यहाँ प्रस्तुत एक सरल करने के लिए उपयोग, कोर / खोल, खोखले पाड़ के एक कदम निर्माण के लिए तीन आयामी bioprinting सेट अप, संवहनी और अन्य ट्यूबलर संरचनाओं के ऊतक इंजीनियरिंग के लिए उपयुक्त है.
कोर/शेल फिलामेंट के तीन आयामी (3 डी) मुद्रण एक स्थिर खोल के साथ चैनल संरचनाओं के प्रत्यक्ष निर्माण की अनुमति देता है जो तरल कोर के साथ इंटरफेस पर क्रॉस-लिंक किया जाता है। बाद के बाद मुद्रण हटा दिया जाता है, एक खोखले ट्यूब के पीछे छोड़. एक योज्य विनिर्माण तकनीक को एकीकृत करना (जैसे दर्जी के साथ यहाँ वर्णित [बायो]inks, जो संरचनात्मक और जैव रासायनिक रूप से देशी extracellular मैट्रिक्स की नकल [ECM]) उन्नत ऊतक इंजीनियरिंग की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है. हालांकि, अच्छी तरह से परिभाषित संरचनाओं के सटीक निर्माण के लिए उपयोग में सामग्री के लिए अनुकूलित निर्माण रणनीतियों की आवश्यकता होती है। इसलिए, यह अनुकूलन योग्य है कि एक सेट अप के साथ शुरू करने के लिए समझदार है, सरल करने के लिए उपयोग, और सामग्री और अनुप्रयोगों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के साथ संगत. यह काम वुडपाइल संरचनाओं के कोर/शेल प्रिंटिंग का पता लगाने के लिए लुअर-संगतता के साथ एक आसान-से-निर्माण कोर/शेल नोजल प्रस्तुत करता है, जो एक अच्छी तरह से परिभाषित, एग्जिनेट-आधारित पाड़ सामग्री तैयार करने के साथ परीक्षण किया जाता है।
यकीनन, ऊतक इंजीनियरिंग (टीई) का अंतिम उद्देश्य इन विट्रो में कार्यात्मक ऊतकों या अंगों का उत्पादन करना है, जिसका उपयोग मानव शरीर के घायल या रोगग्रस्त भागों को पुनर्जीवित करने या बदलने के लिए किया जा सकता है1,2,3. ऊतक इंजीनियरिंग में वर्तमान अनुसंधान (टीई) क्षेत्र के व्यक्तिगत पहलुओं पर ध्यान केंद्रित किया है (स्केड़िंग सामग्री, निर्माण प्रक्रियाओं, सेल स्रोतों, आदि) 4,5, साथ ही ऊतकों और अंगों के इन विट्रो मॉडल में सरल विकास करना जो विवो समकक्षों में उनके मौलिक पहलुओं की नकल करते हैं। इस तरह के मॉडल पहले से ही कई अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी होते हैं, जैसे दवा स्क्रीनिंग और विषाक्तता अध्ययन, विशेष रूप से मामलों में जहां पारंपरिक 2 डी सेल संस्कृतियों देशी ऊतकों के गतिशील प्रतिक्रियाओं की नकल करने में विफल6,7, 8,9. इन विट्रो मॉडल में तीन आयामी आम तौर पर कोशिकाओं के संयोजन के द्वारा निर्माण कर रहे हैं10, भौतिक रासायनिक संकेत11, और जैविक रूप से सक्रिय अणुओं12,13 पाड़ पर, जो से प्राप्त कर रहे हैं जैविक या जैव संगत सामग्री 14 ,15,16,17,18से विकोलेड टीस या निर्मित डी नोवो .
यह महत्वपूर्ण है कि पाड़ जटिल 3 डी microarchitecture और देशी ऊतकों के पदानुक्रम संरचना recapitulate इंजीनियर ऊतकों की कार्यक्षमता को सक्षम करने के लिए, विवो ऊतकों में के प्रतिनिधि19. टीई में महत्वपूर्ण तकनीकी प्रगति के बावजूद, शारीरिक रूप से प्रासंगिक कृत्रिम ऊतक ों का विकास एक चुनौती बनी हुई है। मोटे ऊतक ( मोटाई में 200 डिग्री मी) विशेष रूप से समस्याग्रस्त होते हैं, ऑक्सीजन और पोषक विसरण20जैसी सीमाओं के कारण। बड़े ऊतक निर्माण की दिशा में प्रगति की गई है; हालांकि, ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के परिवहन और अपशिष्ट हटाने को बढ़ावा देने के लिए रक्त वाहिकाओं के लिए कोशिकाओं की आवश्यक उच्च निकटता recapitulated किया जाना चाहिए। ऊतकों के संवहनीकरण (या वैकल्पिक रूप से, ऊतक निर्माण के भीतर परस्पर 3 डी संवहनी नेटवर्क का निर्माण) सेल व्यवहार्यता को बनाए रखने और इन विट्रो इंजीनियर ऊतकों के कार्यों को बढ़ावा देने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जो के लिए और अधिक कठिन है लंबे प्रयोगों में मॉडल21,22. इसके अलावा, आवश्यक संकल्प, संरचनात्मक अखंडता, और एक साथ जैव संगतता अभी तक23प्राप्त किया जाना है.
रक्त वाहिका जैसी संरचनाओं का निर्माण करने और इन विट्रो में संवहनी की सुविधा प्रदान करने के प्रयास में कई टीई दृष्टिकोण का प्रस्ताव किया गया है। कुछ उदाहरणों में शामिल हैं बोने endothelial कोशिकाओं (भी सह इस तरह के फाइब्रोब्लास्ट के रूप में अन्य कोशिकाओं के प्रकार के साथ खेती) कि स्वयं इकट्ठा microvascular नेटवर्क उत्पन्न करने के लिए24, संवहनी जनक कोशिकाओं और pericytes कि endothelial सेल को बढ़ावा देने का उपयोग विकास21,25, एंजियोजेनिक विकास कारकों की डिलीवरी जो संवहनी20,26को प्रेरित करती है , सेल शीट प्रौद्योगिकी का उपयोग करके जो संवहनी लेयरिंग20पर नियंत्रण के लिए अनुमति देता है , और के निर्माण अत्यधिक छिद्रयुक्त पाड़ संरचनाएं जो एंजियोजेनेसिस27को बढ़ावा देती हैं . उल्लेख दृष्टिकोण एंजियोजेनेसिस प्रेरण पर ध्यान केंद्रित है, जो आम तौर पर अतिरिक्त विकास कारकों की काफी मात्रा की आवश्यकता है (जैसे, VEGF) और समय के लिए फार्म. हालांकि, सबसे बड़ी कमियां उनके सीमित reproducibility और संवहनी पैटर्न पर प्रतिबंधित स्थानिक नियंत्रण कर रहे हैं, आम तौर पर ऊतक निर्माण के भीतर एक यादृच्छिक vasculature वितरण में जिसके परिणामस्वरूप जरूरी भ्रम की सुविधा नहीं है.
Additive विनिर्माण (AM, जैसे 3 डी bioprinting) तेजी से 3 डी के निर्माण में शामिल है जैविक या bioसंगत सामग्री का उपयोग कर TE के लिए उपयुक्त पाड़ बनाने के लिए निर्माण. कई AM दृष्टिकोण इस्तेमाल किया जा रहा है और समानांतर में विकसित (उदा., स्याही जेट और microextrusion आधारित तरीकों, लिथोग्राफी तकनीकों के विभिन्न प्रकार) पाड़ है कि उनकी वास्तुकला में देशी ऊतकों की नकल का उत्पादन करने के लिए, जैव रसायन, और कार्यक्षमता . व्यक्तिगत तकनीक कुछ लाभ और नुकसान28प्रदर्शन , यही वजह है कि विभिन्न संशोधनों का पता लगाया जा रहा है (उदा., माइक्रो-पैटर्निंग, प्रेरित एंजियोजेनेसिस, आदि) हद तक बढ़ाने के लिए जो बड़े, जटिल, और स्थिर संवहनी नेटवर्क22,29,30गढ़े जा सकते हैं .
इनमें से, बाहर निकालना bioprinting सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि है, विशेष रूप से संगत सामग्री की व्यापक रेंज के कारण (एक आम तौर पर सेल के अनुकूल प्रक्रिया28,31,32) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से असाधारण बहुमुखी प्रतिभा में अनुप्रयोगों की शर्तें (जैसे, एम्बेडेड और यज्ञ मुद्रण23,33, खोखले संरचनाओं का निर्माण34,35, आदि)। मुख्य चुनौतियों preoccupying वर्तमान अध्ययन 2 डी से 3 डी संरचनाओं के लिए स्थानांतरण, उच्च स्थानिक संकल्प के साथ खोखले ट्यूबों के एक घने नेटवर्क के गठन, और सेल संस्कृति में तरल पदार्थ प्रवाह के दौरान समग्र यांत्रिक अखंडता और आकार निष्ठा शामिल हैं शर्तें30|
perfusable ऊतक के लिए सबसे सीधा दृष्टिकोण निर्माण के भीतर चैनलों के एक जुड़े नेटवर्क का निर्माण है. एक ऊतक पाड़ के भीतर इस तरह के perfusable चैनलों के निर्माण के लिए ऊपर उल्लिखित समस्याओं के कई हल की उम्मीद है, क्योंकि यह तुरंत पोषक तत्व और ऑक्सीजन प्रसार के लिए अनुमति देता है, जबकि अपशिष्ट उत्पादों को हटाने. अतः निर्माण के भीतर नेक्रोटिक क्षेत्रों के संभावित निर्माण से बचा जाताहै। ऐसे चैनलों को अतिरिक्त रूप से एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी ) के साथ वरीयता प्राप्त किया जा सकता है और 3 डी ऊतक मॉडल37में कृत्रिम रक्त वाहिकाओं के रूप में काम किया जा सकता है . सबसे प्रारंभिक अर्थों में, एक पोत में एक खोखले चैनल, ईसी की नरम परत, और कठोर खोल शामिल हो सकते हैं। हाल ही में, एक कोर/ खोल फैशन में दो अलग-अलग सामग्रियों के 3 डी बाहर निकालना बाहर निकालना के लिए सह-अक्षीय सुइयों का उपयोग बहुत ब्याज प्राप्त किया है38,39,40,41, के रूप में यह के निर्माण के लिए अनुमति देता है खोखले ट्यूब.
पारंपरिक microextrusion 3 डी मुद्रण के समान, कोर / खोल मुद्रण एक सह-अक्षीय नोजल के साथ किया जाता है (उदा., विभिन्न व्यास के साथ दो सुइयों एक तरह से एक ही धुरी पर गठबंधन किया है, ताकि व्यापक सुई संकरा एक encloses). इस प्रकार, दो सामग्री एक साथ extruded किया जा सकता है, केंद्रीय तंतु या “इनर” कोर के रूप में एक और एक दूसरे के रूप में “बाहरी” खोल41के साथ. आज तक, सह-अक्षीय बायोप्रिंटिंग का उपयोग ठोस42, कोर/शेल43, और खोखले किस्में40,44के साथ संरचनाओं को बनाने के लिए किया गया है ; हालांकि, इस्तेमाल सामग्री दोनों इष्टतम सेल व्यवहार्यता और मुद्रित निर्माण के यांत्रिक मजबूती के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है. जैसा कि उल्लेख किया है, तकनीक विभिन्न यांत्रिक गुणों के साथ biomaterials गठबंधन करने की संभावना प्रदान करता है, जिसमें stiffer एक नरम एक का समर्थन करता है. इससे भी महत्वपूर्ण बात, अगर पाड़ सामग्री (जैसे, alginate, carboxyethyl सेलूलोज़) खोल के रूप में extruded है, जबकि पार से बना कोर जोड़ने एजेंट (जैसे, कैल्शियम क्लोराइड) आंतरिक केशिका से वितरित किया जाता है तो बाद मुद्रण बाहर कुल्ला, यह है एक ही चरण में एक सतत खोखले ट्यूब बनाने के लिए संभव45.
इसे ध्यान में रखते, एक सरल और repeatable एक कदम विधि संवहनी संरचनाओं और अन्य ट्यूबलर ऊतकों की इंजीनियरिंग के लिए अच्छी तरह से परिभाषित और perfusable पाड़ का निर्माण करने के लिए विकसित किया गया था. एक लागत प्रभावी प्रौद्योगिकी विकसित करने के लिए, निर्माण आदर्श रूप से एक एकल चरण प्रक्रिया होनी चाहिए। इसलिए, एक कोर/शेल सेट-अप को अनुकूलित किया गया था और 3 डी बायोप्रिंटर में एकीकृत किया गया था। बुनियादी डिजाइन इंजेक्शन के दौरान विरूपण से बचने के लिए धातु से बना एक केंद्रीय नोजल के होते हैं, जिसके आसपास एक बड़ा व्यास का दूसरा नोजल रखा जाता है। इस तरह के एक सह-अक्षीय नोजल सेट अप दो प्रवाहों के सह-बाहर निकलने और extruded hydrogel चैनल के तत्काल पार से जोड़ने के लिए अनुमति देता है। यह बहुस्तरीय खोखले तंतुओं का प्रत्यक्ष निर्माण करने में सक्षम बनाता है, जबकि बाद में कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2)की उच्च सांद्रता के साथ क्रॉस-लिंकिंग बाहर से अधिक स्थायी स्थिरीकरण सुनिश्चित करता है।
जैसे, इस विधि पाड़ और microchannels, जिसमें खोखले hydrogel फिलामेंट एक पाड़ के रूप में सेवा करने के लिए 3 डी constructs के यांत्रिक अखंडता का समर्थन और एक साथ के रूप में कार्य के समवर्ती मुद्रण के लिए अनुमति देता है में निर्मित microchannels देने के लिए कोशिका विकास के लिए पोषक तत्वों. यह प्रोटोकॉल एक कस्टम-निर्मित सह-अक्षीय नोजल के उपयोग के आधार पर कोर/शेल 3 डी बायोप्रिंटिंग रणनीति की एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान करता है जिसमें निर्मित चैनलों के साथ हाइड्रोजेल 3 डी संरचनाओं को खोखले फिलामेंट का उत्पादन करने के लिए क्रॉस-लिंकिंग को नियंत्रित करके निर्मित किया जाता है, जो सेल संस्कृति के दौरान perfusable रहते हैं.
इस कार्य में उपयोग किया गया 3D प्रिंटिंग सेट-अप पहले के रूप में कॉन्फ़िगर किया गया है जो पहले Banovi और विहार46 द्वारा वर्णित है और इसे तीन मुख्य घटकों में विभाजित किया जा सकता है: A) एक्स, वाई, और जेड दिशाओं में 50 डिग्री मीटर पोजीशनिंग सटीकता के साथ तीन-अक्ष सीएनसी यांत्रिक सेट-अप; बी) दो extruders, डिस्पोजेबल के लिए अनुकूलित, 5 एमएल luer-लॉक सिरिंजों, 1.2 $L voxel संकल्प के साथ; और सी) इलेक्ट्रॉनिक्स और सॉफ्टवेयर को नियंत्रित करने.
कोर/शेल प्रिंटिंग की सुविधा के लिए, एक उपयुक्त नोजल विकसित किया गया था जिसे एक्सट्रूडर्स में से एक पर रखा जा सकता है (प्राथमिक एक्सट्रूडर, कोर प्रिंट करना) और जी 27 कुंद-एंड सुइयों के साथ संगत है। यह भी दूसरे extruder के साथ कनेक्ट करने के लिए luer-लॉक संगतता है (खोल मुद्रण). पहले प्रोटोटाइप एक कुंद अंत G27 सुई डालने के द्वारा निर्मित किया गया (इनर व्यास ] 210 $m, बाहरी व्यास $ 410 $m) या तो एक G21 सुई में (इनर व्यास ] 510 $m, बाहरी व्यास ] 820 m) या G20 शंकु टिप (इनर व्यास ] 600 m), तो एक माध्यमिक n डालने बाद में खोल सामग्री की आपूर्ति करने के लिए edle. हालांकि, सुई शाफ्ट के मामूली झुकने के कारण, आंतरिक और बाहरी सुइयों के गाढ़ा संरेखण के साथ एक नोजल टिप का उत्पादन करना संभव नहीं है।
इस समस्या को हल करने के लिए, एक नया नोजल डिजाइन तैयार किया गया था कि निम्नलिखित मानदंडों को पूरा: 1) यह एक 3-अक्ष सीएनसी मिल का उपयोग कर निर्मित किया जा सकता है, 2) यह विभिन्न सामग्रियों से बनाया जा सकता है (उच्च प्रदर्शन प्लास्टिक, जैसे PEEK या धातुओं), 3) यह luer-लॉक संगतता है शेल सामग्री लागू करने के लिए, और 4) एक G27 कुंद अंत सुई के लिए संगत है और यह दो पदों पर जगह में रखती है केंद्रीय अक्ष के साथ टिप संरेखित करें. नोजल प्रोटोटाइप का एक योजनाबद्ध चित्र 1में दिखाया गया है।
नोज़ल डिजाइन
विकसित कोर / खोल नोजल का उपयोग करना, एक दो-एक्सट्रूडर विटाप्रिंट प्रणाली में एकीकृत, खोखले, ट्यूबलर पाड़ एक एकल चरण प्रक्रिया में गढ़े गए थे। तैयार पाड़ के अधिकांश के माध्यम से ट्यूब दीवार की एक भी मोटाई को प्राप्त करने के लिए, सुई बाहरी बाहर निकालना अंगूठी की धुरी पर केंद्रीय रूप से तैनात करने की जरूरत है. मानक गेज सुइयों अक्सर अक्ष से दूर एक मामूली, अभी तक महत्वपूर्ण विलक्षणता प्रदर्शन. इस प्रकार, नोजल बॉडी को सुई को दो स्थानों पर रखने के लिए डिज़ाइन किया गया था, एक बार शीर्ष पर (हब फिक्सिंग) और एक बार अंतिम कोर/खोल कक्ष से पहले (कैनुला को ठीक करना), इसके अक्षीय संरेखण को सही करना। अक्षीय संरेखण की शुद्धता निर्धारण बिंदु के बीच की दूरी के साथ बढ़ जाती है। वहाँ है, तथापि, सुई की लंबाई और उपलब्ध नोजल चैम्बर मात्रा के बीच एक tradeoff. सेट अप की कार्यक्षमता में सुधार करने के लिए आगे, नोजल के कुछ संशोधनों को लागू किया जा सकता है: ए) बेहतर स्थिरता के साथ एक नोजल माउंट, बी) सुई संगतता की एक व्यापक रेंज के लिए अतिरिक्त नलिका, सी) सुई के लिए एक सटीक समायोजन तंत्र नोजल पोजीशनिंग, और डी) मक्खी सामग्री की तैयारी पर के लिए अतिरिक्त आदानों और microfluidic उपकरणों को एकीकृत।
हाइड्रोजेल इटिटिमाइजेशन
इष्टतम ALG: सीएमसी अनुपात निर्धारित करने के लिए, कई सामग्री पुनरावृत्तियों का मूल्यांकन किया गया। आम तौर पर, दोनों घटकों के 3 wt.% से ऊपर सांद्रता के साथ कोर / खोल मुद्रण असंभव प्रदान किया गया था, क्योंकि यह एक सतत hydrogel प्रवाह के लिए अनुमति नहीं दी या नोजल के clogging में हुई. विशेष रूप से, 3 wt.% से ऊपर ALG एकाग्रता चिपचिपापन जरूरत से ज्यादा वृद्धि हुई है और नोजल clogging में हुई, जबकि कम ALG सांद्रता और उच्च सीएमसी (gt; 3 wt.%) सांद्रता नीचे पार जोड़ने बार धीमा और इस तरह पर्याप्त प्रदान करने में विफल पाड़ के संरचनात्मक समर्थन. कोर/शेल प्रिंटिंग कम चिपचिपा योगों के साथ संभव था; हालांकि, extruded जेल चिपचिपापन दीर्घकालिक आकार निष्ठा बनाए रखने के लिए पर्याप्त होना चाहिए. अंत में, एक 1:1 ALG: सीएमसी अनुपात सबसे उपयुक्त विकल्प है जो Maver एट अल द्वारा एक पिछले अध्ययन की पुष्टि साबित हो गयाथा. एनएफसी के अलावा काफी प्रिंटहोने और कोर / खोल मुद्रित पाड़ की संरचनात्मक कठोरता में सुधार हुआ है, लेकिन सामग्री के पार जोड़ने गुणों पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा।
कस्टम अनुप्रयोगों, विशिष्ट सेल प्रकार और प्रयोगात्मक सेट अप के लिए अनुकूलित अच्छी तरह से पूंछ मचान सामग्री है, जो संरचना और पार से जोड़ने तंत्र में अलग अलग होंगे की आवश्यकता होगी. इस कार्य में वर्णित विधि एक ऐल्जिनेट-सेलूलोज़ मिश्रित बहुलक समाधान पर आधारित है, जो कि के2+ आयनों का उपयोग करके परस्पर जुड़े आयन के साथ जुड़ा हुआ है। अल्गिनेट स्वयं (1,4)से जुड़े जेड-डी-मैनुरोनेट (एम) और जेड-एल-गुलुरुनेट (जी) अवशेषों का एक रैखिक बहुलक है जिसे कै2 ़ और अन्य द्विसंयोजक धनायनों जैसे Sr2+, Br2+, Mg के अनुप्रयोग द्वारा उत्क्रमणीय रूप से आइओनीली क्रॉसलिंक किया जा सकता है। 2+| फिर भी, alginate के पार से जोड़ने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया आयन Ca2 + CaCl2के रूप में रहता है. Ca2+ का उपयोग CaSO4 या CaCO3के रूप में भी किया जा सकता है; हालांकि, CaSO की कम विलेयता4 CaCl2 के सापेक्ष धीमी जेलेशन का मतलब है. CaCO3 भी धीमी जेलेशन बार जो कमजोर और असंगत यांत्रिक गुणों में परिणाम कर सकते हैं पैदावार.
लंबे समय तक जेलेशन बार आम तौर पर एक अधिक समरूप निर्माण काउत्पादन, तथापि, कुछ अनुप्रयोगों, जैसे कोर / ज2़ आयन भी जेलेशन को प्रेरित करते हैं; हालांकि, उनके पार जोड़ने दक्षता के बारे में 5x-10x कम है, Ca2 +की तुलना में, 2-3 एच के पार से जोड़ने के समय के साथ. इसके अतिरिक्त, मैग्नीशियम आयन गुलुरोनिक इकाइयों की ओर अधिक चयनात्मक होते हैं, इसलिए क्रॉस-लिंकिंग एएलजी51की रासायनिक संरचना पर अधिक निर्भर करता है। इस मामले में, खोखले संरचना के पतन से पहले निरंतर खोखले चैनल गठन सुनिश्चित करने के लिए एक तेजी से जेलेशन दर आवश्यक है। CaCl2 सबसे तेजी से जेलेशन दर पैदावार, जो खोखले फिलामेंट के प्रत्यक्ष जमाव के लिए महत्वपूर्ण है। 100 एमएम CaCl2 का उपयोग किया गया था, जो पर्याप्त रूप से नोजल के भीतर जेल ठोसीकरण के कारण के बिना एक खोखले फिलामेंट के निरंतर गठन को स्थिर किया गया था।
पाड़ के मुद्रण और पोस्ट प्रसंस्करण
निम्नलिखित चरणों की प्रक्रिया के इस भाग के दौरान विचार किया जाना चाहिए, सहित 1) यह सुनिश्चित करना है कि सभी समाधान और सामग्री 3 डी bioprinter सहित ठीक से मुद्रण से पहले बाँझ रहे हैं. 2) hydrogel तैयार करते समय, सामग्री की एकरूपता निरंतर मुद्रण के लिए महत्वपूर्ण है। अशुद्धियों या हवा के बुलबुले का परिचय से बचा जाना चाहिए, क्योंकि वे नोजल को रोक सकते हैं और / 3) सीरिंज को लुअर-लॉक तंत्र के माध्यम से कोर/शेल नोजल से ठीक से जोड़ा जाना चाहिए और चित्र 2क, बीमें देखे गए एक्सट्रूडर माउंट्स में सही ढंग से डाला जाना चाहिए। 4) एक जटिल संरचना मुद्रण से पहले, यह जेल के एक छोटे से हिस्से को पूर्व-उत्तेजित करने और क्रॉस-लिंकिंग समाधान को कोर/शेल नोजल में अतिरिक्त हवा के बुलबुले को साफ करने और एक सतत हाइड्रोजेल प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की जाती है। यह repeatability में सुधार करने के लिए जी कोड में सीधे शामिल किया जा सकता है. 5) यह पाड़ ही शुरू होता है की छपाई से पहले एक समरूप खोखले फिलामेंट के बिछाने सुनिश्चित करने के लिए पाड़ आसपास एक स्कर्ट जोड़ने के लिए उपयोगी है.
इसके अतिरिक्त, 6) मुद्रण फिलामेंट और सब्सट्रेट के बीच आसंजन में सुधार करने के लिए, यह अच्छा आसंजन (यानी, एक गिलास स्लाइड या पेट्री डिश) के साथ एक फ्लैट सतह का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। 7) बाहर निकालना नोजल hydrogel के निर्बाध प्रवाह के लिए अनुमति देने के लिए सब्सट्रेट के साथ सीधे संपर्क में नहीं होना चाहिए। प्रारंभिक दूरी दृढ़ता से प्रिंट की गुणवत्ता को प्रभावित करेगा, लेकिन extruded फिलामेंट की मोटाई प्रारंभिक सेटिंग का एक अच्छा सन्निकटन है. 8) जी कोड में प्रारंभिक मुद्रण ऊंचाई व्यक्तिगत जरूरतों के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। मुद्रण मानकों अनुकूलित कर रहे हैं के बाद, पाड़ जी कोड ग्रह सीएनसी सॉफ्टवेयर में आयात किया जाना चाहिए और मुद्रण प्रक्रिया प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में शुरू कर दिया. 9) को नियंत्रित करने और इष्टतम पाड़ मुद्रित करने के इरादे से hydrogel प्रवाह का अनुकूलन करने के लिए, दोनों निर्माण संरचना और मुद्रण मानकों विविध होना चाहिए (यानी, मुद्रण गति, बाहर निकालना दबाव, मुद्रण तापमान, सब्सट्रेट के बीच की दूरी और बाहर निकालना नोजल, परत ऊंचाई, पाड़ आकार, आदि).
सामान्य तौर पर, उच्च प्रवाह दर उच्च चिपचिपापन के साथ योगों को मुद्रित करने के लिए आवश्यक हैं। जैसा कि उल्लेख किया गया है, सभी हाइड्रोजेल योगों, जो तत्काल रासायनिक क्रॉस-लिंकिंग के लिए उपयुक्त हैं, खोखले ट्यूबों के एक कदम निर्माण के लिए अनुमति देते हैं और वर्णित कोर/शेल सेट-अप के साथ उपयोग किया जा सकता है। मुद्रण और क्रॉस-लिंकिंग तंत्र को तदनुसार अनुकूलित किए जाने की आवश्यकता है। मुद्रण के बाद, सभी पाड़ के बाद माध्यमिक पार से संसाधित किया गया 5 wt.% CaCl2 समाधान है, जो ALG-CMC घटक के पूर्ण पार से जोड़ने का आश्वासन दिया और कम से कम 30 मिनट के लिए एक यूवी प्रकाश के तहत दोनों पक्षों से बाँझ. यह पूरी तरह से पार से जोड़ने समाधान और काफी लंबे समय के लिए पार से जोड़ने की प्रक्रिया को पूरा करने के लिए इनक्यूबेट के साथ पाड़ निगल सुनिश्चित किया जाना चाहिए. पोस्ट-प्रोसेसिंग का उपयोग की गई सामग्री और क्रॉस-लिंकिंग तंत्र के आधार पर अलग-अलग होगा, जिस पर पहले से विचार किया जाना चाहिए। पोस्ट प्रसंस्करण के बाद, पाड़ सब्सट्रेट से ध्यान से हटाया जाना चाहिए, सेल संस्कृति मीडिया को स्थानांतरित, और सेल बोने से पहले कम से कम 24 एच के लिए एक नियंत्रित वातावरण में incubated. एक बेरंग माध्यम का उपयोग पाड़ में इंजेक्शन के दौरान सेल निलंबन की दृश्यता में सुधार होगा.
लाइव/मृत परख
परख आयोजित करने से पहले लाइव/डेड घोल को सीधे तैयार किया जाना चाहिए और परख आयोजित करने से पहले अंधेरे में रखा जाना चाहिए, क्योंकि इसमें फ्लोरोसेंट रंग होते हैं जो विरंजन के लिए प्रवण होते हैं। वांछित ऊष्मायन समय के बाद, सेल संस्कृति मीडिया ध्यान से पाड़ आसपास छोड़ दिया जाना चाहिए और PBS के साथ कुल्ला. आदर्श रूप में, एक ही प्रवेश बिंदु सेल बोने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए लाइव / मृत परख पाड़ में इंजेक्शन किया जा रहा द्वारा पीछा किया.
परिणामों का महत्व
दोनों ALG और सीएमसी पहले से ही इन विट्रो में एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इसके ECM-mimetic सुविधाओं के आधार पर, शारीरिक पार से जोड़ने, और biocompatibility, ALG आमतौर पर वितरण और angiogenic विकास कारकों के नियंत्रित रिलीज के लिए एक घटक के रूप में नियोजित किया गया है (जैसे, bFGF, HGF, VEGF164, और अंग-1 *respectively)52 ,53,54. इसके अलावा, जिलेटिन के साथ संयोजन में, सीएमसी भी शारीरिक स्थितियों55के तहत अपनी तेजी से पार से जोड़ने क्षमताओं के कारण संवहनी endothelial कोशिकाओं encapsulating के लिए इस्तेमाल किया गया है। एनएफसी आगे यांत्रिक स्थिरता और पाड़ के आकार निष्ठा को बढ़ाने के लिए जोड़ा गया. इस बात पर बल दिया जाना चाहिए कि इसका उद्देश्य संवहनी को बढ़ाना नहीं था, बल्कि पर्फूसर, खोखले एएलजी-सीएमसी पाड़ के उत्पादन की संभावना को प्रदर्शित करना था, जो कोर/शेल फैशन में मुद्रित होता है, जो लगाव और प्रसार की सुविधा भी प्रदान करता है। एचयूवीसी। एक ALG-सीएमसी मिश्रण का उपयोग करने का विकल्प आमतौर पर इस्तेमाल किया, आसानी से सुलभ, और bioसंगत आधार सामग्री है कि खोखले चैनलों के कोर / कई अन्य सामग्री एंजियोजेनेसिस को बढ़ाने के लिए अधिक व्यवहार्य विकल्प हो सकता है; तथापि, कुछ कोर/शेल प्रिंटिंग के लिए उपयुक्त नहीं हैं, क्योंकि वे तीव्र जेलेशन/क्रॉस-लिंकिंग की सुविधा नहीं देते हैं, जो इस दृष्टिकोण में महत्वपूर्ण है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक स्लोवेनियाई अनुसंधान एजेंसी (अनुदान संख्या: P3-0036, और I0-0029) से प्राप्त इस परियोजना के लिए वित्तीय सहायता स्वीकार करना चाहते हैं, और विज्ञान, शिक्षा और खेल मंत्रालय (अनुदान संख्या: 5442-1/
Alginic acid sodium salt | Sigma-Aldrich (Germany) | 180947 | powder; Mw ~80,000 |
ATTC HUV-EC-C [HUVEC] | LGC Standards (UK) | ATCC-CRL-1730 | Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) and unidentified factors from bovine pituitary, hypothalamus or whole brain extracts are mitogenic for this line; the cells have a life expectancy of 50 to 60 population doublings. |
Axiovert 40 inverted optical microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH (Germany) | three contrastingtechniques in one objective – e.g. brightfield,phase contrast and PlasDIC | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich (Germany) | C1016 | anhydrou; granular; ≤7.0 mm; ≥93.0% |
Cellulose nanofibrils suspension (NFC, 3% (w/v)) | The Process Development Center, University of Maine (Maine, USA) | nominal fiber width of 50 nm; lengths of up to several hundred microns | |
ELGA Purelab water purification system | Veolia Water Technologies (UK) | ||
EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | AMF4300 | a fully integrated, digital, inverted imaging system for four-color fluorescence and transmitted-light applications |
Gibco Advanced Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Advance DMEM) | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | 12491015 | high glucose; no glutamine; phenol red |
Gibco Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | 21063029 | high glucose; L-glutamine; HEPES; no phenol red |
Gibco Fetal Bovine Serum (FBS), qualified | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | 10270106 | FBS origin: Brazil; 5 % (w/v) FBS |
Hypodermic Sterican needle | B. Braun Melsungen AG (Germany) | 9180117 | 0.40 x 25mm, 27G x 1'' |
L-glutamine | Sigma-Aldrich (Germany) | G3126 | ReagentPlus®, ≥99% (HPLC) |
Live/Dead Cell Double Staining Kit | Sigma-Aldrich (Germany) | 4511 | contains calcein-AM and propidium iodide (PI) solutions; suitable for fluorescence |
Nunc EasYFlask cell culture flasks | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | 156367 | Nunclon Delta certified for monolayer formation, cloning efficiency, non-cytotoxic, non-pyrogenic, and sterility; filter caps; culture area of 25 cm2 |
Omnifix syringe | B. Braun Melsungen AG (Germany) | 4617053V | 5 mL Luer Lock |
Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich (Germany) | P3032 | powder; BioReagent; suitable for cell culture |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich (Germany) | P4417 | tablet; one tablet dissolved in 200 mL of deionized water yields 0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4, at 25 °C |
Sodium carboxymethyl cellulose | Sigma-Aldrich (Germany) | 419338 | powder; average Mw ~700,000 |
Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich (Germany) | S9137 | powder; BioReagent; suitable for cell culture |
Ultra-pure water | Veolia Water Technologies (UK) | 18.2 mΩ cm at 25⁰C | |
VitaPrint 3D bio-printer | IRNAS (Slovenia) |