이 프로토콜은 인간 줄기 세포 유래 장전 단층 및 그들의 발달을 평가하는 방법에서 M 세포의 분화를 유도하는 방법을 기술한다.
M (마이크로 폴드) 장의 세포는 면역 세포가 상주하고 따라서 장의 점막 면역에 기여 기본 Peyer의 패치와 라미나 프로피아에 정점 루멘에서 항원을 수송하는 기능. M 세포가 장에서 어떻게 분화하는지, 그리고 M 세포에 의한 항원 섭취의 분자 메커니즘에 대한 완전한 이해가 부족합니다. 이것은 M 세포가 창자에 있는 세포의 희소한 인구이고 M 세포를 위한 시험관 내 모형이 튼튼하지 않기 때문에 입니다. 장의 자기 갱신 줄기 세포 배양 시스템의 발견, 엔터노이드라고, M 세포를 배양하기위한 새로운 가능성을 제공하고있다. 엔테로이드는 고독세포, 판세포, 엔테엔도크린 세포 및 장세포를 포함한 여러 주요 세포 유형으로 분화될 수 있기 때문에 표준 배양 세포주에 비해 유리하다. 사이토카인 RANKL은 M 세포 개발에 필수적이며, 배양 배지에 RANKL 및 TNF-α를 첨가하면 장색장세포로부터 세포의 서브세트를 촉진하여 M 세포로 분화한다. 이하의 프로토콜은 인간 장전균을 이용한 장의 트랜스웰 상피 편광 단층 시스템에서 M 세포의 분화를 위한 방법을 설명한다. 이 방법은 M 세포 개발 및 기능의 연구에 적용될 수 있다.
M(microfold) 세포는 Peyer의 패치1이라고 불리는 작은 림프성 영역의 여포 관련 상피(FAE)에서 주로 발견되는 장상피세포입니다. M 세포는 짧은 불규칙한 정점 microvilli가 있고 면역 세포가 그들의 세포 체에 밀접하게 상주하는 것을 허용하는 그들의 basolateral 측에 깊이 질착됩니다2. 이 독특한 형태는 M 세포가 장의 정점 루멘에서 항원을 샘플링하고 기본 면역세포 2에 직접 전달 할 수 있게합니다. 이런 식으로, M 세포는 장에서 면역 감시를 위해 중요하지만 또한 라미나 프로피아 1, 2,3,4,5에진입을위한 병원체에 의해 이용될 수 있습니다. 6,7.
M 세포의 연구는 여러 가지 요인에 의해 방해되었습니다. 첫째, M 세포는 마우스와 인간 장에서 낮은 주파수에서발견된다 8. 배양 된 세포 시스템에서, M 세포 와 같은 세포는 마우스 Peyer의 패치 또는 B 세포 림프종 세포 주에서 B 림프구, 라지 B9,10중 하나를 편광 선암 세포 주, Caco-2를 공동 배양하여 분화하도록 유도되었습니다. . 이는 편광상피9,10에서M 세포 마커 시릴 루이스 A 항원 및 UEA-1을 발현하는 카코-2 세포의 서브세트를 초래한다. (이 마커는 또한 장 조직에서 잔 세포에 발현됩니다, 그래서 요즘은 결정적인 M 세포 마커로 보다 적게 빈번히 사용됩니다11,12.) 이 Caco-2-M 세포 시스템은 입자 섭취량 과 박테리아 전좌13,14를연구하는 데 사용되어 왔다. 그러나, Caco-2 세포는 카코-2 세포의 상이한 공급원이 실험실들사이에서 상이한 표현형을 나타내는 혼란스러운 인자를 가진 대장 선암으로부터 확립된 세포주(15)이다. 또한, 그들은 현재 알려진 M 세포 마커 GP2 및 SpiB16의발현이 부족하기 때문에 진정한 M 세포의 전사 수준을 완전히 재현하지 못할 수 있다. 따라서, M 세포 발달 및 기능을 연구할 수 있도록 추가적으로 더 생리학적으로 관련된 배양 모델이 필요하다.
지난 10 년 이내에, 장의 장 유래 모델 시스템의 필드는 급속하게 인간의 장 생검에서 파생 된 장 줄기 세포가 자기 전파 및 배양에서 자기 갱신 할 수 있다는 초기 발견에서 앞으로 진행하고있다 17세 , 18.중요한 것은, 성장 배지로부터 줄기세포 촉진 인자를 제거함으로써 이들 줄기세포 배양이장18에서발견되는 많은 세포 유형으로 분화할 수 있게 한다. 더욱이, 최근 연구는 소장19,20에서M 세포 발달에서 RANKL-RANK 신호의 중요성을 시사한다. RANK 수용체는 소장(19)에서 상피 전구세포상에서 발현되는 수용체의 TNF 패밀리의 구성원이며 RANKL(RANK 수용체 리간드)은 Peyer’s패치(20)의기질 세포에 의해 방출된다. 장액장내 세포 유형이 RANKL을 생성하지 않기 때문에, M 세포 분화는 장전장 내 장내 배양물에서 RANKL을 배양배지(21,22)에첨가함으로써 유도될 수 있다. 배양 배지에 TNFα를 포함시키는 것은 장골 장수(23)에서 M 세포 발달을 지원하는 데 도움이 된다. 여기서, 우리는 인간 장폐색 장용체에서 유래된 장 단층에서 M 세포의 분화를 유도하는 방법을 기술한다. 우리의 방법은 다음 프로토콜21,22,23의수정에 부분적으로 기초한다.
주요 장 세포 유형과 M 세포로 제대로 분화하는 단층을 개발하려면 여러 가지 요인을 인식하는 것이 중요합니다. Ileal 장신구는 미분화되고 Lgr5+ 줄기 세포의 높은 비율을 가진 ECM 배양물에서 수확되어야 합니다. 시각적으로, ECM 배양내의 장색장체의 대다수는 어둡게 하고 다동체가 되어서는 안 되며, LGR5 발현은 qRT-PCR 분석에 의해 이러한 배양물에서 검출되어야 한다. 컨디셔닝 된 매체의 품질 관리는 시간이 지남에 따라 미분화 배양물의 전파에 필수적이며 생산되는 컨디셔닝 된 미디어의 각 배치에 대해 완료되어야합니다. 일부 ECM 배양물에서 새로운 배지 배치를 테스트하고 장전장장내체의 형태를 일주일 동안 의 이전 미디어 배치와 비교하여 품질 관리를 완료할 수 있습니다. LGR5 발현은 이전 배치에 비해 새로운 배지 배치에서 성장한 장색 장색 배양에서 상대적으로 유사하게 유지되어야 한다.
단층으로 파종을 위한 장색 장용체를 제조하는 동안, 트립신과 함께 배양 후 세포 용액을 활발하게 피펫하여 장골 장신구를 단일 세포로 분해하는 것이 중요하다. 세포 덩어리는 단층을 위해 시드될 때 다층 형성으로 이끌어 낼 수 있습니다. 또한, 수득되는 각각의 개별 장골 장신구 라인에 대해 단층을 형성하는 데 필요한 셀의 수를 경험적으로 결정하는 것이 필수적이다. 전형적으로, 이 값은 2.5 x 10 5에서 구역 수색할 수 있습니다 – 5.0 x 105 세포/well/well 그러나 배양에 있는 비 낭포성 장골 장용에 낭포의 정도에 따라 달라지고 각 개별 장골 장용선에 대해 변화합니다. 경험에서, 덜 낭포성 나타나는 ECM에서 자란 장색 장체는 단층을 달성하기 위하여 더 높은 세포 종자 조밀도를 요구합니다. 성장 1 일 후 상부 챔버를 부드럽게 2-3 회 위아래로 파이프하고 신선한 성장 매체로 교체하여 상부 챔버를 세척하는 것이 좋습니다. 이 프로세스는 다층 형성의 가능성을 감소시키는 그밖 세포의 위에 착륙한 세포를 박탈합니다. 단층이 ~80% 동시성일 때 성장 매체에서 M 세포 매체로 상부 챔버내의 매체를 전환하면, 보통 2일째 에 발생하는 사후 시드, 좋은 M 세포 분화를 달성하는 데 도움이 된다. M 세포 유도 동안 상부 챔버에 RANKL/TNFα를 첨가하면 단층당 더 많은 수의 M 세포의 발달을 유도하지 않으므로 상부 챔버 매체에서 제외될 수 있다. 다양한 기공 크기의 트랜스웰은 M 세포 발달에 영향을 미치지 않고 이 프로토콜에서 사용될 수 있습니다. 그러나, 세포 파종 밀도는 더 큰 공극 크기를 가진 사람들을 위해 최적화되어야 합니다. 콜라겐 IV는 특정 용도에 더 적합할 수 있는 트랜스웰 또는 웰 플레이트의 지하 막 단백질 코팅으로 ECM을 대체할 수 있습니다.
트랜스웰에 Ileal 장용 유래 단층은 4-5 가지 유형의 상피 장 세포가 각각표면 마커를 발현하도록 편광 할 수 있도록 정의 된 정점 및 바소 측표면의 생성을 허용하는 2 챔버 시스템을 제공합니다. 장에서 발견되는 것과 관련이 있습니다. 추가 요인은 입자, 전염하는 에이전트, 또는 그밖 세포 모형과 같은 어느 쪽에 추가될 수 있습니다. 그러나 현재까지 몇 가지 제한 사항이 남아 있습니다. 설명한 바와 같이,이 시스템은 생리적 흐름, 장 수축 및 장 내용이 부족한 정적 시스템입니다. 또한, 빌루스 토굴 아키텍처는 평면 단층의 형성에 의해 손실된다. 이 시스템은 Peyer의 패치 지구, 면역 세포 및 기질 세포가 부족합니다. M 세포 의 밑에 밀접하게 거주하는 면역과 기질 세포의 부족이 이 체계및 그밖 생리적인 작용에서 관찰되지 않는 질의에 영향을 미치는지 여부는 조사의 중요한 미래 지역입니다. 이 프로토콜은 96웰 플레이트 또는 멀티 웰 플레이트 형식으로 조정할 수 있습니다. ECM으로 96 웰 플레이트를 코팅하고 장골 장신구에서 단일 세포로 파종하는 절차는 트랜스웰과 동일하게 유지됩니다. 단층을 얻기 위하여 요구된 세포 파종 조밀도의 적정은 행해져야 합니다, 그러나 전형적으로 96 웰 격판덮개 형식에 있는 1.0 x 105 – 3.0 x 105 세포/잘 범위. M 세포는 초기 세포 파종 밀도에 따라 단층이 80% 동시일 때 성장 매체를 M 세포 매체로 대체함으로써 전형적으로 1-3일까지 동시적으로 결합된다.
시험관 내 장색장장으로부터 M 세포를 분화시키는 이 방법은 Caco-2 방법에 비해 상당한 개선을 제공한다. 장골 장색제는 1차 세포이고 적어도 4-5개의 상피 세포 유형은 시스템에 존재한다. 또한, 상이한 사람으로부터 유래된 장색장선은 유전학 또는 질병 상태가 M 세포 발달 및 행동에 어떤 영향을 미치는지 조사하기 위해 연구될 수 있다. M 세포 분화 동안 장색장세포의 추가 조작은 M 세포 전구세포를 특성화하는 것을 포함하는 M 세포 발달에 대한 더 나은 이해를 가능하게 할 것이다. 마지막으로, M 세포 식균증 및 백질 세포증의 분자 메커니즘이 아직완전히 이해되지 않기 때문에 3,29,이 모델은 M 세포에 의한 항원 및 입자 섭취를 연구하고 시각화 할 수있는 기회를 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 박사 이스버그에 NIAID U19AI131126에 의해 지원되었다 (의학의 터프츠 대학) 박사 카플란 (터프츠 대학); (JM은 프로젝트 2 리더) 및 NIAID R21AI128093에서 JM으로. ACF는 NIAID T32AI007077에 의해 부분적으로 지원되었습니다. SEB와 MKE는 NIAID U19AI116497-05에 의해 지원되었습니다. 우리는 유용한 토론을 위한 Tufts 대학 의과 대학에 Mecsas 실험실, Ng 실험실 및 박사 이스버그의 일원에게 감사합니다. 공초점 화상 진찰은 신경과학 연구를 위한 Tufts 센터, P30 NS047243에서 수행되었습니다.
[Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: PBS Stock Concentration: 10 µM Final Concentration: 10 nM |
0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | For breaking up ECM Solvent: PBS Stock Concentration: 0.5 M Final Concentration: 0.5 mM |
40 µm cell strainer | Corning | 352340 | For excluding clumps from single cells Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
A-8301 | Sigma-Aldrich | SML0788-5MG | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: DMSO Stock Concentration: 500 µM Final Concentration: 500 nM |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-028 | MCMGF+ and DM Basal medium Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A-11005 | For secondary stain Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: 1:200 |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | Optional secondary stain for F-actin Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: 1:100 |
B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: Stock Concentration: 50x Final Concentration: 1x |
Bovine Serum Albumin | Chem-Impex | 00535 | 5% for blocking solution Solvent: PBS Stock Concentration: Final Concentration: 0.01 |
Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | For RNA isolation Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Circle coverslips | Thomas Scientific | 1157B50 | For mounting membrane on glass slide Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher | 62247 | For secondary stain Solvent: PBS Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
DEPC Treated RNAse free H2O | Fisher Scientific | BP561-1 | For RNA isolation Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
DNA Removal Kit | Invitrogen | AM1906 | For RNA isolation Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Ethyl Alcohol, 200 proof | Sigma Aldrich | EX0276-4 | For RNA isolation Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Feather Scalpels | VWR | 100499-580 | For cutting membrane from transwells Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | For inactivating trypsin Solvent: Advanced DMEM/F12 Stock Concentration: 1 Final Concentration: 0.1 |
Glass slides | Mercedes Scientific | MER 7200/90/WH | For mounting membrane on glass slide Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: Stock Concentration: 200 mM Final Concentration: 2 mM |
GP2 Antibody | MBL International | D277-3 | Surface stain for M cells Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: 1:100 |
HEPES | Invitrogen | 15630-080 | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: Stock Concentration: 1 M Final Concentration: 10 mM |
Human Serum IgA | Lee BioSolutions | 340-12-1 | For functional analysis of M cells Solvent: PBS Stock Concentration: 1 mg/mL Final Concentration: 10 µg |
L-Wnt3a conditioned media | Cell line from ATCC | CRL-2647 | Refer to ATCC Product Sheet for L Wnt3A (ATCC CRL2647) for conditioned media protocol; MCMGF+ ingredient Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: 75% in MCMGF+ 0% in DM |
Matrigel, GFR, phenol free | Corning | 356231 | Extracellular Matrix (ECM) Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Mouse recombinant EGF | Invitrogen | PMG8043 | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: PBS Stock Concentration: 50 µg/mL Final Concentration: 50 ng/mL |
N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: H2O Stock Concentration: 500 mM Final Concentration: 1 mM |
Noggin conditioned media | Cell line gift from Dr. Gijs van den Brink (University of Amsterdam) | Ref 30 for conditioned media protocol; MCMGF+ and DM Ingredient Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: 5% in MCMGF+ 5% in DM |
|
Paraformaldehyde (PFA) | MP Biomedicals | 2199983 | For fixing monolayers Solvent: PBS Stock Concentration: 0.16 Final Concentration: 0.04 |
PBS, -Mg, -Ca | Corning | MT21040CV | Solvent for 0.5 mM EDTA Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Optional ingredient of MCMGF+ and DM Solvent: Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
Prolong Gold | Invitrogen | P36930 | Antifade mounting solution Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Qiagen RNeasy Kit | Qiagen | 74106 | For RNA isolation Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Recombinant human RANKL | Peprotech | 310-01 | Used to induce M cells Solvent: H2O Stock Concentration: 0.1 mg/mL Final Concentration: 200 ng/mL |
Recombinant murine TNFa | Peprotech | 315-01A | Used to induce M cells Solvent: H2O Stock Concentration: 5 mg/mL Final Concentration: 50 ng/mL |
R-spondin conditioned media | Cell line from Trevigen | 3710-001-01 | Refer to Trevigen Cultrex Rspo1 Cells product manual (HA-R-Spondin1 293T cell line) for conditioned media protocol; MCMGF+ Ingredient Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: 10% in MCMGF+ 0% in DM |
Secondary anti-human IgA antibody | Jackson Immuno Research | 109-545-011 | For secondary stain Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: 1:200 |
Super Script IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18091200 | For conversion of RNA to DNA Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Transwell inserts, 24 well-sized | Greiner Bio-One | 662641 | 0.4 µm pore size Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Not required during GP2 primary stain Solvent: 1% BSA Stock Concentration: Final Concentration: 0.001 |
TRIzol | Invitrogen | 15596018 | For RNA isolation Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
TrypLE Express | Invitrogen | 12605010 | Trypsin for breaking up enteroids into single cells Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y-0503 | MCMGF+ ingredient on day 0 Solvent: H2O Stock Concentration: 5 mM Final Concentration: 10 µM |
GAPDH forward primer | CATGAGAAGTATGACAACAGCCT | ||
GAPDH reverse primer | CGTTTCCCGCAAGACGTAAC | ||
GP2 forward primer | CAATGTGCCTACCCACTGGA | ||
GP2 reverse primer | ATGGCACCCACATACAGCAC | ||
LYZ forward primer | CGCTACTGGTGTAATGATGG | ||
LYZ reverse primer | TTTGCACAAGCTACAGCATC | ||
MUC2 forward primer | ATGCCCTTGCGTCCATAACA | ||
MUC2 reverse primer | AGGAGCAGTGTCCGTCAAAG | ||
SI forward primer | TCCAGCTACTACTCGTGTGAC | ||
SI reverse primer | CCCTCTGTTGGGAATTGTTCTG | ||
SPIB forward primer | CAGCAGCCGCTTTTAGCCAC | ||
SPIB reverse primer | GCATATGCCGGGGGAACC |