Apresentado aqui é um simples de usar, Core/Shell, tridimensional bioprinting set-up para uma etapa de fabricação de andaimes ocas, adequado para a engenharia de tecidos vasculares e outras estruturas tubulares.
A impressão tridimensional (3D) de filamentos do núcleo/escudo permite a fabricação direta de estruturas de canaleta com um escudo estável que seja Cross-linked na relação com um núcleo líquido. Este último é removido após a impressão, deixando atrás de um tubo oco. Integrando uma técnica de manufatura aditiva (como a descrita aqui com tintas medida [bio], que imitam estruturalmente e bioquimicamente a matriz extracelular nativa [ECM]) é um passo importante para a engenharia avançada de tecidos. No entanto, a fabricação precisa de estruturas bem definidas requer estratégias de fabricação personalizadas otimizadas para o material em uso. Portanto, é sensato começar com uma set-up que é personalizável, simples de usar e compatível com um amplo espectro de materiais e aplicações. Este trabalho apresenta um bocal do núcleo/escudo da fácil-à-manufatura com Luer-compatibilidade para explorar a impressão do núcleo/escudo de estruturas do lenha, testado com uma formulação bem definida, alginato-baseada do material do andaime.
Indiscutivelmente, o objetivo final da engenharia tecidual (te) é produzir tecidos ou órgãos funcionais in vitro, que podem ser usados para regenerar ou substituir partes feridas ou doentes do corpo humano1,2,3. A pesquisa atual em engenharia de tecidos (TE) está focada em aspectos individuais do campo (materiais de andaimes, procedimentos de fabricação, fontes de células, etc.) 4,5, bem como desenvolver modelos in vitro simples de tecidos e órgãos que imitam aspectos fundamentais de seus homólogos in vivo. Tais modelos já são úteis para muitas aplicações, tais como estudos de triagem de medicamentos etoxicidade, especialmentenos casos em que culturas de células 2Dconvencionais nãoimitam as respostas dinâmicas dos tecidos nativos6,7, 8,9. Os modelos in vitro tridimensionais são construídos geralmente combinando as pilhas10, as indicações physico-químicas 11, emoléculas biologicamente ativas12,13em andaimes, que são obtidos de tecidos decelularizados ou construídos de novo a partir de materiais biológicos ou biocompatíveis14,15,16,17,18.
É crucial que os andaimes recapitular a microarquitetura 3D complexa e a estrutura hierárquica dos tecidos nativos para permitir a funcionalidade dos tecidos projetados, representante de in vivo tecidos19. Apesar do avanço tecnológico significativo no TE, o desenvolvimento de construções de tecidos artificiais fisiologicamente relevantes continua sendo um desafio. Tecidos grossos (> 200 μm de espessura) são especialmente problemáticos, devido a limitações como oxigênio e difusão de nutrientes20. O progresso para construções maiores do tecido foi feito; Entretanto, a proximidade elevada exigida das pilhas aos vasos sanguíneos a fim transportar o oxigênio e os nutrientes e promover a remoção waste deve ser recapitulated. A vascularização dos tecidos (ou, alternativamente, a fabricação de redes vasculares 3D interconectadas dentro de construções teciduais) desempenha um papel crítico na manutenção da viabilidade celular e na promoção de funções de tecidos projetados in vitro, o que é mais difícil para modelos em experimentos prolongados21,22. Além disso, a resolução necessária, a integridade estrutural e a biocompatibilidade simultânea ainda não foram alcançadas23.
Várias abordagens de TE foram propostas na tentativa de construir estruturas semelhantes a vasos sanguíneos e facilitar a vascularização in vitro. Alguns exemplos incluem a semeadura de células endoteliais (também cocultivadas com outros tipos de células, como fibroblastos) que se montam para gerar redes microvasculares24, uso de células progenitoras vasculares e pericitos que promovem a célula endotelial crescimento21,25, a entrega de fatores de crescimento angiogênico que induzem a vascularização20,26, utilizando tecnologia de folha de células que permite o controle sobre a estratificação vascular20, e fabricação de estruturas altamente porosas do andaime que promovem a angiogênese27. As abordagens mencionadas incidem sobre a indução da angiogênese, que geralmente requer quantidades consideráveis de fatores de crescimento adicionais (por exemplo, VEGF) e tempo de forma. No entanto, as maiores desvantagens são sua reprodutibilidade limitada e controle espacial restrito sobre a padronização vascular, geralmente resultando em uma distribuição de vasculatura aleatória dentro da construção tecidual que não necessariamente facilita a perfusão.
A fabricação de aditivos (am, como a bioimpressão 3D) está cada vez mais envolvida na fabricação de construções 3D usando materiais biológicos ou biocompatíveis para criar andaimes adequados para te. Várias abordagens AM estão sendo usadas e desenvolvidas em paralelo (por exemplo, métodos baseados em jato de tinta e microextrusão, diferentes tipos de técnicas litográficas) para produzir andaimes que imitam tecidos nativos em sua arquitetura, bioquímica e funcionalidade . As técnicas individuais exibem certas vantagens e desvantagens28, razão pela qual várias modificações que estão sendo exploradas (por exemplo, micropadronização, angiogênese induzida, etc.) para aumentar a medida em que grande, complexa e estável vascular as redes podem ser fabricadas22,29,30.
Entre estes, a bioimpressão por extrusão é o método mais comumente usado, especialmente devido à ampla gama de materiais compatíveis (um processo geralmente amigável para células28,31,32), bem como versatilidade excepcional em termos de aplicações (por exemplo, impressão incorporada e sacrificial23,33, fabricação de estruturas ocas34,35, etc.). Os principais desafios que ocupam os estudos atuais incluem a transferência de estruturas 2D para 3D, a formação de uma densa rede de tubos ocos com alta resolução espacial, e a integridade mecânica geral e a fidelidade da forma durante o fluxo de fluido na cultura celular condições de30.
A aproximação a mais direta ao tecido perfusable é a fabricação de uma rede interconectada dos canais dentro do constructo. A criação de tais canais perfusable dentro de um andaime do tecido é esperada resolver muitos dos problemas acima mencionados, porque permite imediatamente a difusão do nutriente e do oxigênio ao remover produtos waste. Conseqüentemente, a formação potencial de regiões Necrotic dentro do constructo é evitada36. Esses canais podem adicionalmente ser semeados com células endoteliais (ECs) e servir como vasos sanguíneos artificiais em modelos de tecido 3D37. No sentido mais elementar, uma embarcação pode consistir em um canal oco, camada macia de ECs, e casca dura. Recentemente, a extrusão 3D de dois materiais diferentes em uma forma do núcleo/escudo que utiliza agulhas co-axiais para a extrusão ganhou muito interesse38,39,40,41, porque permite a fabricação de tubos ocos.
Similar à impressão 3D convencional da microextrusão, a impressão do núcleo/escudo é executada com um bocal co-axial (por exemplo, duas agulhas com diâmetros diferentes alinhados no mesmo eixo em uma maneira, de modo que a agulha mais larga encerque o mais estreito). Assim, dois materiais podem ser extrudados simultaneamente, com um como o filamento central ou núcleo “interno” e um segundo como o escudo “exterior”41. Até o momento, a bioimpressão co-axial tem sido utilizada para fabricar estruturas com sólidos42, Core/Shell43e fios ocos40,44; no entanto, os materiais utilizados não foram otimizados para a viabilidade celular ideal e robustez mecânica das construções impressas. Como mencionado, a técnica oferece a possibilidade de combinar biomateriais com diferentes propriedades mecânicas, nas quais o mais rígido suporta o mais macio. Mais importante, se o material do andaime (por exemplo, alginato, carboximetilo celulose) é expulso como o escudo, enquanto o núcleo composto do agente de ligação cruzada (por exemplo, cloreto de cálcio) é dispensado do capilar interno, em seguida, enxaguado para fora pós-impressão, é possível fabricar um tubo oco contínuo em uma única etapa45.
Com isto em mente, um método simples e repetível de uma etapa foi desenvolvido para construir andaimes bem definidos e perfusable para a engenharia de estruturas vasculares e outros tecidos tubulares. Para desenvolver uma tecnologia rentável, a fabricação deve idealmente ser um processo de passo único. Portanto, um núcleo/Shell set-up foi adaptado e integrado na bioprinter 3D. O projeto básico consiste em um bocal central feito do metal para evitar a deformação durante a injeção, em torno de que um segundo bocal de um diâmetro maior é coloc. Tal ajuste do bocal co-axial permite a coextrusão dos dois fluxos e o cross-linking imediato do canal expulso do hidrogel. Isto permite a fabricação direta de filamentos ocos multicamadas, quando o cross-linking subseqüente com umas concentrações mais elevadas de cloreto de cálcio (CaCl2) assegura uma estabilização mais permanente da parte externa.
Como tal, este método permite a impressão simultânea de andaimes e microcanais, em que os filamentos ocos do hidrogel servem como um andaime para suportar a integridade mecânica de construções 3D e atuam simultaneamente como microcanais incorporados para entregar nutrientes para o crescimento celular. Este protocolo fornece um procedimento detalhado da estratégia bioprinting do núcleo/escudo 3D baseado no uso de um bocal co-axial feito-à-medida em que as estruturas do hidrogel 3D com canaletas internas são fabricadas controlando o cross-linking para produzir filamentos ocos, que permanecem perfusable durante a cultura da pilha.
A configuração de impressão 3D usada neste trabalho é configurada como descrita anteriormente por Banović e Vihar46 e pode ser dividida em três componentes principais: a) uma configuração mecânica CNC de três eixos com precisão de posicionamento de 50 μm nas direções X, Y e Z; B) duas extrusoras, adaptadas para seringas descartáveis de 5 mL de Luer-Lock, com resolução de 1,2 μL de VOXEL; e C) controlando a eletrônica e o software.
Para facilitar a impressão do núcleo/escudo, um bocal apropriado foi desenvolvido que possa ser montado em uma das extrusoras (extrusora preliminar, imprimindo o núcleo) e é compatível com as agulhas Blunt-end G27. Igualmente tem a compatibilidade do luer-fechamento para conectar com a segunda extrusora (imprimindo o escudo). Os primeiros protótipos foram fabricados através da inserção de uma agulha G27 (diâmetro interno = 210 μm, diâmetro externo = 410 μm) em uma agulha G21 (diâmetro interno = 510 μm, diâmetro externo = 820 μm) ou ponta cônica do G20 (diâmetro interno = 600 μm), inserindo um n secundário Marjorie lateralmente para fornecer o material do escudo. No entanto, devido à ligeira dobra do eixo da agulha, não é possível produzir uma ponta de bico com alinhamento concêntrico das agulhas internas e exteriores.
Para resolver esta edição, um projeto novo do bocal foi elaborado que cumpriu os seguintes critérios: 1) pode ser manufacturado usando um moinho do CNC de 3 eixos, 2) pode ser feito dos vários materiais (plásticos do elevado desempenho, tais como o auge ou os metais), 3) tem a compatibilidade do luer-fechamento para aplicar o material da casca, e 4) é compatível para uma agulha Blunt-end G27 e prende-o no lugar em duas posições para alinhar a ponta com o eixo central. Um esquema do protótipo do bico é mostrado na Figura 1.
Projeto do bocal
Usando o núcleo desenvolvido/bocal do escudo, integrado em um sistema de vitaprint da dois-extrusora, os andaimes tubulares, tubular foram fabricados em um processo da único-etapa. Para conseguir uma espessura mesmo da parede do tubo com a maioria dos scaffolds preparados, a agulha precisa de ser posicionada centralmente no eixo do anel exterior da extrusão. As agulhas padrão do calibre exibem frequentemente uma excentricidade ligeira, contudo significativa fora da linha central. Assim, o corpo do bico foi projetado para segurar a agulha em dois lugares, uma vez na parte superior (fixação do cubo) e uma vez antes do núcleo final/câmara de casca (fixação da cânula em si), corrigindo o seu alinhamento axial. A precisão do alinhamento axial aumenta com a distância entre o ponto de fixação. Há, entretanto, um compensação entre o comprimento da agulha e o volume disponível da câmara do bocal. Para melhorar a funcionalidade da configuração mais adicional, determinadas modificações do bocal podem ser executadas: A) uma montagem do bocal com estabilidade melhorada, B) bocais adicionais para uma escala mais larga da compatibilidade da agulha, C) um mecanismo preciso do ajuste para a agulha a posicionamento do bocal, e D) integrando entradas adicionais e dispositivos microfluídicos para na preparação material da mosca.
Otimização de hidrogel
Para determinar a relação ideal de ALG: CMC, várias iterações de material foram avaliadas. Geralmente, a impressão do núcleo/escudo com concentrações acima de 3 WT .% de ambos os componentes foi rendida impossível, porque não permitiu um fluxo contínuo do hidrogel ou conduziu ao entupimento do bocal. Especificamente, a concentração de ALG acima de 3 WT .% aumentou a viscosidade excessivamente e conduziu à obstrução do bocal, quando umas mais baixas concentrações de ALG e umas concentrações mais elevadas de CMC (> 3 WT .%) abrandaram épocas cross-linking e assim não fornecerem suficiente apoio estrutural do andaime. A impressão de núcleo/casca foi possível com formulações menos viscosas; no entanto, a viscosidade do gel extrudido deve ser suficiente para sustentar a fidelidade de forma a longo prazo. No final, uma proporção de 1:1 ALG: CMC foi comprovada como a escolha mais adequada, confirmando um estudo prévio de Maver et al.49. A adição de NFC melhorou significativamente a printabilidade e a rigidez estrutural de andaimes impressos de núcleo/casca, mas não teve efeito significativo nas propriedades de vinculação cruzada do material.
Aplicativos personalizados, otimizados para tipos específicos de células e set-ups experimentais exigirá materiais de andaime bem adaptados, que variarão em mecanismos de composição e cross-linking. O método descrito neste trabalho é baseado em uma solução de polímero misto de alginato-celulose, que é ligada ionicamente através de íons Ca2 + . Alginato em si é um polímero linear de blocos de (1,4)-ligado β-d-mannuronate (M) e α-l-guluronate (G) resíduos que podem ser reversivelmente ionicamente reticulado pela aplicação de CA2 + e outras cátions divalentes como Sr2 +, br2 +, mg 2 +. No entanto, o íon mais amplamente utilizado para cross-linking de alginato permanece CA2 + na forma de CAcl2. CA2 + também pode ser usado na forma de caso4 ou caco3; no entanto, a baixa solubilidade do CaSO4 em relação ao CAcl2 significa uma gelação mais lenta. O CaCO3 produz tempos de gelação ainda mais lentos, o que pode resultar em propriedades mecânicas fracas e inconsistentes.
Tempos de gelação mais longos normalmente produzem uma construção mais homogênea, no entanto, determinadas aplicações, como a impressão de núcleo/casca requer taxas de gelação rápida50. Mg2 + íons também induzir a geladura; no entanto, a sua eficiência de ligação cruzada é de cerca de 5x-10x menor, em comparação com CA2 +, com cross-linking vezes de 2-3 h. Além, os íons do magnésio são mais seletivos para unidades oligo, daqui o cross-linking depende mais da composição química do alg51. Neste caso, uma taxa rápida da gelação é essencial assegurar a formação oca contínua da canaleta antes que a estrutura oca possa desmoronar. O CaCl2 rende a taxa a mais rápida da Geladura, que é crucial para a deposição direta de filamentos ocos. 100 mM CaCl2 foi utilizado, que estabilizou adequadamente a formação contínua de um filamento oco sem causar a solidificação do gel dentro do bocal.
Impressão e pós-processamento de andaimes
As seguintes etapas devem ser consideradas durante esta parte do processo, incluindo 1) assegurando-se de que todas as soluções e materiais que incluem o bioimpressora 3D estejam esterilizados corretamente antes de imprimir. 2) ao preparar o Hydrogel, a homogeneidade do material é crucial para a impressão contínua. A introdução de impurezas ou bolhas de ar deve ser evitada, pois eles podem entupir o bico e/ou interromper a extrusão. 3) as seringas devem ser conectadas corretamente ao bocal do núcleo/escudo através do mecanismo do luer-fechamento e introduzido corretamente nas montagens da extrusora como visto na Figura 2a, B. 4) antes de imprimir uma estrutura complexa, recomenda-se pre-extrude uma parcela pequena do gel e da solução cross-linking para cancelar as bolhas de ar excedentes no bocal do núcleo/escudo e para assegurar um fluxo contínuo do hidrogel. Isso pode ser incorporado diretamente no código g para melhorar a repetibilidade. 5) é útil adicionar uma saia que circunda o andaime para assegurar a colocação de um filamento oco homogêneo antes que a impressão do andaime próprio comece.
Além disso, 6) para melhorar a aderência entre o filamento de impressão e substrato, recomenda-se a utilização de uma superfície plana com boa aderência (ou seja, uma lâmina de vidro ou placa de Petri). 7) o bocal da extrusão não deve estar no contato direto com a carcaça para permitir o fluxo ininterrupto do Hydrogel. A distância inicial impactará fortemente a qualidade da cópia, mas a espessura do filamento expulso é uma boa aproximação do ajuste inicial. 8) a altura de impressão de partida no g-código deve ser ajustada de acordo com necessidades individuais. Depois que os parâmetros da impressão são otimizados, o g-código do andaime deve ser importado no software do CNC do planeta e no processo de impressão começado como descrito no protocolo. 9) para controlar e otimizar o fluxo de hidrogel com a intenção de imprimir os scaffolds ideais, tanto a composição da formulação como os parâmetros de impressão devem ser variados (i.e., velocidade de impressão, pressão de extrusão, temperatura de impressão, distância entre o substrato e bocal de extrusão, altura da camada, tamanho do andaime, etc.).
Em geral, maiores taxas de fluxo são necessárias para imprimir formulações com maior viscosidade. Como mencionado, todas as formulações do hidrogel, que são apropriadas para o cross-linking químico imediato, permitem a fabricação de uma etapa de tubos ocos e podem ser usadas com o núcleo descrito/conjunto-acima do escudo. Os mecanismos de impressão e cross-linking precisam ser otimizados de acordo. Após a impressão, todos os andaimes foram pós-processados por cross-linking secundário com 5 WT .% CaCl2 solução, que garantiu completa cross-linking do componente alg-CMC e esterilizado de ambos os lados uma luz UV por pelo menos 30 min. Deve ser assegurado para engolir completamente o andaime com a solução cross-linking e incubar por o tempo bastante para terminar o processo cross-linking. O pós-processamento será diferente com base no material e no mecanismo de cross-linking usado, que deve ser considerado de antemão. Após o pós-processamento, os andaimes devem ser removidos cuidadosamente do substrato, transferidos para meios de cultura celular e incubados em atmosfera controlada por pelo menos 24 h antes da semeadura da célula. Usar um meio incolor melhorará a visibilidade da suspensão da pilha durante a injeção nos scaffolds.
Ensaio ao vivo/morto
A solução viva/inoperante deve ser preparada diretamente antes de conduzir o ensaio e ser mantida no escuro antes de conduzir o ensaio, porque contem as tinturas da fluorescência que são propensas ao branqueamento. Após o tempo de incubação desejado, os meios de cultura da pilha devem com cuidado ser descartados em torno dos andaimes e enxaguados com PBS. Idealmente, o mesmo ponto de entrada deve ser usado para a semeadura da pilha seguida pelo ensaio vivo/inoperante que está sendo injetado nos scaffolds.
Importância dos resultados
Tanto a ALG como a CMC já foram utilizadas para promover a angiogênese in vitro. Com base em suas características ECM-mimmetic, cross-linking físico, e biocompatibility, alg foi empregado geralmente como um componente para a entrega e a liberação controlada de fatores de crescimento angiogênico (por exemplo, bFGF, HGF, VEGF164, e ang-1 * respectivamente)52 ,53,54. Além disso, em combinação com gelatina, a CMC também tem sido utilizada para encapsuar células endoteliais vasculares devido às suas capacidades de ligação cruzada rápida condições fisiológicas55. A NFC foi adicionada para aumentar ainda mais a estabilidade mecânica e a fidelidade da forma dos scaffolds. Ressalta-se que o objetivo não foi o de potencializar a vascularização, mas demonstrar a possibilidade de produzir andaimes ALG-CMC, estampados em forma de núcleo/concha, que também facilita o apego e a proliferação de HUVECs. A escolha do uso de uma mistura ALG-CMC foi baseada em achados de materiais de base comumente usados, de fácil acesso e biocompatíveis que poderiam permitir a impressão de núcleo/casca de canais ocos. Muitos outros materiais podem ser opções mais viáveis para melhorar a angiogênese; Entretanto, alguns não são apropriados para a impressão do núcleo/escudo, porque não facilitam a gelação rápida/cross-linking, que é crucial nesta aproximação.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de reconhecer o apoio financeiro para este projeto recebido da Agência de pesquisa eslovena (números de subvenção: P3-0036, e i0-0029), e do Ministério da ciência, educação e desporto (número de subvenção: 5442-1/2018/59).
Alginic acid sodium salt | Sigma-Aldrich (Germany) | 180947 | powder; Mw ~80,000 |
ATTC HUV-EC-C [HUVEC] | LGC Standards (UK) | ATCC-CRL-1730 | Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) and unidentified factors from bovine pituitary, hypothalamus or whole brain extracts are mitogenic for this line; the cells have a life expectancy of 50 to 60 population doublings. |
Axiovert 40 inverted optical microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH (Germany) | three contrastingtechniques in one objective – e.g. brightfield,phase contrast and PlasDIC | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich (Germany) | C1016 | anhydrou; granular; ≤7.0 mm; ≥93.0% |
Cellulose nanofibrils suspension (NFC, 3% (w/v)) | The Process Development Center, University of Maine (Maine, USA) | nominal fiber width of 50 nm; lengths of up to several hundred microns | |
ELGA Purelab water purification system | Veolia Water Technologies (UK) | ||
EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | AMF4300 | a fully integrated, digital, inverted imaging system for four-color fluorescence and transmitted-light applications |
Gibco Advanced Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Advance DMEM) | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | 12491015 | high glucose; no glutamine; phenol red |
Gibco Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | 21063029 | high glucose; L-glutamine; HEPES; no phenol red |
Gibco Fetal Bovine Serum (FBS), qualified | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | 10270106 | FBS origin: Brazil; 5 % (w/v) FBS |
Hypodermic Sterican needle | B. Braun Melsungen AG (Germany) | 9180117 | 0.40 x 25mm, 27G x 1'' |
L-glutamine | Sigma-Aldrich (Germany) | G3126 | ReagentPlus®, ≥99% (HPLC) |
Live/Dead Cell Double Staining Kit | Sigma-Aldrich (Germany) | 4511 | contains calcein-AM and propidium iodide (PI) solutions; suitable for fluorescence |
Nunc EasYFlask cell culture flasks | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | 156367 | Nunclon Delta certified for monolayer formation, cloning efficiency, non-cytotoxic, non-pyrogenic, and sterility; filter caps; culture area of 25 cm2 |
Omnifix syringe | B. Braun Melsungen AG (Germany) | 4617053V | 5 mL Luer Lock |
Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich (Germany) | P3032 | powder; BioReagent; suitable for cell culture |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich (Germany) | P4417 | tablet; one tablet dissolved in 200 mL of deionized water yields 0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4, at 25 °C |
Sodium carboxymethyl cellulose | Sigma-Aldrich (Germany) | 419338 | powder; average Mw ~700,000 |
Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich (Germany) | S9137 | powder; BioReagent; suitable for cell culture |
Ultra-pure water | Veolia Water Technologies (UK) | 18.2 mΩ cm at 25⁰C | |
VitaPrint 3D bio-printer | IRNAS (Slovenia) |