마우스 심장 필드 특정 심장 전구 세포의 시험관 내 생성
Summary
이 방법의 목적은 전구 세포 사양 및 기능적 특성을 연구하기 위해 시험관 내에서 심장 필드 특이적 심장 전구 세포를 생성하고 심장 질환 모델링을 위한 챔버 특정 심장 세포를 생성하는 것이다.
Abstract
만능 줄기 세포는 심장 발달과 질병을 이해하고 재생 의학에 대한 큰 잠재력을 제공합니다. 발달 심장학에 있는 최근 어드밴스는 다능성 줄기 세포에서 심장 세포를 생성하는 지도하는 동안, 두 개의 심장 필드 – 첫번째와 두 번째 심장 필드 (FHF 및 SHF) – 만능 줄기 세포 시스템에서 유도되는 경우에 불분명합니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 시험관 내 사양 및 심장 필드 특정 심장 전구 세포의 격리를위한 프로토콜을 생성했다. 우리는 Hcn4-GFP 및 Tbx1-Cre를 운반하는 배아 줄기 세포 라인을 사용; FHF 및 SHF의 로사-RFP 리포터는 각각 세포막 단백질 Cxcr4의 세포 면역염색, SHF 마커의 살아있는 세포 면역염색. 이 접근법으로, 우리는 생체 내 대응물의 기능적 특성 및 전사체를 재량화시키는 전구 세포를 생성하였다. 우리의 프로토콜은 두 심장 필드의 초기 명세 및 분리를 연구하고 심장 질환 모델링을위한 챔버 특정 심장 세포를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 시험관 내 오르가노이드 시스템이기 때문에 정확한 해부학 정보를 제공하지 않을 수 있습니다. 그러나, 이 시스템은 가위 단계 배아의 가난한 접근성을 극복하고 높은 처리량 스크린을 위해 업스케일링될 수 있습니다.
Introduction
만능 줄기 세포 (PSC)의 사용은 질병 모델링 및 약물 치료를위한 환자 별 근세포와 심장 재생 및 개인화된 의학의 분야에 혁명을 일으켰습니다 1,2,3, 4.최근에는 심방 대 심실 생성을 위한 시험관내 프로토콜뿐만 아니라 심박동기 유사 PSC 유래 심근세포가 5,6으로개발되었다. 그러나, 심장 발생이 심실 발달을 연구하고 이어서 심실 챔버 특이적 심장 세포를 생성하기 위해 시험관 내에서 재현될 수 있는지 여부는 여전히 불분명하다.
초기 배아 발달 동안, BMP4, Wnts 및 Activin A와 같은 분비 된 모르포겐의 영향으로중피 세포는 원시 적 줄무늬 7을 형성한다. Mesp1의 발현에 의해 표시된 심장 중피 세포는 전방 및 후후반에 이동하여 심장 초승달을 형성한 다음 원시 심장 튜브 7,8을형성합니다. 세포의 이 철새 군은 심장 전구 세포 (CPC) 즉 제 1 및 제 2 심장 필드 (FHF및 SHF) 9,10의두 개의 매우 뚜렷한 집단을 포함한다. SHF에서 세포는 높게 증식하고 철새이고 심장 관의 신장 그리고 반복에 1 차적으로 책임 있습니다. 또한, SHF 세포는 심근세포, 섬유아세포, 평활근 및 내피 세포가 심장관에 진입하여 우심실, 우심실 유출관 및 아트리아7,10의큰 부분을 형성함에 따라 분화한다. 대조적으로, FHF 세포는 덜 증식하고 철새이며 주로 심근세포로 분화하여 좌심실과 심방의 작은 부분을 발생시며11. 더욱이, SHF 전구체는 Tbx1, FGF8, FGF10 및 식스2의 발현에 의해 표시되고 FHF 세포는 Hcn4 및 Tbx511,12,13,14,15를발현한다.
PSCs는 3개의 세균 층 모두를 분화하고 그후에 바디에 있는 어떤 세포 모형든지4,16로분화할 수 있습니다. 그러므로, 그(것)들은 선천적인 심장병, 출생 결함의 가장 빈번한 원인17의결과로 심장 발달을 이해하고 특정 발달 결함을 모델링을 위한 엄청난 잠재력을 제안합니다. 선천성 심장 질환의 큰 하위 그룹은 챔버 특정 심장 이상을 포함18,19. 그러나, 그것은 여전히 불분명 여부 이러한 비정상적인 심장 필드 개발에서 유래. 또한, 출생 후 증식하는 심근세포의 무능력을 감안할 때, 심장 재생을 위한 심장조직을 만들기 위한 광범위한 노력이 있었다 1,7,20. 심장 챔버 사이의 생리적 및 형태학적 차이를 고려할 때, PSC를 사용하는 챔버 특이적 심장 조직의 생성은 매우 중요하다. 발달 심장학에 있는 최근 어드밴스는 PSC에서 심장 세포의 강력한 생성으로 이끌어 냈습니다 그러나, 2개의 심혼 필드가 PSC 시스템에서 유도될 수 있는지 아직도 불분명합니다.
시험관내 심장 발생을 재량화하고 CPC의 사양 및 특성을 연구하기 위해 이전에는 PSC 유래 심장 스페로이드21,22,23,24를차별화하는 시스템을 사용했습니다. 최근, 우리는 FHF 유전자 Hcn4 및 SHF 유전자 Tbx1의 통제 하에 GFP 및 RFP 리포터를 가진 마우스 배아 줄기 세포(mESCs)를 각각 생성하였다(mESCsTbx1-Cre; 로사-RFP; HCN4-GFP) 25. 시험관 내 분화 mESCs는 GFP+ 및 RFP + 세포가 중피 세포의 두 개의 별개의 영역에서 나타나고 상보적인 방식으로 패턴화 된 심장 스페로이드를 형성했습니다. 생성된 GFP+ 및 RFP+ 세포는 각각 RNA 시퀀싱 및 클론 분석에 의해 결정된 FHF 및 SHF 특성을 나타내었다. 중요한 것은, Isl1-RFP 리포터 (mESCIsl1-RFP)를운반하는 mESCs를 사용하여, 우리는 SHF 세포가 세포 표면 단백질 CXCR4에 의해 충실하게 표시되었다는 것을 것을을 발견하고, 이것은 형질 전환 없이 심혼 필드 특정 세포의 격리를 가능하게 할 수 있습니다. 본 프로토콜은 mcCS에서 심장 필드 특정 CPC의 생성 그리고 격리를 기술할 것입니다, 이는 챔버 특정 심장 병을 공부하기위한 귀중한 도구로 봉사 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리의 프로토콜에서는, 우리는 심장 스페로이드 및 고립된 심혼 필드 특정 CPC를 생성하는 방법론을 기술합니다. 이들은 CPC 명세서및 그들의 속성의 기계장치, 뿐만 아니라 심장 약실 특정 질병 모델링을 위해 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이전에 발표된 한 연구는 체외에서 심장 발생을 연구하기 위해 2개의 형광 기기자(Mef2c/Nkx2.5)와 mESC 라인을 사용했지만, 두 마커 모두 심근세포가<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E. T. 중요한 매직과 AHA에 의해 지원되었다. C. K.는 NICHD/NIH(R01HD086026), AHA 및 MSCRF의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100X Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1X PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100 x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
References
- Laflamme, M. A., Murray, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
- Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Birket, M. J., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors–a developmental perspective. Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Galdos, F. X., et al. Cardiac Regeneration: Lessons From Development. Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).
- Lescroart, F., et al. Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development. Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).
- Bruneau, B. G. Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).
- Bruneau, B. G., et al. Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome. Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).
- Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field. Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).
- Zhou, Z., et al. Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease. Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).
- Bruneau, B. G., Srivastava, D. Congenital heart disease: entering a new era of human genetics. Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).
- Li, L., et al. HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle. International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
- Uosaki, H., et al. Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, 02164 (2014).
- Morita, Y., et al. Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).
- Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326 (5951), 426-429 (2009).
