हम एक साथ विभिन्न वायरस उपभेदों से 250 से अधिक प्रतिजनों के खिलाफ कई एंटीबॉडी आइसोटाइप के लिए सीरम की जांच करने के लिए नाइट्रोसेलुलोस लेपित स्लाइड पर इन्फ्लूएंजा एंटीजन मुद्रण द्वारा निर्मित एक प्रोटीन microarray का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, इस प्रकार वायरस subtypes भर में सीरम एंटीबॉडी की चौड़ाई की माप की अनुमति.
इन्फ्लूएंजा वायरस वर्तमान में उपलब्ध टीकों की सीमित प्रभावशीलता के कारण दुनिया भर में मृत्यु का एक महत्वपूर्ण कारण बना हुआ है. सार्वभौमिक इन्फ्लूएंजा टीकों के विकास के लिए एक प्रमुख चुनौती उच्च एंटीजेनिक विविधता एंटीजेनिक बहाव से उत्पन्न है. इस चुनौती पर काबू पाने के लिए विभिन्न एंटीजेनिक उपप्रकारों में कई वायरस उपभेदों के खिलाफ निर्देशित सीरम एंटीबॉडी की चौड़ाई को मापने के लिए उपन्यास अनुसंधान उपकरण की आवश्यकता है। यहाँ, हम इन्फ्लूएंजा प्रतिजनों के एक प्रोटीन microarray का उपयोग कर विविध इन्फ्लूएंजा वायरस उपभेदों के खिलाफ सीरम एंटीबॉडी की चौड़ाई का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं.
इस इन्फ्लूएंजा एंटीजन microarray एक microarray प्रिंटर का उपयोग कर एक नाइट्रोसेल्यूलोस लेपित झिल्ली पर शुद्ध hemagglutinin और neuraminidase प्रतिजन मुद्रण द्वारा निर्माण किया है. मानव सीरा इन्फ्लूएंजा एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी बाध्य करने के लिए microarray पर incubated रहे हैं। क्वांटम डॉट-संयोजित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग माइक्रोरेरे पर प्रत्येक प्रतिजन के लिए बाध्यकारी आईजीजी और आईजीए एंटीबॉडी का एक साथ पता लगाने के लिए किया जाता है। मात्रात्मक एंटीबॉडी बाइंडिंग को एक पोर्टेबल इमेजर का उपयोग करके फ्लोरोसेंट तीव्रता के रूप में मापा जाता है। प्रतिनिधि परिणाम मानव सीरा में उपप्रकार-विशिष्ट और पार प्रतिक्रियाशील इन्फ्लूएंजा एंटीबॉडी को मापने में परख reproducibility प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है.
इस तरह के एलिसा के रूप में पारंपरिक तरीकों की तुलना में, इन्फ्लूएंजा प्रतिजन microarray एक कम समय सीमा में प्रतिजनों के सैकड़ों के खिलाफ कई एंटीबॉडी आइसोटाइप के लिए सीरा के सैकड़ों परीक्षण करने में सक्षम एक उच्च थ्रूपुट बहुसंकेतित दृष्टिकोण प्रदान करता है, और इस तरह है सीरो-सर्वेक्षण और वैक्सीन विकास में आवेदन। एक सीमा बाध्यकारी एंटीबॉडी को एंटीबॉडी को निष्क्रिय करने से अलग करने में असमर्थता है।
इन्फ्लूएंजा वायरस मौत या विकलांगता से सालाना 20 लाख जीवन वर्ष के नुकसान के लिए जिम्मेदार है, दुनिया भर में हर साल सभी मौतों का 1% सहित, उष्णकटिबंधीय और विकासशील दुनिया में बुजुर्गों और आबादी पर आय से अधिक प्रभावों के साथ1, 2,3. मौसमी महामारियों के रोग के बोझ के अलावा, आनुवंशिक फिर से वर्गीकरण के माध्यम से उपन्यास इन्फ्लूएंजा उपभेदों के उद्भव या तो स्वाभाविक रूप से आम मेजबानों में या कृत्रिम रूप से जैव आतंकवाद के लिए तेजी से प्रसार और उच्च घातकता के साथ दुनिया भर में महामारी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं 4 , 5.जबकि कई इन्फ्लूएंजा टीके वर्तमान में उपलब्ध हैं, उनकी प्रभावशीलता उपप्रकार विशिष्टता6द्वारा सीमित है , सार्वभौमिक इन्फ्लूएंजा टीके है कि कई वायरस के खिलाफ लंबे समय से स्थायी प्रतिरक्षा प्रदान विकसित करने की आवश्यकता पैदा तनाव7|
सार्वभौमिक इन्फ्लूएंजा टीकों के विकास के लिए एक प्रमुख चुनौती उपभेदों भर में उच्च antigenic विविधता है. घूम वायरस के एंटीजेनिक भिन्नता के साथ संयुक्त वर्तमान टीकों की एंटीजेनिक विशिष्टता वैक्सीन उपभेदों और घूम उपभेदों के बीच एक बेमेल बनाता है। यह एक महामारी के दौरान वैक्सीन के उपभेदों से आगे आनुवंशिक बहाव के पक्ष में एक विकासवादी लाभ प्रदान करता है , जो अक्सर 50%8,9से कम तक सीमित होता है . एंटीजेनिक बेमेल का एक अतिरिक्त स्रोत अंडे के अनुकूली वायरल उत्परिवर्तनों टीके के निर्माण के दौरान उत्पन्न होता है, जो एंटीबॉडी के लिए नेतृत्व करता है जो खराब वायरस को घूम करने के लिए बाध्यकरता है 10,11.
उच्च एंटीजेनिक विविधता की इस चुनौती पर काबू पाने के लिए पहले से मौजूद की चौड़ाई की विशेषता के लिए उपन्यास अनुसंधान उपकरणों की आवश्यकता होगी और सीरम और म्यूकोसल नमूनों में नैदानिक रूप से प्रासंगिक एंटीजेनिक वेरिएंट में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रकाश में लाया जाएगा। वर्तमान में उपलब्ध तरीकों, hemaglutination निषेध (HAI), microneutralization (MN), और पारंपरिक ELISA सहित, एक समय में एक एकल वायरस तनाव के खिलाफ एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए सीमित हैं, तो कई एंटीबॉडी आइसोटाइप का पता लगाने के लिए उनके उपयोग कई वायरस उपभेदों के खिलाफ जल्दी से उपलब्ध नैदानिक नमूना और प्रयोगशाला संसाधनों exhausts. इसके अलावा, HAI और MN लाइव वायरस संस्कृति है कि केवल विशेष प्रयोगशालाओं में उपलब्ध है की आवश्यकता है.
प्रोटीन माइक्रोरेरे, संभावित रूप से हजारों एंटीजनों से मिलकर, जो चित्र 1में दर्शाए अनुसार नाइट्रोसेलुलोस-कोट्ड स्लाइडों पर मुद्रित होते हैं, इस आवश्यकताको 12भर सकते हैं। इन microarrays का उत्पादन किया जा सकता है और एक उच्च थ्रूपुट तरीके से जांच की, जबकि नैदानिक नमूना की छोटी मात्रा लेने के लिए मात्रात्मक एंटीबॉडी आइसोटाइप / एंटीजन खोज के लिए यह दृष्टिकोण कई संक्रामक रोगजनकों के खिलाफ नैदानिक और टीका के विकास के लिए लागू किया गयाहै 13. आज तक, हमने 35 से अधिक रोगजनकों के लिए प्रोटीन माइक्रोरेरेसिस का उत्पादन किया है, जिसमें 60,000 से अधिक कुल व्यक्त प्रोटीन शामिल हैं और संक्रमित और नियंत्रण व्यक्तियों से 30,000 से अधिक मानव सीरा की जांच करने के लिए उनका उपयोग किया गया है। माइक्रोरे स्लाइड के लिए हाल ही में विकसित पोर्टेबल इमेजिंग प्लेटफॉर्म ने इस पद्धति को अंतिम उपयोगकर्ता14के लिए अधिक सुलभ बना दिया है.
क्षेत्र में कई योगदानकर्ताओं द्वारा व्यापक पिछले काम पर बिल्डिंग15,16,17,18,19, एक इन्फ्लूएंजा प्रोटीन microarray हाल ही में विकसित किया गया था कि अधिक शामिल 250 शुद्ध हेमाग्लूटिनिन (एचए) सभी 18 उपप्रकारों12,20के प्रतिनिधित्व के साथ एंटीजेनिक वेरिएंट . इस पद्धति का उपयोग करते हुए, एक प्राकृतिक इन्फ्लूएंजा संक्रमण को मोटे तौर पर प्रतिक्रियाशील आईजीजी और आईजीए एंटीबॉडी को जातिवृत् तीय रूप से संबंधित हा उपप्रकारों के खिलाफ उत्पन्न करने के लिए प्रदर्शित किया गया था, जबकि एक इंट्रामस्क्युलर इन्फ्लूएंजा टीकाकरण केवल उप-प्रकार-विशिष्ट आईजीजी उत्पन्न करता था एंटीबॉडी21| हालांकि, एक सहायक है कि इन्फ्लूएंजा टीकों के लिए टोल की तरह रिसेप्टर्स को सक्रिय जोड़ने के लिए पशु अध्ययन22में हा उपप्रकारों भर में प्राप्त आईजीजी एंटीबॉडी प्रतिक्रिया को व्यापक करने के लिए दिखाया गया था.
इस microarray वर्तमान में कॉलेज के छात्रों को जो इन्फ्लूएंजा संक्रमण के लिए पीछा किया गया के एक संभावित सहगण अध्ययन से एकत्र सीरा की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है. यहाँ, इस अध्ययन से नमूनों के एक सबसेट में उपप्रकार-विशिष्ट और पार प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए परख reproducibility के प्रदर्शन के साथ इन्फ्लूएंजा प्रतिजन microarray की पद्धति की सूचना दी है.
इन्फ्लूएंजा प्रतिजन microarray प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित किसी भी परियोजना है कि कई प्रतिजनों के लिए एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने की आवश्यकता के लिए अनुकूलनीय है. माइक्रोरेरे प्लेटफार्म का उपयोग किसी भी प्रणाली में व्यक्त प्रोटीन प्रतिजनों के किसी भी वांछित सेट के साथ किया जा सकता है जो 0.1 मिलीग्राम/एमएल या अधिक उपज को प्राप्त कर सकता है जो पहले वर्णित12के रूप में शुद्धि के साथ या बिना अधिक उपज प्राप्त कर सकता है। यदि गैर-शुद्ध प्रोटीन प्रतिजन (उदाहरण के लिए, इन विट्रो प्रतिलेखन और अनुवाद प्रणाली में व्यक्त) सीधे microarrays मुद्रित करने के लिए उपयोग किया जाता है, प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली के घटकों (जैसे, ई. कोलाई lysate) के लिए इस्तेमाल बफर अवरुद्ध करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए 1:10 इन घटकों के खिलाफ निर्देशित किसी भी एंटीबॉडी को ब्लॉक करने के लिए सीरा और गुणवत्ता नियंत्रण एंटीबॉडी का कमजोर पड़ने। स्लाइड विन्यास सरणी प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति जनन की एक उच्च संख्या को समायोजित करने के लिए प्रत्येक स्लाइड पर बड़े पैड की एक कम संख्या के साथ उपलब्ध हैं. इस अध्ययन के लिए, हम एक GeneMachines OmniGrid 100 microarray प्रिंटर है कि पिन है कि सीधे नाइट्रोसेलुलोस सतह से संपर्क करने के लिए सरणी पर धब्बे जमा का इस्तेमाल किया. हालांकि इस microarray प्रिंटर अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है, अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microarray प्रिंटर इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन कस्टम पिन की आवश्यकता हो सकती है (या तो संपर्क या गैर संपर्क) और सॉफ्टवेयर और पर्याप्त स्थान संकल्प होना चाहिए और स्लाइड और इमेजर के साथ संगतता। सीरा की सक्रियता के आधार पर, 1:50 से 1:400 तक कमजोर पड़ने का उपयोग किया जा सकता है। सीरम मुक्त बफर एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि एंटीजन के लिए बाध्य करने के लिए जाना जाता मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
उपयोगकर्ताओं को कुछ समस्या निवारण समस्याओं के बारे में पता होना चाहिए। अपने टैग के लिए एंटीबॉडी का उपयोग कर गुणवत्ता नियंत्रण की जांच का उद्देश्य किसी भी प्रतिजनों जिसके लिए मुद्रण सफल नहीं था के लिए जाँच करने के लिए है। किसी भी स्थान है कि लगातार कई सरणियों की गुणवत्ता नियंत्रण की जांच में कम संकेत देने की संभावना अपर्याप्त प्रतिजन मुद्रित प्रतिनिधित्व करते हैं. संभावित कारणों में एकत्रीकरण या वर्षण या स्रोत प्लेट में प्रतिजन या नाइट्रोसेलुलोस पैड की चर मोटाई के कारण प्रिंटिंग पिन और माइक्रोरे स्लाइड के बीच खराब संपर्क शामिल हैं। इस बिंदु पर, हम गुणवत्ता नियंत्रण की जांच के मात्रात्मक परिणामों के आधार पर परख सामान्यीकरण नहीं करते हैं, यह देखते हुए कि एंटी-हिस एंटीबॉडी का पता लगाया गया बाइंडिंग इस टैग की उपलब्धता से प्रभावित हो सकता है, जो 3-आयामी अनुरूपता पर निर्भर करता है प्रत्येक प्रतिजन के लिए विशिष्ट.
इन्फ्लूएंजा प्रतिजन microarray ऐसे एलिसा के रूप में पारंपरिक तरीकों पर कई लाभ प्रदान करता है और ऐसे HAI और MN के रूप में कार्यात्मक परख के लिए पूरक है. 16-पैड प्रोटीन microarray एक नमूना-sparing प्रौद्योगिकी के साथ कई आइसोटाइप के एंटीबॉडी को मापने के लिए क्षमता के साथ एक साथ लगभग 300 प्रतिजनों से 1 $L सीरम के. प्रति स्लाइड पैड की संख्या कम करके प्रति एंटीजन की संख्या हजारों करने के लिए बढ़ाया जा सकता है. बहुसंकेतित परख भी कर्मियों के समय और उपभोग्य संसाधनों को छोड़ देता है, यह देखते हुए कि सीरा के सैकड़ों 2 दिनों में एंटीबॉडी के लिए जांच की जा सकती है, और स्लाइड और अभिकर्मकों के अलावा अन्य सभी सामग्री फिर से उपयोगी हैं तो प्लास्टिक कचरे की बड़ी मात्रा उत्पन्न नहीं करते हैं।
जबकि microarray प्रिंटर व्यापक रूप से वितरित नहीं किया जा सकता है, microarray स्लाइड एक केंद्रीकृत स्थान पर मुद्रित किया जा सकता है और फिर जांच के लिए अंत उपयोगकर्ता के लिए ले जाया. केवल जांच के लिए आवश्यक उपकरण कम लागत और पोर्टेबल imager है. इस प्रोटोकॉल के प्रसार का लक्ष्य इस तकनीक का अधिक व्यापक उपयोग करना है।
इन्फ्लूएंजा प्रतिजन microarray की मुख्य सीमाओं का पता चला एंटीबॉडी के समारोह और गतिजता की विशेषता करने में असमर्थता कर रहे हैं. microarray प्रत्येक प्रतिजन के लिए बाध्यकारी एंटीबॉडी के एक polyclonal सेट का पता लगाने है. ये एंटीबॉडी हो सकता है या HAI और MN assays में वायरस को निष्क्रिय करने में कार्यात्मक नहीं हो सकता है. हालांकि, HAI और MN परख ोंलुएंजा के एवियन उपप्रकारों के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए परीक्षण करने के लिए उच्च स्तरीय जैव सुरक्षा अलमारियाँ के साथ विशेष सुविधाओं के लिए संबद्ध की जरूरत के साथ लाइव वायरस संस्कृति की आवश्यकता है, जबकि प्रोटीन microarray लाइव वायरस शामिल नहीं है घटक तो किसी भी बुनियादी प्रयोगशाला में उपयोग किया जा सकता है. बाध्यकारी गतिकी के संबंध में, प्रत्येक प्रतिजन की एक एकल एकाग्रता युक्त एक सरणी के साथ जांच सीरम का एक कमजोर पड़ने एक एकल डेटा बिंदु पैदावार, जो मात्रा और आत्मीयता का एक समग्र सभी एंटीबॉडी है कि प्रतिजन के लिए बाध्य पर summated का प्रतिनिधित्व करता है . पूरी तरह से एंटीजन-एंटीबॉडी बंधन गतिकी को हल करने के लिए, कई एंटीजन सांद्रता और /
इन सीमाओं के बावजूद, इन्फ्लूएंजा प्रतिजन microarray एक उपयोगी उपकरण के लिए एंटीजेनिक परिदृश्य है कि कार्यात्मक परख है कि अधिक थ्रूपुट और उपलब्धता में सीमित हैं पूरक कर सकते हैं भर इन्फ्लूएंजा एंटीबॉडी की चौड़ाई की विशेषता है.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों को प्रो डॉन मिल्टन स्वीकार करना चाहते हैं (एप्लाइड सार्वजनिक स्वास्थ्य संस्थान, मैरीलैंड विश्वविद्यालय, कॉलेज पार्क, एमडी, संयुक्त राज्य अमेरिका) मैरीलैंड आईआरबी प्रोटोकॉल के विश्वविद्यालय के तहत मानव सीरा इकट्ठा करने के लिए #313842 DARPA N66001-18-2-4015 P00001 द्वारा वित्त पोषित. लेखकों को भी प्रो फ्लोरियन Krammer स्वीकार करना चाहते हैं (Icahn स्कूल ऑफ मेडिसिन, माउंट Sinai, NY, संयुक्त राज्य अमेरिका) TRIMerized हा और NA एंटीजन ODNI IARPA DJF-15-1200-K-0001725 द्वारा वित्त पोषित प्रदान करने के लिए. एस खान आंशिक रूप से अनुदान KL2 TR001416 के माध्यम से राष्ट्रीय अनुसंधान संसाधन के लिए राष्ट्रीय केंद्र और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, स्वास्थ्य के लिए राष्ट्रीय केंद्र द्वारा समर्थित है। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी NIH के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है.
16-pad nitrocellulose-coated glass slides | Grace Bio Labs | 305016 | |
1x GVS FAST blocking buffer | Fischer Scientific | 10485356 | |
ArrayCam portable imager | Grace Bio Labs | 400S | Other imaging devices can be used to visualize slides if capable of achieving the resolution of the microarray spots and the excitation and emission wavelengths of the quantum dots. |
Biotin-conjugated goat anti-mouse-IgG antibody | Thermo Fischer | 31800 | |
HiBase 384-well plate | Greiner Bio-One | T-3037-11 | |
Microarray pins | ArrayIt | GMP2 | Each different microarray printer may require its own custom microarray pins. |
Mouse monoclonal poly-His antibody | Sigma-Aldrich | H1029 | |
OmniGrid 100 microarray printer | GeneMachines | The version of the microarray printer used in this work is no longer commercially available, but the updated similar equipment is the OmniGrid Accent microarray printer from Digilab (Hopkinton, MA), and the same protocol can be carried out with most commercially available microarray printers. | |
ProPlate slide chambers | Grace Bio Labs | 246890 | |
ProPlate slide clips | Grace Bio Labs | 204838 | |
ProPlate slide frames | Grace Bio Labs | 246879 | |
Quantum dot 585 nm conjugated goat anti-human-IgA antibody | Grace Bio Labs | 110620 | |
Quantum dot 585 nm streptavidin conjugate | Thermo Fischer | Q10111MP | |
Quantum dot 800 nm conjugated goat anti-human-IgG antibody | Grace Bio Labs | 110610 |