इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे मानव स्टेम सेल व्युत्पन्न ileal monolayers और उनके विकास का आकलन करने के लिए तरीकों में एम कोशिकाओं के भेदभाव प्रेरित करने के लिए.
आंत के एम (माइक्रोफोल्ड) कोशिकाओं को शीर्ष लुमेन से अंतर्निहित पेयर के पैच और लेमिना प्रोप्रिया में एंटीजन के परिवहन के लिए कार्य करता है जहां प्रतिरक्षा कोशिकाएं रहती हैं और इसलिए आंत में म्यूकोसल प्रतिरक्षा में योगदान देती हैं। एम कोशिकाओं आंत में अंतर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एम कोशिकाओं द्वारा प्रतिजन तेज के आणविक तंत्र की एक पूरी समझ की कमी है. इसका कारण यह है कि एम कोशिकाओं आंत में कोशिकाओं की एक दुर्लभ आबादी है और क्योंकि एम कोशिकाओं के लिए इन विट्रो मॉडल मजबूत नहीं हैं. आंत के एक आत्म नवीनीकरण स्टेम सेल संस्कृति प्रणाली की खोज, enteroids कहा जाता है, एम कोशिकाओं culturing के लिए नई संभावनाएं प्रदान की गई है. Enteroids मानक सुसंस्कृत सेल लाइनों पर फायदेमंद होते हैं क्योंकि उन्हें आंत में पाए जाने वाले कई प्रमुख सेल प्रकारों में विभेदित किया जा सकता है, जिसमें गोब्लेट कोशिकाएं, पैनेथ सेल, आंत्रअंती कोशिकाएं और आंत्रसाइट्स शामिल हैं। साइटोकिन RANKL एम सेल विकास में आवश्यक है, और RANKL और TNF-जेड के अलावा संस्कृति मीडिया के लिए एम कोशिकाओं में अंतर करने के लिए ileal enteroids से कोशिकाओं के एक सबसेट को बढ़ावा देता है. निम्नलिखित प्रोटोकॉल मानव ileal enteroids का उपयोग कर आंत के एक ट्रांसवेल उपकला polarized मोनोलेयर प्रणाली में एम कोशिकाओं के भेदभाव के लिए एक विधि का वर्णन करता है। इस विधि एम सेल विकास और समारोह के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है.
एम (माइक्रोफोल्ड) कोशिकाओं को मुख्य रूप से आंत से जुड़े उपकला (एफएई) में पाए जाने वाले विशेष आंत उपकला कोशिकाओं को आंत के अति-लीइंग छोटे लसीकाभ क्षेत्रों में पाया जाता है जिसे पीयर के पैच1कहा जाता है। एम कोशिकाओं में कम अनियमित शीर्ष माइक्रोविली होते हैं और उनके बासोपार्श्व पक्ष पर गहराई से अंतर्वेधित होते हैं, जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं को उनके कोशिका शरीर2के निकट रहने की अनुमति देता है। यह अद्वितीय आकृति विज्ञान एम कोशिकाओं को आंत के शीर्ष लुमेन से प्रतिजन का नमूना लेने में सक्षम बनाता है और इसे सीधे अंतर्निहित प्रतिरक्षा कोशिकाओं को वितरित करताहै 2. इस तरह, एम कोशिकाओं आंत में प्रतिरक्षा निगरानी के लिए महत्वपूर्ण हैं, लेकिन यह भी lamina प्रोप्रिया1,2,3,4,5में प्रवेश के लिए रोगजनकों द्वारा शोषण किया जा सकता है, 6,7.
एम कोशिकाओं के अध्ययन में कई कारकों द्वारा बाधा डाल दी गई है। सबसे पहले, एम कोशिकाओं माउस और मानव आंत8में एक कम आवृत्ति पर पाए जाते हैं। सुसंस्कृत कोशिकाओं प्रणालियों में, एम सेल की तरह कोशिकाओं को एक polarized एडेनोकार्सीनोमा सेल लाइन, Caco-2, या तो बी लिम्फोसाइटों के साथ माउस Peyer के पैच या बी सेल लिंफोमा सेल लाइन, रजी बी9,10 के सह-कुलिंग द्वारा अंतर करने के लिए प्रेरित किया गया है . इसका परिणाम यह होता है कि कैको-2 कोशिकाओं के एक सबसेट में जो एम सेल मार्कर सियाल लुईस ए एंटीजन और यूए-1 को ध्रुवित उपकला9,10में व्यक्त करते हैं . (इन मार्करों भी आंतों के ऊतकों में goblet कोशिकाओं पर व्यक्त कर रहे हैं, तो आजकल कम बार निश्चित एम सेल मार्करों11के रूप में उपयोग किया जाता है,12.) इस कैको-2-एम कोशिका प्रणाली का उपयोग कण-अपटेक तथा जीवाणु स्थानांतरण13,14का अध्ययन करने के लिए किया गया है। हालांकि, Caco-2 कोशिकाओं को एक बड़ी आंत्र एडेनोकार्सीनोमा से एक स्थापित सेल लाइन confounding कारक है कि Caco-2 कोशिकाओं के विभिन्न स्रोतों प्रयोगशालाओं के बीच विभिन्न phenotypes प्रदर्शित15के साथ कर रहे हैं. इसके अलावा, वे पूरी तरह से सच एम कोशिकाओं के प्रतिलेखन के स्तर recapitulate नहीं हो सकता है, क्योंकि वे वर्तमान में जाना जाता एम सेल मार्करों GP2 और SpiB16की अभिव्यक्ति की कमी है. इसलिए, अतिरिक्त और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक संस्कृति मॉडल एम सेल विकास और कार्यों का अध्ययन करने में सक्षम होने की जरूरत है.
पिछले दस वर्षों के भीतर, आंत के enteroid व्युत्पन्न मॉडल प्रणालियों के क्षेत्र में तेजी से प्रारंभिक खोज से आगे बढ़ रहा है कि आंतों स्टेम कोशिकाओं मानव आंतों बायोप्सी से व्युत्पन्न स्वयं को प्रचार और संस्कृति में स्वयं को नवीनीकृत कर सकता है 17 , 18. महत्वपूर्ण बात यह है कि विकास मीडिया से स्टेम सेल को बढ़ावा देने वाले कारकों को हटाने से इन स्टेम सेल संस्कृतियों को आंत में पाए जाने वाले कई कोशिकाओं में अंतर करने की अनुमति मिलतीहै . इसके अलावा, हाल के कार्य से पता चलता है कि आंत19,20में एम सेल विकास में RANKL-RANK संकेतन के महत्व को दर्शाता है। RANK रिसेप्टर रिसेप्टर्स के TNF परिवार का एक सदस्य है कि आंत में उपकला अग्रदूत कोशिकाओं पर व्यक्त किया जाता है19 जबकि RANKL (रैंक रिसेप्टर ligand) Peyer पैच20के stromal कोशिकाओं द्वारा जारी किया जाता है. चूँकि इलेल एंटरोइड्स में विद्यमान उपकला कोशिका प्रकार RANKL का उत्पादन नहीं करते हैं, इसलिए ऐलेल एंटरोइड संस्कृतियों में एम सेल विभेदन को संस्कृति माध्यम21,22में RANKL के योग द्वारा प्रेरित किया जा सकता है । संस्कृति मीडिया में टी एन एफ जेड को शामिल करने से एम सेल विकास को ileal enteroids23में समर्थन करने में मदद मिलती है. यहाँ, हम मानव ileal enteroids से व्युत्पन्न आंतों monolayers में एम कोशिकाओं के भेदभाव को प्रेरित करने के लिए तरीकों का वर्णन. हमारे तरीके निम्नलिखित प्रोटोकॉल21,22,23के संशोधनों पर आंशिक रूप से आधारित हैं .
मोनोलेयर्स विकसित करने के लिए जो प्रमुख आंत्र कोशिका प्रकार और एम कोशिकाओं में ठीक से अंतर करते हैं, कई कारकों के बारे में पता होना महत्वपूर्ण है। Ileal enteroids ECM संस्कृतियों है कि अलग अलग कर रहे हैं और Lgr5 + स्टेम कोशिकाओं के एक उच्च अनुपात से काटा जाना चाहिए. नेत्रहीन, ECM संस्कृतियों में ileal enteroids के बहुमत अंधेरा और multilobular नहीं होना चाहिए, और LGR5 अभिव्यक्ति QRT-पीसीआर विश्लेषण द्वारा इन संस्कृतियों में पता लगाया जाना चाहिए. वातानुकूलित मीडिया का गुणवत्ता नियंत्रण समय के साथ अलग-अलग संस्कृतियों के प्रचार के लिए आवश्यक है और निर्मित वातानुकूलित मीडिया के प्रत्येक बैच के लिए पूरा किया जाना चाहिए। गुणवत्ता नियंत्रण कुछ ECM संस्कृतियों पर मीडिया के एक नए बैच का परीक्षण और एक सप्ताह के दौरान मीडिया के पिछले बैच के लिए ileal enteroids की आकृति विज्ञान की तुलना द्वारा पूरा किया जा सकता है. LGR5 अभिव्यक्ति पिछले बैच की तुलना में मीडिया के नए बैच में विकसित ileal enteroid संस्कृतियों में अपेक्षाकृत समान रहना चाहिए.
मोनोलेयर्स के रूप में बोने के लिए ileal enteroids की तैयारी के दौरान, एकल कोशिकाओं में ileal enteroids को तोड़ने के लिए trypsin के साथ ऊष्मायन के बाद सेल समाधान को जोरदार रूप से पिपेट करना महत्वपूर्ण है। कोशिका क्लंप मोनोलेयर्स के लिए बीज होने पर बहु-परत गठन का कारण बन सकती है। इसके अलावा, यह अनुभवजन्य प्राप्त किया जाता है कि प्रत्येक व्यक्ति ileal enteroid लाइन के लिए एक मोनोलेयर बनाने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए आवश्यक है। आमतौर पर, यह मान 2.5 x 105 – 5.0 x 105 कोशिकाओं/अच्छी तरह से से रेंज कर सकते हैं, लेकिन संस्कृतियों में गैर सिस्टिक ileal enteroids के लिए सिस्टिक की डिग्री पर निर्भर करता है और प्रत्येक व्यक्ति ileal enteroid लाइन के लिए भिन्न होता है। अनुभव से, ईसीएम में उगाए गए ileal enteroids जो कम सिस्टिक दिखाई देते हैं, मोनोलेयर्स को प्राप्त करने के लिए उच्च कोशिका सीडिंग घनत्व की आवश्यकता होती है। यह सलाह दी जाती है कि विकास के 1 दिन के बाद ऊपरी कक्ष को धीरे से मीडिया को 2-3 बार ऊपर और नीचे पाइप लेट कर और ताजा विकास मीडिया के साथ बदल दें। यह प्रक्रिया उन कोशिकाओं को उखाड़ देती है जो बहु-परत गठन की संभावना को कम करते हुए अन्य कोशिकाओं के शीर्ष पर पहुंच गई हैं। विकास मीडिया से एम सेल मीडिया के लिए ऊपरी कक्ष में मीडिया स्विचिंग जब monolayers $ 80% confluent, जो आम तौर पर दिन 2 के बाद बीजाई में होता है, अच्छा एम सेल भेदभाव को प्राप्त करने में मदद करता है. एम सेल प्रेरण के दौरान ऊपरी कक्ष में RANKL/TNF के अलावा मोनोलेयर प्रति एम कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के विकास के लिए नेतृत्व नहीं करता है और इसलिए ऊपरी कक्ष मीडिया से बाहर छोड़ दिया जा सकता है। एम सेल विकास को प्रभावित किए बिना इस प्रोटोकॉल में अलग-अलग छिद्र आकारों के ट्रांसवेल्स का उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, सेल बोने घनत्व बड़ा pores आकार के साथ उन लोगों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. कोलेजन चतुर्थ transwells या अच्छी तरह से प्लेटें जो बेहतर कुछ अनुप्रयोगों के लिए अनुकूल हो सकता है के लिए एक तहखाने झिल्ली प्रोटीन कोटिंग के रूप में ECM के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है.
ट्रांसवेल्स पर इलियाल एंटॉइड व्युत्पन्न मोनोलेयर्स एक दो-कक्ष प्रणाली प्रदान करते हैं जो परिभाषित शीर्ष और बासोटोपार्श्व सतहों के निर्माण के लिए अनुमति देता है ताकि 4-5 विभिन्न प्रकार की उपकला आंतों की कोशिकाओं को प्रत्येक पर सतह मार्करों को व्यक्त करने के लिए polarize कर सकते हैं आंत में पाया गया है कि के सापेक्ष पक्ष. अतिरिक्त कारकों ऐसे कणों, संक्रामक एजेंटों, या अन्य सेल प्रकार के रूप में दोनों ओर जोड़ा जा सकता है. हालांकि, आज तक कुछ सीमाएं बनी हुई हैं। जैसा कि वर्णित है, इस प्रणाली एक स्थिर प्रणाली है कि शारीरिक प्रवाह का अभाव है, आंतों के संकुचन, और आंतों की सामग्री. इसके अलावा, एक फ्लैट मोनोलेयर के गठन से गांव-क्रिप्ट वास्तुकला खो जाती है। इन प्रणालियों Peyer पैच क्षेत्रों की कमी है, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, और stromal कोशिकाओं. क्या एम कोशिकाओं के नीचे निकट रहने वाली प्रतिरक्षा और स्ट्रॉमल कोशिकाओं की कमी इस प्रणाली और अन्य शारीरिक कामकाज में नहीं देखी गई invaginations को प्रभावित करती है, जांच का एक महत्वपूर्ण भविष्य क्षेत्र है। इस प्रोटोकॉल एक 96 अच्छी तरह से प्लेट या एक बहु अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. ईसीएम के साथ 96-वेल प्लेट कोटिंग और ileal enteroids से एकल कोशिकाओं के साथ बोने के लिए प्रक्रिया transwells के लिए के रूप में ही रहता है. मोनोलेयर्स प्राप्त करने के लिए आवश्यक सेल सीडिंग घनत्व का टिट्रेशन किया जाना चाहिए, लेकिन आम तौर पर 1.0 x 105 – 3.0 x 105 कोशिकाओं/अच्छी तरह से एक 96-वेल प्लेट प्रारूप में से पर्वतमाला। एम कोशिकाओं एम सेल मीडिया के साथ विकास मीडिया की जगह जब monolayers 80% confluent आम तौर पर दिन 1-3 प्रारंभिक सेल बोने घनत्व के आधार पर कर रहे हैं द्वारा प्रेरित कर रहे हैं.
इन विट्रो में इलेल एंटोइड्स से एम कोशिकाओं को अलग करने की यह विधि कैको-2 विधि पर महत्वपूर्ण सुधार प्रदान करती है। इलेल एंटॉइड प्राथमिक कोशिकाएं होती हैं और सिस्टम में कम से कम 4-5 उपकला कोशिकाएं प्रकार मौजूद होती हैं। इसके अलावा, विभिन्न लोगों से व्युत्पन्न ileal enteroid लाइनों कैसे आनुवंशिकी या रोग राज्य एम कोशिका विकास और व्यवहार को प्रभावित करने की जांच करने के लिए अध्ययन किया जा सकता है। एम सेल विभेदन के दौरान इलेल एंटरोइड्स का अतिरिक्त हेरफेर एम सेल विकास की बेहतर समझ की अनुमति देगा जिसमें एम सेल अग्रदूत कोशिकाओं की विशेषता शामिल है। अंत में, चूंकि एम सेल फागोसाइटोसिस और ट्रांससाइटोसिस के आणविक तंत्र अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं3,29, इस मॉडल का अध्ययन करने और एम कोशिकाओं द्वारा प्रतिजन और कण तेज कल्पना करने का अवसर प्रदान करता है.
The authors have nothing to disclose.
इस काम को NIAID U19AI131126 द्वारा डॉ इसबर्ग (टफ्ट्स यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन) और डॉ काप्लान (टफ्ट्स विश्वविद्यालय) द्वारा समर्थित किया गया था; (जेएम परियोजना 2 नेता है) और NIAID R21AI128093 जेएम के लिए. ACF भाग में NIAID T32AI007077 द्वारा समर्थित किया गया था. SEB और MKE NIAID U19AI116497-05 द्वारा समर्थित थे. हम उपयोगी विचार विमर्श के लिए Tufts विश्वविद्यालय स्कूल ऑफ मेडिसिन में Mecsas प्रयोगशाला, एनजी प्रयोगशाला, और डॉ Isberg के सदस्यों को धन्यवाद। confocal इमेजिंग तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान के लिए Tufts केंद्र में प्रदर्शन किया गया था, P30 NS047243.
[Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: PBS Stock Concentration: 10 µM Final Concentration: 10 nM |
0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | For breaking up ECM Solvent: PBS Stock Concentration: 0.5 M Final Concentration: 0.5 mM |
40 µm cell strainer | Corning | 352340 | For excluding clumps from single cells Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
A-8301 | Sigma-Aldrich | SML0788-5MG | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: DMSO Stock Concentration: 500 µM Final Concentration: 500 nM |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-028 | MCMGF+ and DM Basal medium Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A-11005 | For secondary stain Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: 1:200 |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | Optional secondary stain for F-actin Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: 1:100 |
B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: Stock Concentration: 50x Final Concentration: 1x |
Bovine Serum Albumin | Chem-Impex | 00535 | 5% for blocking solution Solvent: PBS Stock Concentration: Final Concentration: 0.01 |
Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | For RNA isolation Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Circle coverslips | Thomas Scientific | 1157B50 | For mounting membrane on glass slide Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher | 62247 | For secondary stain Solvent: PBS Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
DEPC Treated RNAse free H2O | Fisher Scientific | BP561-1 | For RNA isolation Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
DNA Removal Kit | Invitrogen | AM1906 | For RNA isolation Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Ethyl Alcohol, 200 proof | Sigma Aldrich | EX0276-4 | For RNA isolation Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Feather Scalpels | VWR | 100499-580 | For cutting membrane from transwells Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | For inactivating trypsin Solvent: Advanced DMEM/F12 Stock Concentration: 1 Final Concentration: 0.1 |
Glass slides | Mercedes Scientific | MER 7200/90/WH | For mounting membrane on glass slide Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: Stock Concentration: 200 mM Final Concentration: 2 mM |
GP2 Antibody | MBL International | D277-3 | Surface stain for M cells Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: 1:100 |
HEPES | Invitrogen | 15630-080 | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: Stock Concentration: 1 M Final Concentration: 10 mM |
Human Serum IgA | Lee BioSolutions | 340-12-1 | For functional analysis of M cells Solvent: PBS Stock Concentration: 1 mg/mL Final Concentration: 10 µg |
L-Wnt3a conditioned media | Cell line from ATCC | CRL-2647 | Refer to ATCC Product Sheet for L Wnt3A (ATCC CRL2647) for conditioned media protocol; MCMGF+ ingredient Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: 75% in MCMGF+ 0% in DM |
Matrigel, GFR, phenol free | Corning | 356231 | Extracellular Matrix (ECM) Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Mouse recombinant EGF | Invitrogen | PMG8043 | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: PBS Stock Concentration: 50 µg/mL Final Concentration: 50 ng/mL |
N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: H2O Stock Concentration: 500 mM Final Concentration: 1 mM |
Noggin conditioned media | Cell line gift from Dr. Gijs van den Brink (University of Amsterdam) | Ref 30 for conditioned media protocol; MCMGF+ and DM Ingredient Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: 5% in MCMGF+ 5% in DM |
|
Paraformaldehyde (PFA) | MP Biomedicals | 2199983 | For fixing monolayers Solvent: PBS Stock Concentration: 0.16 Final Concentration: 0.04 |
PBS, -Mg, -Ca | Corning | MT21040CV | Solvent for 0.5 mM EDTA Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Optional ingredient of MCMGF+ and DM Solvent: Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
Prolong Gold | Invitrogen | P36930 | Antifade mounting solution Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Qiagen RNeasy Kit | Qiagen | 74106 | For RNA isolation Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Recombinant human RANKL | Peprotech | 310-01 | Used to induce M cells Solvent: H2O Stock Concentration: 0.1 mg/mL Final Concentration: 200 ng/mL |
Recombinant murine TNFa | Peprotech | 315-01A | Used to induce M cells Solvent: H2O Stock Concentration: 5 mg/mL Final Concentration: 50 ng/mL |
R-spondin conditioned media | Cell line from Trevigen | 3710-001-01 | Refer to Trevigen Cultrex Rspo1 Cells product manual (HA-R-Spondin1 293T cell line) for conditioned media protocol; MCMGF+ Ingredient Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: 10% in MCMGF+ 0% in DM |
Secondary anti-human IgA antibody | Jackson Immuno Research | 109-545-011 | For secondary stain Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: 1:200 |
Super Script IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18091200 | For conversion of RNA to DNA Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Transwell inserts, 24 well-sized | Greiner Bio-One | 662641 | 0.4 µm pore size Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Not required during GP2 primary stain Solvent: 1% BSA Stock Concentration: Final Concentration: 0.001 |
TRIzol | Invitrogen | 15596018 | For RNA isolation Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
TrypLE Express | Invitrogen | 12605010 | Trypsin for breaking up enteroids into single cells Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y-0503 | MCMGF+ ingredient on day 0 Solvent: H2O Stock Concentration: 5 mM Final Concentration: 10 µM |
GAPDH forward primer | CATGAGAAGTATGACAACAGCCT | ||
GAPDH reverse primer | CGTTTCCCGCAAGACGTAAC | ||
GP2 forward primer | CAATGTGCCTACCCACTGGA | ||
GP2 reverse primer | ATGGCACCCACATACAGCAC | ||
LYZ forward primer | CGCTACTGGTGTAATGATGG | ||
LYZ reverse primer | TTTGCACAAGCTACAGCATC | ||
MUC2 forward primer | ATGCCCTTGCGTCCATAACA | ||
MUC2 reverse primer | AGGAGCAGTGTCCGTCAAAG | ||
SI forward primer | TCCAGCTACTACTCGTGTGAC | ||
SI reverse primer | CCCTCTGTTGGGAATTGTTCTG | ||
SPIB forward primer | CAGCAGCCGCTTTTAGCCAC | ||
SPIB reverse primer | GCATATGCCGGGGGAACC |