피 성 유도로 이어질 것입니다. 심장 전구 세포는 대략 36 시간 나중에 발전합니다. 제2 또는 제1 심장 필드의 선조는 형광 활성화 세포 선별을 사용하여 분류될 수 있다. 두 번째 심장 필드 세포는 Hcn4-GFP에 의해 표시된 첫번째 심혼 필드 대 Tbx1-RFP 발현에 의해 표시됩니다. 또는, Isl1-RFP는 CPC를 표시하고 Cxcr4에 대하여 살아있는 면역 염색을 사용하여 Isl1+, Cxcr4+ 대 Isl1+, Cxcr4- CPC를 각각 두 번째 대 첫 번째 심장 필드 세포를 나타내는 분류할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : CPC 사양 이후 심장 스페로이드의 대표적인 이미지. RFP는 Tbx1+ 및 GFP 마크 Hcn4+ CPC를 표시합니다. 2개의 세포 인구는 무료 패턴에 있는 가까운 근접에 형성됩니다. 배율 막대 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 액티빈 A와 BMP4의 다양한 농도에 노출된 후 심장 스페로이드의 유세포 분석. 두 모르포겐의 농도를 조정하면 Tbx1+ 및 Hcn4+ CPC의 다른 백분율로 이어집니다. 두 인구는 주로 BMP4 농도를 조정하여 영향을 받았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : Isl1을 발현하는 심장 전구세포의 유세포분석과 Cxcr4의 면역염색. 심장 선조는 먼저 그들의 Isl1 발현에 근거하여 문이 닫힌 다음 Isl1+, Cxcr4+대 Isl1+, Cxcr4-세포를 분류하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 심장트로포닌 T에 염색된 심장장별 CPC에서 유래한 세포의 유세포분석. (A) FHF 세포의 높은 근생 전위와 일치하며, Hcn4-GFP+ 세포의 높은 백분율은 근세포로 분화한다. (B) 대부분의 Hcn4-GFP+인 모든 mESC 유래 심근세포의 분석. (C) Cxcr4- CPC는 심근세포의 높은 비율로 분화한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 시험관 내 분화 에 실패 /낮은 효율의 대표적인 세포 측정 분석. (a) Hcn4-GFP 세포의 형성이 없고 Tbx1-RFP+ 세포의 매우 낮은 백분율을 나타내는 분화 132시간 후의 유동 세포분석 분석. (B) Isl1의 매우 낮은 수준을 표현하는 mESCs의 낮은 분화 효율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리의 프로토콜에서는, 우리는 심장 스페로이드 및 고립된 심혼 필드 특정 CPC를 생성하는 방법론을 기술합니다. 이들은 CPC 명세서및 그들의 속성의 기계장치, 뿐만 아니라 심장 약실 특정 질병 모델링을 위해 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이전에 발표된 한 연구는 체외에서 심장 발생을 연구하기 위해 2개의 형광 기기자(Mef2c/Nkx2.5)와 mESC 라인을 사용했지만, 두 마커 모두 심근세포가이미 형성된 9.5-10일 배아일에 발현됩니다 26. 우리의 지식에, 현재 생체 외에서 심장 필드 특정 CPC의 격리에 대 한 방법은 없습니다. 더 중요한 것은, 우리의 프로토콜은 또한 인간 줄기 세포에 적용될 수 있습니다, CXCR4는 Isl125의높은 수준을 표현하는 SHFC를 격리하기 위하여 이용될 수 있습니다. 또한, 우리의 이중 형광 기자 mESC 라인은 CPC의 심장 장 사양 또는 세포 극성에 영향을 미칠 수있는 화합물 및 전사 인자의 라이브러리를 스크리브하는 데 사용할 수 있습니다.
프로토콜의 중요한 단계 중 하나는 mESC의 시작 수입니다. 낮거나 높은 숫자를 사용하면 심장 스페로이드의 크기와 분화 효율에 크게 영향을 미칩니다. 다른 mESC 라인에 대해 다른 세포 번호(7.5-10 x 104 셀/mL)를 테스트하는 것이 좋습니다. 또는 심장 스페로이드의 크기가 상당히 가변적으로 유지되는 경우 지정된 크기의 마이크로웰을 포함하는 웰이있는 플레이트를 사용하여 재현성을 높일 수도 있습니다. 연구원은 또한 세포 분류의 타이밍 뿐만 아니라 중피 유도의 특정 타이밍 그리고 내구의 주의해야 합니다. 더욱이, 다른 mESC 라인에 대 한, 모포겐 농도의 최적화 심장 spheroids에서 CPC를 생성 하는 그들의 능력을 테스트 하기 전에 수행 될 필요가 있을 것 이다. 이전/만료된 사이토카인 또는 세포 배양 배지의 사용 또는 모르포겐의 일관되지 않은 농도는 분화 효율에 영향을 미칩니다. 마지막으로, ~15-20회 이상 통과된 mESC 라인은 효율적으로 분화하는 능력을 상실하는 것으로 보인다.
우리의 차별화 시스템은 특정 수정을 할 수 있습니다. Cxcr4는 형광 리포터없이 mESC 라인에서 SHF CPC의 유일한 마커로 사용할 수 있습니다. 그러나 조사관은 Cxcr4+ 대 Cxcr4- CPC25를정렬하기 전에 Isl1+ CPC의 비율을 높이기 위해 분화 프로토콜을 최적화해야 합니다. 또한, 액티빈 A는 SHF CPC25의사양을 더욱 높이기 위해 Wnt3a 또는 CHIR99021(GSK3b 억제제)과 같은 정식 Wnt 작용제/활성제로 치환될 수 있다.
이 프로토콜을 사용하면 잘 정의된 조건, 시간 경과 모니터링 및 무제한 셀 수를 사용하여 CPC 사양을 연구할 수 있습니다. 따라서, 배아 분석에 비해 더 허약하고 효율적이며 비용이 적게 듭니다. 그럼에도 불구하고, 여전히 심장 필드 특정 CPC의 절대 유전자 발현 값이 생체 내 유전자 발현 수준과 밀접하게 상관관계가 없을 수 있는 체외 시스템입니다. 따라서, 우리의 시스템에서, 전적으로 BMP4 는 두 심장 필드에서 CPC를 지정할 수 있으며 크게 각각의 비율을 변경할 수 있습니다. 또한 차별화 효율성에 대한 가변성이 존재할 수 있습니다.
결론적으로, mESC 형광 리포터 라인 또는 세포막 단백질의 면역 염색을 사용하여, 우리는 시험관 내 심장 발생 및 분리 된 심장 필드 특이적 CPC를 회고했습니다. 이를 통해 CPC 사양 및 기능적 특성을 중재하는 초기 신호뿐만 아니라 심장 필드/챔버별 선천성 심장 질환을 모델링하는 초기 신호를 연구할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개에 대한 아무것도 없다.
Acknowledgments
E. T. 중요한 매직과 AHA에 의해 지원되었다. C. K.는 NICHD/NIH(R01HD086026), AHA 및 MSCRF의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100x Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1x PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 mL Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25 mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
References
- Laflamme, M. A., Murray, C. E.
- Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Birket, M. J., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective. Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Galdos, F. X., et al. Cardiac Regeneration: Lessons From Development. Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).
- Lescroart, F., et al. Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development. Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).
- Bruneau, B. G. Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).
- Bruneau, B. G., et al. Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome. Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).
- Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field. Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).
- Zhou, Z., et al. Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease. Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).
- Bruneau, B. G., Srivastava, D. Congenital heart disease: entering a new era of human genetics. Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).
- Li, L., et al. HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle. International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
- Uosaki, H., et al. Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, 02164 (2014).
- Morita, Y., et al. Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).
- Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326 (5951), 426-429 (2009).
