Summary
O objetivo deste método é gerar células progenitoras cardíacas específicas do campo cardíaco in vitro para estudar a especificação de células progenitoras e propriedades funcionais, e para gerar células cardíacas específicas de câmara para modelagem de doenças cardíacas.
Abstract
Células-tronco pluripotentes oferecem grande potencial para a compreensão do desenvolvimento do coração e da doença e para a medicina regenerativa. Embora os recentes avanços na Cardiologia do desenvolvimento tenham levado a gerar células cardíacas a partir de células-tronco pluripotentes, não é claro se os dois campos cardíacos-o primeiro e o segundo campos cardíacos (FHF e SHF) – são induzidos em sistemas de células-tronco pluripotentes. Para abordar este, nós geramos um protocolo para in vitro a especificação e a isolação de pilhas cardíacas campo-específicas do progenitor do coração. Foram utilizadas linhagens de células-tronco embrionárias portadoras de Hcn4-GFP e Tbx1-CRE; Os repórteres de rosa-RFP do FHF e do SHF, respectivamente, e a imunomarcação da pilha viva da proteína Cxcr4 da membrana de pilha, um marcador de SHF. Com esta aproximação, nós geramos as pilhas do progenitor que recapitular as propriedades funcionais e o transcriptoma de seus homólogos in vivo. Nosso protocolo pode ser utilizado para estudar a especificação adiantada e a segregação dos dois campos do coração e para gerar pilhas cardíacas câmara-específicas para a modelagem da doença cardíaca. Uma vez que este é um sistema organoide in vitro, não pode fornecer informações anatômicas precisas. No entanto, este sistema supera a má acessibilidade dos embriões de estágio de gastrulação e pode ser aumentado para telas de alta taxa de transferência.
Introduction
O uso de células-tronco pluripotentes (PSCs) revolucionou o campo de regeneração cardíaca e medicina personalizada com miócitos específicos do paciente para modelagem de doenças e terapias medicamentosas1,2,3, 4. mais recentemente, os protocolos in vitro para a geração de cardiomiócitos atrial vs ventricular, bem como de marca-passo-tipo PSC-derivados têm sido desenvolvidos5,6. No entanto, se a cardiogênese pode ser recriada in vitro para estudar o desenvolvimento cardíaco e, posteriormente, gerar células cardíacas específicas da câmara ventricular ainda não está clara.
Durante o desenvolvimento embrionário adiantado, as pilhas Mesodermal a influência de espécies secretado tais como BMP4, wnts e activin a formam a raia primitiva7. Células mesodérmicas cardíacas marcadas pela expressão de Mesp1, migram anterioramente e ultimamente para formar o crescente cardíaco e, em seguida, o tubo do coração primitivo7,8. Este grupo migratório de células inclui duas populações muito distintas de células progenitoras cardíacas (CPCS), ou seja, o primeiro e o segundo campo cardíaco (FHF e SHF)9,10. As células do SHF são altamente proliferativas e migratórias e são principalmente responsáveis pelo alongamento e looping do tubo cardíaco. Adicionalmente, as células de SHF diferenciam-se aos cardiomiócitos, fibroblastos, músculo liso e células endoteliais à medida que entram no tubo cardíaco para formar o ventrículo direito, o trato de saída do ventrículo direito e grande parte de ambos os átrios7,10. Em contrapartida, as células FHF são menos proliferativas e migratórias e diferenciam-se principalmente dos cardiomiócitos, pois dão origem ao ventrículo esquerdo e menor parte dos átrios11. Além disso, os progenitores de SHF são marcados pelaexpressão de Tbx1, FGF8, FGF10 e Six2 enquanto as células FHF expressam Hcn4 e Tbx511,12,13,14,15.
PSCs pode diferenciar-se a todas as três camadas do germe e subseqüentemente a todo o tipo da pilha no corpo4,16. Conseqüentemente, oferecem o potencial tremendo para compreender o desenvolvimento do coração e para modelar defeitos desenvolventes específicos tendo por resultado a doença cardíaca congenital, a causa a mais freqüente de defeitos de nascimento17. Um grande subgrupo de cardiopatia congênita inclui anormalidades cardíacas específicas da câmara,18,19. Entretanto, ainda incerto se estes originam do desenvolvimento anômalo do campo do coração. Além disso, dada a incapacidade de os cardiomiócitos proliferar após o nascimento, tem havido esforços extensivos para criar tecido cardíaco para a regeneração cardíaca1,7,20. Considerando as diferenças fisiológicas e morfológicas entre as câmaras cardíacas, a geração de tecido cardíaco específico da câmara utilizando PSCs é de importância significativa. Quando os avanços recentes na Cardiologia desenvolvente conduziram à geração robusta de pilhas cardíacas de PSCs, é ainda obscuro se os dois campos do coração podem ser induzidos em sistemas do PSC.
Para recapitular a cardiogênese in vitro e estudar a especificação e as propriedades de CPCS, utilizou-se previamente um sistema baseado na diferenciação de esferóides cardíacos derivados do PSC21,22,23,24. Recentemente, geramos células-tronco embrionárias do camundongo (mESCs) com repórteres GFP e RFP o controle do gene FHF Hcn4 e do gene SHF Tbx1, respectivamente (mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. Os mESCs diferenciados in vitro formaram esferóides cardíacos nos quais as células GFP + e RFP + apareceram de duas áreas distintas de células mesodérmicas e padronizadas de forma complementar. As células GFP + e RFP + resultantes exibiram características de FHF e SHF, respectivamente, determinadas por sequenciamento de RNA e análises clonais. Importante, usando mESCs carregando o Isl1-RFP Reporter (mESCIsl1-RFP), descobrimos que as células de SHF foram fielmente marcadas pela proteína de superfície celular CXCR4, e isso pode permitir o isolamento de células específicas do campo cardíaco sem transgenes. O protocolo atual descreverá a geração e o isolamento de CPCs de campo específico do coração de mESCs, que pode servir como uma ferramenta valiosa para estudar a doença cardíaca câmara-específica.
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Protocol
Nota: Geração in vitro de células progenitoras cardíacas do rato específicas do campo cardíaco (Figura 1).
1. manutenção dos ESCs do rato
- Cresça mESCs (mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-GFP, mescISL1-RFP)25 em 0,1% (p/v) frascos de T25 revestidos com gelatina em meio 2i (870 ml de meio essencial de Glascow mínimo (Gmem), 100 ml de soro fetal bovino (FBS), 10 ml de glutamax, 10 ml de aminoácidos não essenciais, 10 ml de sódio piruvato, 3 μL de beta-Mercaptoetanol, 20 μL de LIF (200 U/mL), 0,3 μM CHIR99021 e 0,1 μM PD0325901).
- Quando as células atingem 70-80% de confluência, enxágüe as células uma vez com solução tampão fosfato (PBS) e, em seguida, dissociar em células individuais, adicionando 1 mL de tripsina e incubando a 37 ° c por 3 min.
- Neutralize a tripsina adicionando 4 mL de FBS 10% no meio de águia modificada de Dulbecco (DMEM). Conte as células usando um contador de células automatizado.
- Centrífuga ~ 3 x 105 células por 3 min a 270 x g e temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante, ressuscitará as células em 5 ml de 2i médio e mas em 0,1% (w/v) gelatina revestido T25 frascos para manutenção.
2. geração de células progenitoras cardíacas usando esferóides cardíacos
- Centrifugador 2,5 x 106 células do passo 1,3 por 3 min a 270 x g e temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante e suspender as células em 25 mL de meio SFD (105 células/ml). Dependendo da escala do experimento, o número do mESC pode ser ajustado de acordo.
Nota: Meio SFD contém 715 mL de Iscove ' s modificado Dulbecco ' s Medium (IMDM), 250 mL de Ham ' s F12, 5 mL de N2-suplemento, 10 mL de B27 menos vitamina A, 5 mL de 10% (w/v) BSA (em PBS), 7,5 mL de GlutaMAX e 7,5 mL de penicilina-estreptomicina. Adicionar ácido ascórbico (50 mg/mL) e 3,9 x 10-3% (v/v) de monotioglicerol antes de usar. - Placa de suspensão da célula em 1 150 mm x 25 mm placa estéril e incubar a 37 ° c na incubadora de 5% CO2 para 48 h. os esferóides cardíacos devem ser formados dentro de 24 h.
- Colete todos os esferóides cardíacos formados e centrifugue por 3 min a 145 x g e temperatura ambiente para isolar seletivamente os esferóides e evitar células individuais.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender os esferóides em 25 mL de meio SFD com 1 ng/mL de activin A e 1,5 ng/mL de BMP4 para indução de diferenciação. Placa de esferóides na mesma 150 mm x 25mm estéril placa e incubar-los em 37 ° c na 5% CO2 incubadora para 40 h.
Nota: Diferentes concentrações de activin A (0-3 ng/mL) e BMP4 (0,5-2 ng/mL) podem ser usadas para otimização de diferenciação, dependendo da linha mESC. - Colete todos os esferóides cardíacos e centrifugue por 3 min a 145 x g e temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante e ressuscigar os esferóides em 25 mL de meio de SFD. Transfira o EBs redobrado em um acessório Ultrabaixa 75 cm2 frasco e incubar-os em 37 ° c na incubadora de 5% co2 para 48 h.
3. isolamento das células progenitoras cardíacas específicas do campo cardíaco usando repórteres fluorescentes
- Centrifugar esferóides cardíacos a 145 x g e temperatura ambiente por 3min e aspirar o sobrenadante. Adicionar 1 mL de tripsina e incubar a 37 ° c durante 3 min. Misture bem pipetando para dissociar as células.
- Adicionar 4 ml de FBS 10% em DMEM para inativar Trypsin e misture bem por pipetagem. Para remover o EBs não dissociado, filtre a mistura usando um filtro de 70 mm e Centrifugue as células filtradas por 3 min a 270 x g e temperatura ambiente.
- Para ordenar CPCs carregando repórteres fluorescentes (CPCs derivados de mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-GFP), aspirar o sobrenadante e acrescentar 500 μL de solução de triagem FACS (1% (v/v) FBS, 200 mm HEPES e 10 mm de EDTA em PBS) para ressuscição.
- Para remover todos os clusters de células antes da classificação, filtre as células novamente usando um tubo de 5 mL de poliestireno redondo de fundo com um filtro de célula de 40 μm. Mantenha as células no gelo até a triagem.
- Classifique as células para isolar Tbx1-CRE; CPCs positivos de rosa-RFP e HCN4-GFP usando um classificador de células ativados fluorescentes (FACS). Colete as células classificadas em 1 mL de FBS. Mantenha a amostra da célula e as células classificadas a 4 ° c.
4. isolação de pilhas cardíacas específicas do progenitor do campo do coração usando Cxcr4 como um marcador da proteína de superfície da pilha
- Para isolar os CPCs do primeiro campo do segundo coração com base na expressão do receptor de proteína de superfície Cxcr4, use a linha mESCIsl1-RFP. Aspirar o sobrenadante da etapa 3,3 e ressuspender os CPCs únicos em 300 μL de FBS 10% em PBS contendo 1:200 (Vol/Vol) PerCP-efluor 710 conjugado anticorpo Cxcr4.
- Incubar à temperatura ambiente para 5min e lave adicionando 1-2 mL de PBS frio. Centrifugue as únicas CPCs durante 3 min a 270 x g e a temperatura ambiente e lave mais duas vezes seguidas de centrifugação.
- Aspirar o sobrenadante e adicionar 500 μL de solução de triagem FACS para suspender os CPCs únicos e filtrar como na etapa 3,4.
- Isolar Cxcr4 + e Cxcr4-células usando FACS. Colete as células classificadas em 1 mL de FBS. Mantenha a amostra da célula e as células classificadas a 4 ° c.
5. análise de células progenitoras cardíacas específicas do campo cardíaco isolado
- Centrífuga classificado CPCs por 3 min em 270 x g e temperatura ambiente. As células classificadas podem ser usadas para análises de expressão de genes e proteínas ou podem ser reculturadas para análises em pontos de tempo posteriores.
- Para re-cultura CPCS isolados, aspirar o sobrenadante, ressuscitar as células em meio SFD e mas ~ 3 x 104 células por poço de uma placa 384-bem revestida com 0,1% (w/v) gelatina. Se o aumento da morte celular for observado após a triagem, adicione 10 μM de Y-27632 (inibidor de rocha) à amostra. Dois dias após o reculture, bater espontâneo deve ser anotado.
- Para analisar a capacidade de CPCs chapeados para diferenciar-se aos cardiomiócitos, colete as células no dia 12 de diferenciação. Use Trypsin como descrito nas etapas 1.2-1.5 para isolar o único CMs. ressuscite as células em 4% (p/v) paraformaldeído (PFA) e incubar por 30 min à temperatura ambiente para fixar as células.
- Centrifugue as células durante 3 min a 895 x ge a temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e suspender as células em PBS para lavar o PFA. Repita este passo mais uma vez.
- Aspirar o sobrenadante e suspender as células em 10% FBS em PBS. Incubar metade da amostra de células com anticorpo anti-troponina T de rato (1:500) e utilize o resto da amostra como um controlo negativo. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
- Lave as células duas vezes, conforme descrito na etapa 5,4 usando PBS. Aspirar o sobrenadante e ressuspender ambas as amostras de células em 10% FBS em PBS com 1:500 burro anti-mouse IgG (H + L) anticorpo secundário, Alexa fluor 647 conjugar. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
- Lave duas vezes com PBS como na etapa 5,6. Aspirar o sobrenadante e suspender as células em 200 μL de PBS. Use um citometro de fluxo para analisar as células.
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Representative Results
Após aproximadamente 132 h de diferenciação, os CPCs Tbx1-RFP e Hcn4-GFP podem ser detectados usando um microscópio fluorescente (Figura 2). Geralmente, as células GFP e RFP aparecem aproximadamente ao mesmo tempo. As duas populações de CPCs continuam a se expandir em estreita proximidade e comumente em um padrão complementar. O ajuste das concentrações de activin A e BMP4 alterará as porcentagens de FHF vs SHF CPCs (Figura 3). A especificação de CPC in vitro foi determinada principalmente pela concentração de BMP4. Conseqüentemente, nosso sistema esferóide cardíaco pode ser usado para estudar a especificação do CPC.
Da mesma forma usando o Isl1-RFP repórter mESC linha, após 132 h de diferenciação, Isl1-RFP + CPCs aparecem. Após imunocoloração de CPCs para CXCR4, Isl1-RFP +, Cxcr4 + vs Isl1-RFP +, Cxcr4-células podem ser isoladas (Figura 4).
Para analisar a capacidade de CPCs derivados de mESC para diferenciar-se aos cardiomiócitos, a imunomarcação para troponina T cardíaca pode ser realizada no dia 12 de diferenciação. De acordo com o modelo que as células FHF diferenciam principalmente para os miócitos, as células derivadas de Hcn4-GFP + CPCs são principalmente miogênicas (Figura 5A, B). Da mesma forma, as células derivadas de Isl1 +, CXCR4-CPCs também dão origem a cardiomiócitos em porcentagens muito mais elevadas em comparação com Isl1 +, CXCR4-CPCs (Figura 5C).
Ocasionalmente, os mESCs falham em diferenciar de forma eficiente e formam CPCs específicos do campo cardíaco de números muito baixos (Figura 6).
Figura 1 : Representação esquemática da especificação in vitro de células progenitoras cardíacas específicas do campo cardíaco. mESCs formam esferoides dentro 48 h. Em seguida, a exposição a activin A e BMP4 para 40 h levará à indução mesodérmica. As pilhas cardíacas do progenitor desenvolvem aproximadamente 36 h mais tarde. Os progenitores do segundo ou primeiro campo cardíaco podem ser classificados usando a classificação de células ativadas fluorescentes. As células do segundo campo do coração são marcadas pela expressão Tbx1-RFP versus primeiro campo cardíaco que são marcados por Hcn4-GFP. Alternativamente, Isl1-RFP marca CPCs e usando imunocoloração ao vivo contra Cxcr4 um pode classificar Isl1 +, Cxcr4 + vs Isl1 +, Cxcr4-CPCs que representam segundo vs primeiro campo de células do coração, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Imagem representativa de esferoides cardíacos após a especificação de CPC. O RFP marca Tbx1 + e o GFP marca Hcn4 + CPCs. As duas populações de células são formadas em estreita proximidade em um padrão complementar. Barras de escala = 50 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Análise citométrica do fluxo de esferóides cardíacos após exposição a diferentes concentrações de activin a e BMP4. O ajuste das concentrações dos dois morfogênios leva a diferentes porcentagens de Tbx1 + e Hcn4 + CPCs. As duas populações foram afetadas principalmente ajustando a concentração de BMP4. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Análise citométrica de fluxo de células progenitoras cardíacas expressando Isl1 e imunomanchadas para Cxcr4. Os progenitores cardíacos foram primeiramente fechados com base em sua expressão Isl1 e, em seguida, Isl1 +, Cxcr4 + vs Isl1 +, Cxcr4-células foram classificadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Análise citométrica do fluxo das pilhas derivadas dos CPCs campo-específicos do coração manchadas para o troponin cardíaco T. (A) consistente com o maior potencial miogênico das células FHF, uma alta porcentagem de células HCN4-GFP + diferencia-se dos miócitos. (B) análise de todos os cardiomiócitos derivados do mesc, onde a grande maioria é HCN4-GFP +. (C) Cxcr4-CPCS diferenciam-se em maior percentual de cardiomiócitos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Análises citométricas representativas de diferenciações in vitro com falha/baixa eficiência. (A) análise de citometria de fluxo após 132 h de diferenciação mostrando nenhuma formação de células HCN4-GFP e uma porcentagem muito baixa de TBX1-RFP + células. (B) baixa eficiência de diferenciação de mESCs expressando níveis muito baixos de Isl1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Em nosso protocolo, nós descrevemos uma metodologia para gerar esferoides cardíacos e CPCS campo-específicos isolados do coração. Esses podem ser usados para estudar mecanismos de especificação de CPC e suas propriedades, bem como para a modelagem da doença de câmara cardíaca específica. Um trabalho publicado anteriormente utilizou uma linha de mESC com dois repórteres fluorescentes (Mef2c/nkx 2.5) para estudar a cardiogênese in vitro, no entanto, ambos os marcadores são expressos no dia embrionário 9.5-10 quando os cardiomiócitos já são formados26. A nosso conhecimento, não há atualmente nenhum método para a isolação de CPCs campo-específicos do coração in vitro. Mais importante, nosso protocolo pode igualmente ser aplicado às pilhas de haste humanas, onde CXCR4 pode ser usado para isolar CPCs de SHF que expressam níveis elevados de Isl125. Além disso, nossa dupla, fluorescente repórter linha mESC pode ser usado para a tela de bibliotecas de compostos e fatores de transcrição que podem afetar a especificação do campo cardíaco ou polaridade celular em CPCs.
Uma das etapas críticas no protocolo é o número inicial de mESCs. O uso de números baixos ou altos afetará significativamente o tamanho dos esferóides cardíacos e a eficiência da diferenciação. Recomendamos testar números de células diferentes (7,5-10 x 104 células/ml) para diferentes linhas de mesc. Alternativamente, se o tamanho dos esferóides cardíacos permanece significativamente variável, placas com poços contendo micropoços de tamanho especificado também podem ser usadas para aumentar a reprodutibilidade. Os investigadores devem igualmente estar cientes do sincronismo e da duração específicos da indução Mesodermal assim como o sincronismo da classificação da pilha. Além disso, para diferentes linhas de mESC, a otimização das concentrações de morfogênios precisará ser realizada antes de testar sua capacidade de gerar CPCs em esferóides cardíacos. O uso de citocinas mais antigas/expiradas ou meio de cultura celular, ou concentrações inconsistentes de morfogênios afetará a eficiência de diferenciação. Finalmente, as linhas de mesc que foram é por mais de ~ 15-20 vezes, parecem perder sua habilidade de diferenciar-se eficientemente.
Nosso sistema de diferenciação permite modificações específicas. Cxcr4 pode ser usado como um único marcador de CPCs SHF em linhas mESC sem um repórter fluorescente. No entanto, os investigadores ainda devem otimizar o protocolo de diferenciação para aumentar a percentagem de Isl1 + CPCs antes da triagem Cxcr4 + vs Cxcr4-CPCs25. Além disso, activin A pode ser substituído por agonistas/ativadores WNT canônicos, como Wnt3a ou CHIR99021 (inibidor de GSK3b) para aumentar ainda mais a especificação de CPCs SHF25.
Este protocolo permite o estudo da especificação de CPC usando condições bem definidas, monitoramento de lapso de tempo e números irrestritos de células. Assim, é mais facile, eficiente e menos dispendioso em comparação com a análise de embriões. Não obstante, é ainda um sistema in vitro onde os valores absolutos da expressão de gene de CPCs específicos do coração-campo não possam correlacionar-se firmemente com níveis in vivo da expressão de Gene. Assim, em nosso sistema, apenas BMP4 poderia especificar CPCs de ambos os campos cardíacos e pode alterar significativamente suas respectivas proporções. Adicionalmente, a variabilidade pode existir em relação às eficiências de diferenciação.
Em conclusão, usando linhas de repórter fluorescentes mESC ou imunocoloração de proteínas da membrana celular, nós recapitulamos cardiogênese in vitro e isolados CPCs de campo específico do coração. Isso permite o estudo de sinais precoces que mediam a especificação de CPC e as propriedades funcionais, bem como a modelagem de doenças cardíacas congênitas de campo cardíaco/câmara específica.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgações.
Acknowledgments
E. T. foi apoiado por a magia que importa e AHA. C. K. foi apoiado por subvenções da NICHD/NIH (R01HD086026), AHA e MSCRF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100x Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1x PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 mL Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25 mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
References
- Laflamme, M. A., Murray, C. E.
- Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Birket, M. J., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective. Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Galdos, F. X., et al. Cardiac Regeneration: Lessons From Development. Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).
- Lescroart, F., et al. Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development. Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).
- Bruneau, B. G. Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).
- Bruneau, B. G., et al. Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome. Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).
- Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field. Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).
- Zhou, Z., et al. Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease. Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).
- Bruneau, B. G., Srivastava, D. Congenital heart disease: entering a new era of human genetics. Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).
- Li, L., et al. HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle. International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
- Uosaki, H., et al. Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, 02164 (2014).
- Morita, Y., et al. Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).
- Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326 (5951), 426-429 (2009).
