Präsentiert wird hier ein einfach zu bedienender, Kern-/Schalen-, dreidimensionaler Bioprinting-Aufbau für die einstufige Fertigung von Hohlgerüsten, geeignet für die Gewebetechnik von Gefäß- und anderen Röhrenstrukturen.
Der dreidimensionale (3D) Druck von Kern-/Schalenfilamenten ermöglicht die direkte Herstellung von Kanalstrukturen mit einer stabilen Schale, die an der Schnittstelle mit einem flüssigen Kern vernetzt ist. Letzteres wird nach dem Druck entfernt und hinterlässt ein Hohlrohr. Die Integration einer additiven Fertigungstechnik (wie hier beschrieben mit maßgeschneiderten [Bio]Tinten, die die native extrazelluläre Matrix [ECM] strukturell und biochemisch imitieren) ist ein wichtiger Schritt in Richtung fortschrittlicher Tissue Engineering. Die präzise Fertigung klar definierter Strukturen erfordert jedoch maßgeschneiderte Fertigungsstrategien, die für das verwendete Material optimiert sind. Daher ist es sinnvoll, mit einer Einrichtung zu beginnen, die anpassbar, einfach zu bedienen und mit einem breiten Spektrum von Materialien und Anwendungen kompatibel ist. Diese Arbeit präsentiert eine einfach zu fertigende Kern-/Schalendüse mit Luer-Kompatibilität, um den Kern-/Schalendruck von Holzstapelstrukturen zu erforschen, die mit einer klar definierten, auf Alginat basierenden Gerüstmaterialformulierung getestet wurden.
Das Endziel der Tissue Engineering (TE) ist es wohl, funktionelle Gewebe oder Organe in vitro zu produzieren, die verwendet werden können, um verletzte oder kranke Teile des menschlichen Körpers zu regenerieren oder zu ersetzen1,2,3. Die aktuelle Forschung in tissue engineering (TE) konzentriert sich auf einzelne Aspekte des Feldes (Gerüstmaterialien, Herstellungsverfahren, Zellquellen usw.) 4,5, sowie die Entwicklung einfacher In-vitro-Modelle von Geweben und Organen, die grundlegende Aspekte ihrer In-vivo-Pendants imitieren. Solche Modelle sind bereits für viele Anwendungen nützlich, wie z. B. Arzneimittelscreening und Toxizitätsstudien, insbesondere in Fällen, in denen herkömmliche 2D-Zellkulturen die dynamischen Reaktionen der nativen Gewebe nicht imitieren6,7, 8,9. Dreidimensionale In-vitro-Modelle werden in der Regel durch die Kombination von Zellen10, physikalisch-chemischen Cues11und biologisch aktiven Molekülen12,13 auf Gerüsten, die aus Gerüsten gewonnen werden, dezellularisierte Gewebe oder konstruiert de novo aus biologischen oder biokompatiblen Materialien14,15,16,17,18.
Es ist entscheidend, dass Gerüste die komplexe 3D-Mikroarchitektur und hierarchische Struktur der nativen Gewebe rekapitulieren, um die Funktionalität der technischen Gewebe zu ermöglichen, die für In-vivo-Gewebe19repräsentativ sind. Trotz des bedeutenden technologischen Fortschritts bei TE bleibt die Entwicklung physiologisch relevanter künstlicher Gewebekonstrukte eine Herausforderung. Dicke samt Dicke ( >200 m Dicke) sind aufgrund von Einschränkungen wie Sauerstoff- und Nährstoffdiffusion20besonders problematisch. Fortschritte in Richtung größerer Gewebekonstrukte wurden erzielt; Die erforderliche hohe Nähe der Zellen zu den Blutgefäßen, um Sauerstoff und Nährstoffe zu transportieren und die Abfallentsorgung zu fördern, muss jedoch rekapituliert werden. Die Vaskularisation von Geweben (oder alternativ die Herstellung von miteinander verbundenen 3D-Gefäßnetzwerken innerhalb von Gewebekonstrukten) spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit und der Förderung von Funktionen von in vitro entwickelten Geweben, was für Modelle in verlängerten Experimenten21,22. Darüber hinaus müssen die erforderliche Auflösung, strukturelle Integrität und gleichzeitige Biokompatibilität noch erreicht werden23.
Mehrere TE-Ansätze wurden vorgeschlagen, um blutgefäßähnliche Strukturen zu konstruieren und die Vaskularisation in vitro zu erleichtern. Einige Beispiele sind die Aussaat von Endothelzellen (auch mit anderen Zelltypen wie Fibroblasten kokultiviert), die sich selbst zusammensetzen, um mikrovaskuläre Netzwerke zu erzeugen24, Verwendung von vaskulären Vorläuferzellen und Pericyten, die Endothelzellen fördern Wachstum21,25, die Abgabe von angiogenen Wachstumsfaktoren, die Vaskularisation induzieren20,26, mit Zellblatt-Technologie, die die Kontrolle über vaskuläre Schichtung ermöglicht20, und hochporöse Gerüststrukturen, die Angiogenese fördern27. Die genannten Ansätze konzentrieren sich auf die Angiogenese-Induktion, die in der Regel erhebliche Mengen an zusätzlichen Wachstumsfaktoren (z. B. VEGF) und Zeit zur Bildung erfordert. Die größten Nachteile sind jedoch ihre begrenzte Reproduzierbarkeit und eingeschränkte räumliche Kontrolle über vaskuläre Musterung, was in der Regel zu einer zufälligen Vaskulaturverteilung innerhalb des Gewebekonstrukts führt, die nicht unbedingt die Durchblutung erleichtert.
Die additive Fertigung (AM, z. B. 3D-Bioprinting) ist zunehmend an der Herstellung von 3D-Konstrukten mit biologischen oder biokompatiblen Materialien beteiligt, um für TE geeignete Gerüste zu erstellen. Mehrere AM-Ansätze werden parallel verwendet und entwickelt (z. B. Ink-Jet- und Mikroextrusions-basierte Methoden, verschiedene Arten von lithographischen Techniken), um Gerüste herzustellen, die natives Gewebe in ihrer Architektur, Biochemie und Funktionalität imitieren. . Die einzelnen Techniken weisen gewisse Vor- und Nachteile auf28, weshalb verschiedene Modifikationen untersucht werden (z.B. Mikromusterung, induzierte Angiogenese usw.), um das Ausmaß zu erhöhen, in dem große, komplexe und stabile Gefäße Netzwerke können hergestellt werden22,29,30.
Unter diesen ist Extrusion Bioprinting die am häufigsten verwendete Methode, vor allem aufgrund der breiten Palette von kompatiblen Materialien (ein allgemein zellfreundliches Verfahren28,31,32) sowie außergewöhnliche Vielseitigkeit in (z.B. Embedded- und Opferdruck23,33, Herstellung von Hohlkonstruktionen34,35, etc.). Die wichtigsten Herausforderungen, die die gegenwärtigen Studien beschäftigen, sind die Übertragung von 2D- auf 3D-Strukturen, die Bildung eines dichten Netzes von Hohlrohren mit hoher räumlicher Auflösung sowie die allgemeine mechanische Integrität und Formtreue während des Flüssigkeitsflusses in der Zellkultur. Bedingungen30.
Der einfachste Ansatz für perfusable Gewebe ist die Herstellung eines miteinander verbundenen Kanalnetzes innerhalb des Konstrukts. Die Schaffung solcher durchlässigen Kanäle innerhalb eines Gewebegerüsts wird viele der oben genannten Probleme lösen, da es sofort eine Nährstoff- und Sauerstoffdiffusion ermöglicht, während Abfallprodukte entfernt werden. Daher wird die potentielle Bildung nekrotischer Regionen innerhalb des Konstrukts vermieden36. Solche Kanäle können zusätzlich mit Endothelzellen (ECs) gesät werden und als künstliche Blutgefäße in 3D-Gewebemodellen37dienen. Im elementarsten Sinne kann ein Gefäß aus einem hohlen Kanal, einer weichen Schicht von ECs und einer steifen Schale bestehen. Kürzlich hat die 3D-Extrusion von zwei verschiedenen Materialien in Kern-/Schalenmode unter Verwendung von koaxialen Nadeln für die Extrusion viel Interesse gewonnen38,39,40,41, da es die Herstellung von Hohlrohre.
Ähnlich wie beim herkömmlichen Mikroextrusions-3D-Druck erfolgt der Kern-/Schalendruck mit einer koaxialen Düse (z.B. zwei Nadeln mit unterschiedlichen Durchmessern, die auf derselben Achse ausgerichtet sind, so dass die breitere Nadel die schmalere umschließt). So können zwei Materialien gleichzeitig extrudiert werden, wobei eines als zentrales Filament oder “innerer” Kern und ein zweites als “äußere” Schale41. Bis heute wurde der koaxiale Bioprinting zur Herstellung von Strukturen mit festen42,Kern/Schale43und Hohlsträngen40,44verwendet; Die verwendeten Materialien wurden jedoch nicht sowohl für die optimale Zelllebensfähigkeit als auch für die mechanische Robustheit der gedruckten Konstrukte optimiert. Wie bereits erwähnt, bietet die Technik die Möglichkeit, Biomaterialien mit unterschiedlichen mechanischen Eigenschaften zu kombinieren, bei denen die steifere die weichere unterstützt. Noch wichtiger ist, wenn das Gerüstmaterial (z. B. Alginat, Carboxymethylcellulose) als Schale extrudiert wird, während der Auslaufstoff aus dem Vernetzungsmittel (z. B. Calciumchlorid) aus der inneren Kapillare abgegeben und dann nach dem Druck ausgespült wird, möglich, ein kontinuierliches Hohlrohr in einem einzigen Schritt zu fertigen45.
Vor diesem Hintergrund wurde eine einfache und wiederholbare Ein-Schritt-Methode entwickelt, um klar definierte und durchlässige Gerüste für die Konstruktion von Gefäßstrukturen und anderen Röhrengeweben zu bauen. Um eine kostengünstige Technologie zu entwickeln, sollte die Fertigung idealerweise ein einstufiger Prozess sein. Daher wurde ein Kern-/Schalenaufbau angepasst und in den 3D-Bioprinter integriert. Die Grundkonstruktion besteht aus einer zentralen Düse aus Metall, um Verformungen während der Injektion zu vermeiden, um die eine zweite Düse mit größerem Durchmesser platziert wird. Ein solcher koaxialer Düsenaufbau ermöglicht die Koextrusion der beiden Strömungen und die sofortige Vernetzung des extrudierten Hydrogelkanals. Dies ermöglicht die direkte Herstellung von mehrschichtigen Hohlfilamenten, während die anschließende Vernetzung mit höheren Calciumchloridkonzentrationen (CaCl2) eine dauerhaftere Stabilisierung von außen gewährleistet.
Als solches ermöglicht dieses Verfahren den gleichzeitigen Druck von Gerüsten und Mikrokanälen, bei denen die hohlen Hydrogelfilamente als Gerüst dienen, um die mechanische Integrität von 3D-Konstrukten zu unterstützen und gleichzeitig als eingebaute Mikrokanäle zu fungieren, um Nährstoffe für das Zellwachstum. Dieses Protokoll bietet ein detailliertes Verfahren der Core/Shell 3D-Bioprinting-Strategie auf der Grundlage einer maßgeschneiderten koaxialen Düse, in der Hydrogel-3D-Strukturen mit eingebauten Kanälen durch Steuerung der Vernetzung zur Herstellung von Hohlfilamenten hergestellt werden. die während der Zellkultur durchfauchbar bleiben.
Der in dieser Arbeit verwendete 3D-Druckaufbau ist wie zuvor von Banovic und Vihar46 beschrieben konfiguriert und kann in drei Hauptkomponenten unterteilt werden: A) eine dreiachsige CNC-Mechanik mit 50 m Positioniergenauigkeit in X-, Y- und Z-Richtung; B) zwei Extruder, angepasst für Einweg-, 5 ml Luer-Lock-Spritzen, mit 1,2 l Voxel-Auflösung; und C) Steuerung von Elektronik und Software.
Um den Kern-/Schalendruck zu erleichtern, wurde eine geeignete Düse entwickelt, die auf einem der Extruder (Primärextruder, Druck des Kerns) montiert werden kann und mit G27-Stumpfendnadeln kompatibel ist. Es hat auch Luer-Lock-Kompatibilität mit dem zweiten Extruder verbinden (Druck der Schale). Die ersten Prototypen wurden entweder durch Einsetzen einer stumpfen G27-Nadel (Innendurchmesser = 210 m, Außendurchmesser = 410 m) in eine G21-Nadel (Innendurchmesser = 510 m, Außendurchmesser = 820 m) oder G20-Konusspitze (Innendurchmesser = 600 m) hergestellt und anschließend eine sekundäre n seitlich das Schalenmaterial zu liefern. Aufgrund einer leichten Biegung der Nadelwelle ist es jedoch nicht möglich, eine Düsenspitze mit konzentrischer Ausrichtung der Innen- und Außennadeln herzustellen.
Um dieses Problem zu lösen, wurde ein neues Düsendesign entwickelt, das die folgenden Kriterien erfüllt: 1) es kann mit einer 3-Achsen-CNC-Fräse hergestellt werden, 2) es kann aus verschiedenen Materialien (Hochleistungskunststoffe, wie PEEK oder Metalle) hergestellt werden, 3) es hat Luer-Lock-Kompatibilität zum Auftragen von Schalenmaterial und 4) ist für eine G27-Stumpf-Endnadel kompatibel und hält sie an zwei Positionen an Ort und Stelle, um die Spitze an der Mittelachse auszurichten. Ein Schaltplan des Düsenprototyps ist in Abbildung 1dargestellt.
Düsendesign
Mit der entwickelten Kern-/Schalendüse, die in ein Vitaprint-System mit zwei Extrudern integriert ist, wurden hohle, röhrenförmige Gerüste in einem einstufigen Prozess gefertigt. Um eine gleichmäßige Dicke der Rohrwand durch die meisten der vorbereiteten Gerüste zu erreichen, muss die Nadel zentral auf der Achse des äußeren Extrusionsrings positioniert werden. Standardmessnadeln weisen oft eine leichte, aber signifikante Exzentrizität außerhalb der Achse auf. So wurde der Düsenkörper so konzipiert, dass er die Nadel an zwei Stellen hält, einmal an der Spitze (Befestigung der Nabe) und einmal vor der endgültigen Kern-/Schalenkammer (Befestigung der Kanüle selbst), wodurch seine axiale Ausrichtung korrigiert wird. Die Genauigkeit der axialen Ausrichtung erhöht sich mit dem Abstand zwischen dem Fixierungspunkt. Es gibt jedoch einen Kompromiss zwischen Nadellänge und verfügbarm Düsenkammervolumen. Um die Funktionalität des Aufbaus weiter zu verbessern, können bestimmte Modifikationen der Düse implementiert werden: A) eine Düsenhalterung mit verbesserter Stabilität, B) zusätzliche Düsen für eine breitere Palette von Nadelkompatibilität, C) ein präziser Einstellmechanismus für Nadel- Düsenpositionierung und D) integrationen zusätzliche Eingänge und mikrofluidische Geräte für die spontane Materialaufbereitung.
Hydrogel-Optimierung
Um das optimale ALG:CMC-Verhältnis zu bestimmen, wurden mehrere Materialiterationen ausgewertet. Im Allgemeinen wurde der Kern-/Schalendruck mit Konzentrationen über 3 Gew.% beider Komponenten unmöglich gemacht, da er keinen kontinuierlichen Hydrogelfluss zuließ oder zu einer Verstopfung der Düse führte. Insbesondere die ALG-Konzentration über 3 Gew.% erhöhte die Viskosität übermäßig und führte zu einer Verstopfung der Düsen, während niedrigere ALG-Konzentrationen und höhere CMC-Konzentrationen (>3 Gew.%) die Vernetzungszeiten verlangsamten und somit nicht genügend tragwerksütze des Gerüstes. Kern-/Schalendruck war mit weniger viskosen Formulierungen möglich; Extrudierte Gelviskosität muss jedoch ausreichen, um die langfristige Formtreue aufrechtzuerhalten. Am Ende erwies sich ein 1:1 ALG:CMC-Verhältnis als die am besten geeignete Wahl, was eine vorherige Studie von Maver et al.49bestätigt. Die Zugabe von NFC verbesserte die Bedruckbarkeit und strukturelle Steifigkeit von Kern-/Schalengerüsten deutlich, hatte aber keinen signifikanten Einfluss auf die Vernetzungseigenschaften des Materials.
Kundenspezifische Anwendungen, die für bestimmte Zelltypen und experimentelle Aufgelegungoptimiert sind, erfordern gut zugeschnittene Gerüstmaterialien, die in der Zusammensetzung und den Vernetzungsmechanismen variieren. Das in dieser Arbeit beschriebene Verfahren basiert auf einer Alginat-Zellulose-Mischpolymerlösung, die ionisch mit Ca2+-Ionen vernetzt ist. Alginat selbst ist ein lineares Polymer aus Blöcken von (1,4)-verbundenen (M) und -l-Guluronat (G)-Rückständen, die durch Anwendung von Ca2+ und anderen divalenten Kationen wie Sr2+,Br2+reversibel ionisch vernetzt werden können, 2+. Dennoch bleibt das am weitesten verbreitete Ion zur Vernetzung von Alginat Ca2+ in Form von CaCl2. Ca2+ kann auch in Form von CaSO4 oder CaCO3verwendet werden; die geringe Löslichkeit von CaSO4 im Vergleich zu CaCl2 bedeutet jedoch eine langsamere Gelation. CaCO3 liefert noch langsamere Gelationszeiten, die zu schwachen und inkonsistenten mechanischen Eigenschaften führen können.
Längere Gelationszeiten erzeugen in der Regel ein homogeneres Konstrukt, jedoch erfordern bestimmte Anwendungen, wie z. B. Kern-/Schalendruck, schnelle Gelationsraten50. Mg2+ Ionen induzieren auch Gelation; Ihre Vernetzungseffizienz ist jedoch etwa 5x-10x niedriger, im Vergleich zu Ca2+, mit Vernetzungszeiten von 2-3 h. Darüber hinaus sind Magnesiumionen selektiver gegenüber guluronischen Einheiten, daher hängt die Vernetzung mehr von der chemischen Zusammensetzung des ALG51ab. In diesem Fall ist eine schnelle Gelationsrate unerlässlich, um eine kontinuierliche Hohlkanalbildung zu gewährleisten, bevor die Hohlstruktur zusammenbrechen kann. CaCl2 liefert die schnellste Gelationsrate, die für die direkte Abscheidung von Hohlfilamenten entscheidend ist. 100 mM CaCl2 wurde eingesetzt, was die kontinuierliche Bildung eines Hohlfilaments ausreichend stabilisierte, ohne gelverfestigung innerhalb der Düse zu verursachen.
Druck und Nachbearbeitung von Gerüsten
Die folgenden Schritte sollten während dieses Teils des Prozesses berücksichtigt werden, einschließlich 1) um sicherzustellen, dass alle Lösungen und Materialien, einschließlich des 3D-Biodruckers, vor dem Drucken ordnungsgemäß sterilisiert werden. 2) Bei der Herstellung des Hydrogels ist die Homogenität des Materials entscheidend für den kontinuierlichen Druck. Das Einbringen von Verunreinigungen oder Luftblasen sollte vermieden werden, da sie die Düse verstopfen und/oder die Extrusion stören können. 3) Die Spritzen sollten über den Luer-Lock-Mechanismus ordnungsgemäß an die Kern-/Schalendüse angeschlossen und korrekt in die Extruderhalterungen eingesetzt werden, wie in Abbildung 2A,Bzu sehen ist. 4) Vor dem Drucken einer komplexen Struktur wird empfohlen, einen kleinen Teil des Gels und die Vernetzungslösung vorzuextrudieren, um die überschüssigen Luftblasen in der Kern-/Schalendüse zu löschen und einen kontinuierlichen Hydrogelfluss zu gewährleisten. Dies kann direkt in den g-Code integriert werden, um die Wiederholbarkeit zu verbessern. 5) Es ist hilfreich, einen Rock um das Gerüst herum hinzuzufügen, um die Verlegung eines homogenen Hohlfilaments zu gewährleisten, bevor der Druck des Gerüstes selbst beginnt.
Zusätzlich, 6) zur Verbesserung der Haftung zwischen Druckfilament und Substrat, wird empfohlen, eine flache Oberfläche mit guter Haftung (d. h. eine Glasrutsche oder Petrischale) zu verwenden. 7) Die Extrusionsdüse sollte nicht in direktem Kontakt mit dem Substrat stehen, um einen unterbrechungsfreien Fluss des Hydrogels zu ermöglichen. Der anfangse Abstand wirkt sich stark auf die Qualität des Drucks aus, aber die Dicke des extrudierten Filaments ist eine gute Annäherung an die Anfangseinstellung. 8) Die Anfangsdruckhöhe im g-Code sollte an die individuellen Bedürfnisse angepasst werden. Nachdem die Druckparameter optimiert wurden, sollte der Gerüst-G-Code in die Planet CNC-Software importiert und der Druckprozess wie im Protokoll beschrieben gestartet werden. 9) Um den Hydrogelfluss mit der Absicht zu steuern und zu optimieren, um optimale Gerüste zu drucken, sollten sowohl die Formulierungszusammensetzung als auch die Druckparameter variiert werden (d. h. Druckgeschwindigkeit, Extrusionsdruck, Drucktemperatur, Abstand zwischen Substrat und Extrusionsdüse, Schichthöhe, Gerüstgröße usw.).
Im Allgemeinen sind höhere Durchflussraten erforderlich, um Formulierungen mit höherer Viskosität zu drucken. Wie bereits erwähnt, ermöglichen alle Hydrogelformulierungen, die für die sofortige chemische Vernetzung geeignet sind, eine einstufige Fertigung von Hohlrohren und können mit dem beschriebenen Kern-/Schalenaufbau verwendet werden. Die Druck- und Vernetzungsmechanismen müssen entsprechend optimiert werden. Nach dem Druck wurden alle Gerüste durch sekundäre Vernetzung mit 5 Gew.% CaCl2-Lösung nachbearbeitet, die eine vollständige Vernetzung der ALG-CMC-Komponente gewährleistete und von beiden Seiten unter uv-licht für mindestens 30 min sterilisiert wurde. Es sollte sichergestellt werden, dass das Gerüst mit der Vernetzungslösung vollständig verschlungen und lange genug inkubiert wird, um den Vernetzungsprozess abzuschließen. Die Nachbearbeitung unterscheidet sich je nach verwendetem Material und Vernetzungsmechanismus, der vorher in Betracht gezogen werden sollte. Nach der Nachbearbeitung sollten Gerüste sorgfältig vom Substrat entfernt, auf Zellkulturmedien übertragen und in einer kontrollierten Atmosphäre mindestens 24 h vor der Zellaussaat inkubiert werden. Die Verwendung eines farblosen Mediums verbessert die Sichtbarkeit der Zellsuspension während der Injektion in das Gerüst.
Live/dead assay
Die Lebende/Tote Lösung sollte direkt vor der Durchführung des Assays vorbereitet und im Dunkeln gehalten werden, bevor der Test durchgeführt wird, da er Fluoreszenzfarbstoffe enthält, die anfällig für Bleichen sind. Nach der gewünschten Inkubationszeit sollten die Zellkulturmedien sorgfältig um die Gerüste herum entsorgt und mit PBS abspült werden. Idealerweise sollte derselbe Einstiegspunkt für die Zellaussaat verwendet werden, gefolgt von dem Leben/Toten-Assay, der in die Gerüste injiziert wird.
Bedeutung der Ergebnisse
Sowohl ALG als auch CMC wurden bereits verwendet, um Angiogenese in vitro zu fördern. Basierend auf seinen ECM-mimetischen Eigenschaften, physikalischen Vernetzungen und Biokompatibilität wurde ALG häufig als Komponente für die Lieferung und kontrollierte Freisetzung von angiogenen Wachstumsfaktoren (z. B. bFGF, HGF, VEGF164 und Ang-1*) eingesetzt52 ,53,54. Darüber hinaus wurde CMC in Kombination mit Gelatine aufgrund seiner schnellen Vernetzungsfähigkeiten unter physiologischen Bedingungen auch zur Verkapselung von vaskulären Endothelzellen eingesetzt55. NFC wurde hinzugefügt, um die mechanische Stabilität und Formtreue von Gerüsten weiter zu erhöhen. Es sollte betont werden, dass das Ziel nicht darin bestand, die Vaskularisation zu verbessern, sondern die Möglichkeit der Herstellung von durchsetzbaren, hohlen ALG-CMC-Gerüsten zu demonstrieren, die in Kern-/Schalenform gedruckt werden, was auch die Befestigung und Proliferation von HUVECs. Die Wahl der Verwendung eines ALG-CMC-Gemischs basierte auf Erkenntnissen aus häufig verwendeten, leicht zugänglichen und biokompatiblen Grundmaterialien, die den Kern-/Schalendruck von Hohlkanälen ermöglichen könnten. Viele andere Materialien können praktikablere Optionen zur Verbesserung der Angiogenese sein; Einige sind jedoch nicht für den Kern-/Schalendruck geeignet, da sie keine schnelle Gelation/Vernetzung ermöglichen, was bei diesem Ansatz von entscheidender Bedeutung ist.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchten die finanzielle Unterstützung für dieses Projekt würdigen, die von der slowenischen Forschungsagentur (Fördernummern: P3-0036 und I0-0029) und dem Ministerium für Wissenschaft, Bildung und Sport (Zuschussnummer: 5442-1/2018/59) erhalten wurde.
Alginic acid sodium salt | Sigma-Aldrich (Germany) | 180947 | powder; Mw ~80,000 |
ATTC HUV-EC-C [HUVEC] | LGC Standards (UK) | ATCC-CRL-1730 | Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) and unidentified factors from bovine pituitary, hypothalamus or whole brain extracts are mitogenic for this line; the cells have a life expectancy of 50 to 60 population doublings. |
Axiovert 40 inverted optical microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH (Germany) | three contrastingtechniques in one objective – e.g. brightfield,phase contrast and PlasDIC | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich (Germany) | C1016 | anhydrou; granular; ≤7.0 mm; ≥93.0% |
Cellulose nanofibrils suspension (NFC, 3% (w/v)) | The Process Development Center, University of Maine (Maine, USA) | nominal fiber width of 50 nm; lengths of up to several hundred microns | |
ELGA Purelab water purification system | Veolia Water Technologies (UK) | ||
EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | AMF4300 | a fully integrated, digital, inverted imaging system for four-color fluorescence and transmitted-light applications |
Gibco Advanced Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Advance DMEM) | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | 12491015 | high glucose; no glutamine; phenol red |
Gibco Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | 21063029 | high glucose; L-glutamine; HEPES; no phenol red |
Gibco Fetal Bovine Serum (FBS), qualified | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | 10270106 | FBS origin: Brazil; 5 % (w/v) FBS |
Hypodermic Sterican needle | B. Braun Melsungen AG (Germany) | 9180117 | 0.40 x 25mm, 27G x 1'' |
L-glutamine | Sigma-Aldrich (Germany) | G3126 | ReagentPlus®, ≥99% (HPLC) |
Live/Dead Cell Double Staining Kit | Sigma-Aldrich (Germany) | 4511 | contains calcein-AM and propidium iodide (PI) solutions; suitable for fluorescence |
Nunc EasYFlask cell culture flasks | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | 156367 | Nunclon Delta certified for monolayer formation, cloning efficiency, non-cytotoxic, non-pyrogenic, and sterility; filter caps; culture area of 25 cm2 |
Omnifix syringe | B. Braun Melsungen AG (Germany) | 4617053V | 5 mL Luer Lock |
Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich (Germany) | P3032 | powder; BioReagent; suitable for cell culture |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich (Germany) | P4417 | tablet; one tablet dissolved in 200 mL of deionized water yields 0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4, at 25 °C |
Sodium carboxymethyl cellulose | Sigma-Aldrich (Germany) | 419338 | powder; average Mw ~700,000 |
Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich (Germany) | S9137 | powder; BioReagent; suitable for cell culture |
Ultra-pure water | Veolia Water Technologies (UK) | 18.2 mΩ cm at 25⁰C | |
VitaPrint 3D bio-printer | IRNAS (Slovenia) |