نهجنا التجريبي يوفر استراتيجية لمتابعه وفره البلازميد ومقاومه المضادات الحيوية مع مرور الوقت في السكان البكتيرية.
البلازميدات تلعب دورا رئيسيا في الإيكولوجيا الميكروبية والتطور كمركبات نقل الجينات الجانبية وخزانات وظائف الجينات التبعي في السكان الميكروبية. هذا هو الحال بشكل خاص في ظل بيئات سريعة التغير مثل تقلب التعرض للمضادات الحيوية. وقد أظهرنا مؤخرا ان البلازميدات الحفاظ علي جينات مقاومه المضادات الحيوية في القولونية ايشيرشيا دون اختيار إيجابي للوجود البلازميد. هنا نحن وصف النظام التجريبي الذي يسمح بعد كل من النمط الجيني البلازميد والنمط الظاهري في تجارب التطور علي المدى الطويل. نحن نستخدم التقنيات الجزيئية لتصميم البلازميد نموذج التي يتم إدخالها لاحقا إلى نهج نظام دفعه التطور التجريبية في المضيف e. كولاي . نحن نتبع التردد البلازميد مع مرور الوقت عن طريق تطبيق النسخ المتماثلة من السكان e. القولونية في حين تحديد الكمية المقاومة للمضادات الحيوية الثبات. الاضافه إلى ذلك ، فاننا نراقب التشكيل من البلازميدات في الخلايا المضيفة عن طريق تحليل مدي تشكيل المولد البلازما بواسطة الوخز بالبلازما والكهربائية هلام اجنشا. مثل هذا النهج يسمح لنا لتصور ليس فقط حجم الجينوم من البلازميدات المتطورة ولكن أيضا التشكيل الخاص بهم السطحية-عامل مهم للغاية لوراثة البلازميد. يجمع نظامنا بين الاستراتيجيات الجزيئية والطرق المجهرية التقليدية ويوفر اعدادا لمتابعه البلازميدات في البكتيريا السكانية لفتره طويلة. ويمكن تطبيق النهج المقدم لدراسة مجموعه واسعه من العناصر الجينية المتنقلة في المستقبل.
البلازميدات هي العناصر الجينية الدائرية والمكررة ذاتيا والمنتشرة في كل مكان في النواة. فهي عوامل نقل الجينات الجانبية ، لأنها يمكن ان تنقل الصفات بين السكان الميكروبية ، التالي تعتبر ان تلعب دورا رئيسيا في التطور الميكروبي. البلازميدات هي المحركات للتكيف السريع مع الظروف التي تحد من النمو علي مدي فتره قصيرة (علي سبيل المثال ، في وجود المضادات الحيوية أو المبيدات1) وهي مسؤوله عن الانتقال علي المدى الطويل إلى أنماط نمط الحياة الأخرى (علي سبيل المثال ، ظهور الامراضيه2). والامثله الأكثر لفتا لتاثير البلازميدات علي نقل الجينات موثقه في النظم الايكولوجيه المعرضة لتقلب مستويات المضادات الحيوية ، مثل العيادات الطبية أو في المزارع الصناعية3. بسبب الاختيار الإيجابي القوي ، البلازميدات ترميز العديد من الجينات لمقاومه مضادات الميكروبات وغالبا ما يتم العثور عليها لتمنح المقاومة المتعددة للمضيف البكتيري. البلازميدات تمكين الهجرة بين السكان أو الأنواع البكتيرية ، مما ادي إلى انتشار سريع لمقاومه مضادات الميكروبات المتعددة. في ظل ظروف غير انتقائية البلازميدات ليست ضرورية للخلية وغالبا ما يشار اليها باسم العناصر الطفيلية. ومع ذلك ، البلازميدات في كل مكان في الطبيعة وتطورها متشابكة للغاية مع الكروموسومات البكتيرية. يظل الثبات في البيئات الطبيعية (المتقلبة وغير الانتقائية) غير مفهوم بشكل سيئ ، ومع ذلك فانه ذو اهميه عاليه لفهمنا لاستمرار جينات مقاومه المضادات الحيوية في الطبيعة.
التطور التجريبي هو أداه قويه لدراسة السكان الميكروبية4. وأظهرت التطورات التجريبية ان فرض اختيار قوي للصيانة البلازميد يؤدي إلى التعويضية (اي التكيف) تطور الكروموسوم البلازميد أو المضيف الذي يقلل من تكلفه البلازميد اللياقة البدنية ، التالي ، يسهل البلازميد وفره (اي ، الثبات البلازميد)5،6،7. التالي ، فانه بعد التفاعل بين المضيفين بمرور الوقت قد يكشف عن أليات هامه لتكييف كلا العنصرين. وعلاوة علي ذلك ، فان التطور التجريبي يمكن المرء من قياس وفره الخلايا الحاملة بالبلازما بمرور الوقت في ظل ظروفمختلفه 8 و9و10.
ويمكن رصد ثبات plasmid في تجارب التطور من قبل العديد من الاستراتيجيات بما في ذلك تدفق الخلوية عن طريق الفرز الخلية المنشطة الفلورسنت (FACS)11، pcr الكمية (qpcr)11، أو في الأساليب القائمة علي الزراعة. يتطلب قياس التدفق الخلوي اله FACS وإدخال جين علامة (فلوري) قابل للكشف ، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ، علي plasmid. ومع ذلك ، قد يغير التعبير gfp العديد من الخصائص الخلوية ، وعلاوة علي ذلك تؤثر علي موقع البلازميد في الخلية12، والتي بدورها قد تؤثر علي الوراثة البلازميد اثناء انقسام الخلية. نهج qpcr لقياس وفره البلازميد قد تكون متحيزة للغاية من قبل رقم النسخة البلازميد ، والتي يمكن ان تختلف إلى حد كبير علي طول مرحله نمو البكتيريا وعلي مر الزمن13. وأخيرا ، فان النهج القائم علي الثقافة والطلاء يتطلب إدخال جينات العلامات القابلة للتحديد. قد يكون هذا الجين مقاومه المضادات الحيوية ، والتي غالبا ما تكون مشفره علي البلازميدات الطبيعية. التالي ، لا ضرورة للتلاعب الوراثي. مقاومه المضادات الحيوية يمكن ان يتبعها أسلوب الطلاء التقليدية المقلدة. وهكذا ، لدراسة ديناميات البلازميد الطبيعية ، والطلاء المقلدة هي مناسبه تماما لرصد البلازميد المشفرة المضادات الحيوية المقاومة14.
لتصور جزيئات البلازميد (علي سبيل المثال ، لتقييم حجم البلازميد) قد يتم تطبيق عده طرق. يمكن تضخيم البلازميدات الكامل باستخدام نهج المستندة إلى PCR. ومع ذلك ، وهذا يتطلب تصميم الإشعال محدده ، والتي قد تكون صعبه خلال تجربه التطور ، لان تسلسل البلازميد قد تتغير مع مرور الوقت. الاضافه إلى ذلك ، فانه من الصعب تضخيم المولدات البلازميد في نهج المستندة إلى pcr بسبب مواقع ملزمه متعددة لإشعال pcr. يمكن ان تظهر جزيئات بلازميد مولتيميريك بعد إنهاء النسخ المتماثل البلازميد أو من خلال أعاده تركيب جزيئات البلازميد وموجهه في الغالب من الراس إلى الذيل15. نهج آخر من التصور البلازميد يجمع بين الهضم الانزيمي من جزيئات البلازميد بواسطة الحمض النووي الوحيد النواة التي اما يلتصق أو نك حبلا الحمض النووي البلازميد مع التحليل الكهربائي هلام الاغاروز. نفس البلازميد من احجام مختلفه (علي سبيل المثال ، مونومرات مقابل المولدات) النتائج في التنقلات هلام مختلفه التي يمكن ملاحظتها عند تصور جزيئات البلازميد. هذا النهج يتيح التصور والتقدير الكمي لمختلف التشكيلات البلازميد (اي الدول المولدة). ويمكن استخدام التشكيل البلازميد كمؤشر علي الاستقرار البلازميد ، وغالبا ما تضيع المولدات البلازميد اثناء انقسام الخلية16.
في العمل الأخير ، تابعنا ثبات البلازميد في الظروف التي لم تكن انتقائية لوفره البلازميد (اي بدون اختيار المضادات الحيوية). قارننا ثبات البلازميد في درجات حرارة مختلفه (20 درجه مئوية و 37 درجه مئوية) وثلاثه احجام السكان (اي معدلات التخفيف). تطبيق معدلات التخفيف المختلفة ، أو اختناقات السكان ، ويسمح للتحقيق في تاثير حجم السكان علي البكتيريا وتطور البلازميد. بناء علي نتائجنا ، نقترح ان البلازميدات يمكن ان تكون محايده للمضيف البكتيرية وقد تتطور الاستقرار دون اي ضغط الاختيار8. يتم منح الاستقرار البلازميد المتطورة من خلال الحد من تشكيل مولميد البلازما8.
هنا ، نقدم بروتوكولا للقياس الكمي لثبات البلازميد والتحقيق في تطور البلازميد فيما يتعلق بالحفاظ علي جينات مقاومه المضادات الحيوية. الأسلوب لديه عده خطوات ، بما في ذلك إدخال جين مقاومه المضادات الحيوية إلى البلازميد نموذج (والتي يمكن حذفها عند استخدام البلازميد المقاومة الطبيعية) ، تليها استخدام التطور التجريبي لتقييم إمكانات البلازميد للاستمرار في ظل ظروف غير انتقائية في حين تحديد ديناميات التردد البلازميد مع مرور الوقت باستخدام الطلاء المقلدة ، وتحليل الجينوم البلازميد من خلال التصور. تم تصميم البروتوكول الموصوف هنا للتحقيق في تطور واستمرار البلازميدات ، ولكن يمكن تطبيقه أيضا لمتابعه تطور جينات مقاومه الكروموسومات (أو جينات العلامات الأخرى) مع مرور الوقت.
في هذا البروتوكول ، ونحن نقدم نهج يجمع بين التقنيات في البيولوجيا الجزيئية ، والتطور التجريبي ، والتصور الحمض النووي للتحقيق في دور التطور البلازميد لاستمرار مقاومه المضادات الحيوية في البكتيريا. علي الرغم من ان النهج المعروض يجمع بين الأساليب من مجالات البحث المختلفة ، فان جميع التقنيات التطبيقية واضحة ويمكن تنفيذها في مختبر الميكروبيولوجيا القياسي.
وتشمل الخطوات الأكثر اهميه في البروتوكول بناء سلاله النظام النموذجي التي تشمل التحقق الوراثي من النمط الجيني الحامل بالبلازما. ولا سيما ، العديد من البلازميدات ترميز بشكل طبيعي جينات مقاومه المضادات الحيوية. التالي ، قد يغفل القارئ الخطوة 1 من البروتوكول والمضي قدما مباشره مع الخطوة 2. وبعد ذلك ، ينبغي ان تشمل تجارب التطور تصميما عشوائيا لتكرار السكان بحيث لا تكون النتائج متحيزة بموقف السكان المتماثلين في الصفيحة العميقة. الاضافه إلى ذلك ، من المهم بشكل خاص اجراء النقل التسلسلي وخطوات التخفيف في تجربه التطور بعناية لان التلوث سيؤدي إلى تزوير النتائج. وأخيرا ، يجب ان تجري الطلاء المقلدة بعناية كبيره. حجم مستعمره كبيره قد يكون مشكله ، ولكن يمكن تجنبها عن طريق احتضان لوحات لمده اقل من 24 ساعة. المثل ، فان عدد المستعمرات علي لوحه واحده قد التحيز نتائج الطلاء النسخة المتماثلة. ولذلك ، يجب تخفيف السكان قبل الطلاء والنسخ المتماثل.
واحده من أكبر مزايا نهجنا هو انه يمكن استنساخها بسهوله دون الحاجة إلى المعدات الثقيلة. الاضافه إلى ذلك ، ميزه أخرى من الطلاء النسخة المتماثلة لاتباع علامة الجينات هو ان يتم تقييم الخلايا الحية فقط ، علي النقيض من التدفق الخلوي أو qPCR في الخلايا الميتة التي يمكن تقييمها علي قيد الحياة. التالي ، الطلاء النسخة المتماثلة يقدم التحيز اقل للعد من الخلايا الحاملة plasmid. ومع ذلك ، قد يكون أحد القيود علي الطلاء النسخة المتماثلة حجم السكان (اي رقم الخلية) التي من الممكن تقييم في تشغيل تجريبي واحد.
باستخدام نهجنا ، لقد أظهرنا مؤخرا ان تطور الاستقرار البلازميد يقوي استمرار جينات مقاومه المضادات الحيوية في البكتيريا. وهكذا ، قمنا بتطوير نهج كاداه لمتابعه المقاومة بوساطة البلازما التي هي ذات اهميه كبيره لمتابعه المقاومة مع مرور الوقت وخاصه في ظل ظروف دون وجود المضادات الحيوية.
The authors have nothing to disclose.
نشكر غور مارغاريان علي الدعم الإبداعي والمساعدة الفنية. تم دعم هذا العمل من قبل ZMB عالم الشباب منحه 2017/2018 (منحت لTW) وبرنامج التركيز DFG 1819 (منح رقم. DA1202/2-1 الممنوحة إلى TD).
96-deep-well plates | Starlab | ||
96-deep-well plates | Roth | EN07.1 | 2 ml, square |
96-deep-well plates (cryo) | Starlab | E1702-8400 | Micro-Dilution Tube System |
Colony counter | Stuart | SC6+ | |
Cotton velvet | drapery shop | 100 % cotton required | |
Electrophoresis chamber | BioRad | Agarose gel electrophoresis | |
Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
Electroporation cuvettes | BioRad | 1652089 | 0.1 cm |
Electroporator | BioRad | 1652660 | |
GeneJet Gel Extraction kit | Thermo Fisher Scientific | K0832 | PCR fragment clean-up |
GeneJet Plasmid Miniprep kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Plasmid extraction kit |
Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50125852 | |
Incubator (plate shaker) | Heidolph | 1000 | |
Incubator (shaker) | New Brunswick Scientific | Innova 44 | |
Inoculating loops | Sigma-Aldrich | ||
Multi-channel pippetes | Eppendorf | 3125000052, 3125000028 | |
Multi-channel pippetes | Capp | ME8-1250R | |
NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND2000 | |
Oligonucleotides | Eurofines | ||
Petri dishes | Sigma-Aldrich | ||
Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
Pipettes | Eppendorf | 3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063, | |
PlasmidSafe enzyme | Epicentre | 10059400 | |
Reaction tubes | Eppendorf | 30125150 | |
Replica block & metal ring | VWR | 601-3401 | PVC cylinder 69 mm; ring 102cm |
Resctriction enzymes | New England Biolabs | ||
Thermocycler | BioRad | T100 |