Summary
Onze experimentele aanpak biedt een strategie om plasmide overvloed en antibioticaresistentie na verloop van tijd te volgen in bacteriële populaties.
Abstract
Plasmiden spelen een belangrijke rol in microbiële ecologie en evolutie als voertuigen van laterale genoverdracht en reservoirs van accessoire-genfuncties in microbiële populaties. Dit is met name het geval bij snel veranderende omgevingen zoals fluctuerende antibiotica blootstelling. We hebben onlangs laten zien dat plasmiden de genen van antibioticaresistentie in Escherichia coli behouden zonder positieve selectie voor de plasmide aanwezigheid. Hier beschrijven we een experimenteel systeem dat het mogelijk maakt om zowel het plasmide genotype als het fenotype te volgen in lange termijn evolutie experimenten. We gebruiken moleculaire technieken om een model plasmide te ontwerpen die vervolgens wordt geïntroduceerd in een experimentele evolution batch-systeem benadering in een E. coli -host. We volgen de plasmide frequentie na verloop van tijd door het toepassen van replica plating van de E. coli populaties tijdens het kwantificeren van de antibioticaresistentie persistentie. Daarnaast monitoren we de conformatie van plasmiden in gastheer cellen door het analyseren van de omvang van plasmide multimer vorming door plasmide picknicken en agarose gel elektroforese. Een dergelijke aanpak stelt ons in staat om niet alleen de genoom grootte van veranderende plasmiden te visualiseren, maar ook hun topologische conformatie-een factor die zeer belangrijk is voor plasmide overname. Ons systeem combineert moleculaire strategieën met traditionele microbiologie benaderingen en biedt een set-up om plasmiden in bacteriële populaties gedurende een lange tijd te volgen. De gepresenteerde aanpak kan worden toegepast om in de toekomst een breed scala aan mobiele genetische elementen te bestuderen.
Introduction
Plasmiden zijn circulaire, zelfreplicerende genetische elementen die alomtegenwoordig zijn in prokaryoten. Ze zijn agenten van laterale genoverdracht, omdat ze eigenschappen kunnen overdragen tussen microbiële populaties, en dus worden beschouwd als een belangrijke rol in de microbiële evolutie. Plasmiden zijn bestuurders van snelle aanpassing aan groeibeperkende voorwaarden gedurende korte tijd (bijvoorbeeld in aanwezigheid van antibiotica of pesticiden1) en zijn verantwoordelijk voor de lange termijn overgang naar andere lifestyle-modi (bijv. het ontstaan van pathogeniteit2). De meest opvallende voorbeelden voor de impact van plasmiden op overdracht van genen worden gedocumenteerd in ecosystemen die blootgesteld zijn aan fluctuerende niveaus van antibiotica, zoals medische klinieken of in industriële boerderijen3. Als gevolg van sterke positieve selectie, veel plasmiden coderen voor antimicrobiële resistentiegenen en worden vaak gevonden om te verlenen van multiresistance aan hun bacteriële gastheer. Plasmiden maken migratie mogelijk tussen populaties of bacteriesoorten, wat resulteert in een snelle vermeerdering van meervoudige antimicrobiële resistentie. Onder niet-selectieve omstandigheden zijn plasmiden niet essentieel voor de cel en worden ze vaak zelfs parasitaire elementen genoemd. Niettemin, plasmiden zijn alomtegenwoordig in de natuur en hun evolutie is zeer verweven met die van bacteriële chromosomen. Plasmide persistentie in natuurlijke omgevingen (fluctuerend en niet-selectief) blijft slecht begrepen, maar het is van groot belang voor ons begrip van de persistentie van antibioticaresistentiegenen in de natuur.
Experimentele evolutie is een krachtig hulpmiddel voor de studie van microbiële populaties4. Experimentele evolutie toonde aan dat het opleggen van een sterke selectie voor plasmide onderhoud leidt tot compenserende (d.w.z. adaptieve) evolutie van het plasmide of gastheer-chromosoom die de kosten van plasmide fitness vermindert en, op zijn beurt, plasmide overvloed vergemakkelijkt (d.w.z. plasmide persistentie)5,6,7. Dus, na de plasmide-host interactie na verloop van tijd kan belangrijke mechanismen van de aanpassing van beide elementen te onthullen. Bovendien, experimentele evolutie maakt het mogelijk om te kwantificeren de overvloed van plasmide dragende cellen in de tijd onder verschillende omstandigheden8,9,10.
Plasmide persistentie in evolutie experimenten kan worden bewaakt door verschillende strategieën, waaronder Flowcytometrie door fluorescerende geactiveerde celsortering (FACS)11, kwantitatieve PCR (qPCR)11, of in teelt-gebaseerde methoden. Flow cytometrie vereist een FACS machine en de introductie van een detecteerbaar (fluorescerende) marker gen, zoals het groene fluorescerende eiwit (GFP), op het plasmide. Echter, GFP expressie kan verschillende cellulaire eigenschappen veranderen en verder beïnvloeden de plasmide locatie in de cel12, die op zijn beurt kan invloed hebben op plasmide erfenis tijdens celdeling. Een qPCR-benadering voor het meten van plasmide overvloed kan zeer bevooroordeeld zijn door het plasmide kopie nummer, die sterk kan variëren langs bacteriële groeifase en na verloop van tijd13. Tot slot vereist een benadering op basis van cultuur en plating de introductie van een selecteerbaar marker gen. Dit kan een antibiotica-resistentie-gen zijn, dat vaak wordt gecodeerd op natuurlijke plasmiden; Er is dus geen genetische manipulatie nodig. Antibioticaresistentie kan worden gevolgd door een traditionele replica plating aanpak. Dus, om te studeren natuurlijke plasmide dynamiek, replica plating is zeer geschikt voor het bewaken van plasmide gecodeerde antibiotica resisitance14.
Om plasmide moleculen te visualiseren (bijv. om de plasmide grootte te evalueren) kunnen verschillende methoden worden toegepast. Hele plasmiden kunnen worden versterkt met behulp van een PCR-gebaseerde benadering. Dit vereist echter het ontwerp van specifieke primers, die een uitdaging kunnen zijn tijdens een evolutie-experiment, omdat de plasmide sequentie na verloop van tijd kan veranderen. Bovendien is het moeilijk om plasmide multimers te versterken in een PCR-gebaseerde benadering door meerdere bindingsplaatsen voor de PCR-primers. Multimere plasmide moleculen kunnen verschijnen na plasmide replicatie beëindiging of door recombinatie van plasmide moleculen en zijn meestal georiënteerd kop-tot-staart15. Een andere benadering van plasmide visualisatie combineert enzymatische vertering van plasmide moleculen door DNA-enzym die ofwel klieven of Nick een plasmide DNA-streng met agarose gel elektroforese analyse. Hetzelfde plasmide van verschillende groottes (bijv. monomeren versus multimers) resulteert in verschillende gelmobiliteiten die kunnen worden waargenomen bij het visualiseren van de plasmide moleculen. Deze aanpak maakt visualisatie en kwantificering van verschillende plasmide conformaties (d.w.z. multimerization toestanden) mogelijk. De plasmide conformatie kan worden gebruikt als indicator van plasmide stabiliteit, omdat plasmide multimers vaak verloren gaan tijdens Cell Division16.
In een recent werk volgden we plasmide persistentie in omstandigheden die niet selectief waren voor plasmide overvloed (d.w.z. zonder antibiotica selectie). We vergeleek plasmide persistentie bij twee verschillende temperaturen (20 °C en 37 °C) en drie bevolkings grootten (d.w.z. verdunnings percentages). Door verschillende verdunnings percentages of bevolkings knelpunten toe te passen kan het onderzoek naar de invloed van de bevolkingsomvang op de bacteriële en plasmide evolutie worden onderzocht. Op basis van onze resultaten stellen we voor dat plasmiden neutraal kunnen zijn voor hun bacteriële gastheer en de stabiliteit kunnen evolueren zonder enige selectiedruk8. De geëvolueerde plasmide stabiliteit wordt verleend door de reductie van de plasmide multimer formatie8.
Hier presenteren we een protocol voor de kwantificering van plasmide persistentie en onderzoek naar plasmide evolutie met betrekking tot het behoud van antibioticaresistentiegenen. De methode heeft verschillende stappen, met inbegrip van het inbrengen van een antibioticumresistentie gen aan een model plasmide (die kan worden weggelaten bij gebruik van een natuurlijke resistentie plasmide), gevolgd door het gebruik van experimentele evolutie om te beoordelen van het potentieel van het plasmide te behouden onder niet-selectieve omstandigheden tijdens het bepalen van de plasmide frequentie dynamiek in de tijd met behulp van replica plating, en de analyse van het plasmide genoom door visualisatie. Het hier beschreven protocol is ontworpen om de evolutie en persistentie van plasmiden te onderzoeken, maar het kan ook worden toegepast om de evolutie van de chromosoom resistentiegenen (of andere marker genen) na verloop van tijd te volgen.
Protocol
1. bouw van een model plasmide met een antibioticaresistentie gen
Opmerking: de stam Escherichia coli K-12 MG1655 werd gebruikt als modelorganisme in alle experimenten (DSM No. 18039, Duitse verzameling van micro-organismen en celculturen, DSMZ). De stam E. coli DH5α17 werd gebruikt tijdens de plasmide constructie.
- PCR versterkt de plasmide ruggengraat van uw keuze en versterkt het resistentie-gen, inclusief de Promoter regio, met PCR (Figuur 1).
- PCR versterkt de plasmide ruggengraat met behulp van een high-fidelity polymerase en de oligonucleotiden pBBR1_for (5 '-GCGGCCACCGGCTGGCT-3 ') en pBBR1_rev (5 '-TACCGGCGCGGCAGCGTGACCC-3 ') op de plasmide template pLC (GenBank acc. nr. MH238456)18.
- PCR versterkt het resistentie-gen Nptii , inclusief de native Tn5 Promoter19 met behulp van een high-fidelity polymerase en oligonucleotiden NPTII_GIB_FOR (5 '-GCGCCGGTAGATCTGCTCATGTTTGAAGCTTCACGCTGCCGCA-3 ') en NPTII_GIB_REV (5 '-CGGTGGCCGCCAAAAAGGCCATCCGTCAGGTCAGAAGAACTCGT-3 '). Het nptii -gen codeert voor een neomycine fosfotransferaseactiviteit en verleent resistentie aan kanamycine.
Opmerking: ontwerp de primers voor het Verzets gen met ongeveer 20 BP van complementaire sequentie tot de plasmide ruggengraat waarmee het wordt samengesmolten.
- Reinig beide PCR-fragmenten met een Kit naar keuze.
- Sluit u aan bij het gezuiverde antibioticaresistentie Gene PCR-product (inclusief de Promoter regio) op de gezuiverde plasmide backbone en smelt de homologe regio's met isothermische assemblage20, bij 50 °c gedurende 60 min.
- Elektroporate het gesmolten product in de stam E. coli DH5α.
- Introduceer 2 μL van het product van stap 1,3 in 40 μL elektrocompetente cellen in 2 mm cuvettes bij 4 °C en 2,5 kV. Respendeer cellen in 1 ml lysogeny Bouillon (lb) medium.
- Breng het totale volume over naar een microfugebuis buis en inincuberen 1 uur bij 37 °C schudden bij 250 rpm in een rondschudapparaat om de uitdrukking van de weerstands marker op het plasmide te kunnen geven.
- Plaat 100 μL van de cellen op LB agar platen met het geschikte antibioticum (kanamycine 25 μg/mL) om te selecteren voor het antibioticaresistentie-gen en zo te kiezen voor plasmide dragende cellen. Draai de rest, verwijder de supernatant, regeer de cellen in 100 μL LB en plaat op een selectieve agar plaat. Inincuberen de platen bij 37 °C gedurende 24 uur.
- Om klonen te verifiëren, haalt u de geconstrueerde plasmiden op via alkalische lysis met behulp van een commerciële mini-prep Kit.
- Oogst 5 mL van de stationaire nachtelijke kweek door centrifugeren op 12.000 x g bij kamertemperatuur. Hervat de cellen in resuspensie oplossing, dan lyse en Neutraliseer de celoplossing. Centrifugeer 5 min bij 12.000 x g.
- Breng het supernatant over in de in de kit meegeleverde DNA-bindings kolom en was de kolom tweemaal met 500 μL wasoplossing centrifugeren 2x voordat het kolom membraan met elutie buffer wordt geelativeerd.
- Voer Sanger-sequencing van het plasmide uit om te bevestigen dat de sequentie correct is.
- Zodra de plasmide geldigheid is geverifieerd, elektroporate de plasmide (nu pCON) in de stam E. coli MG1655 zoals hierboven beschreven. Dit levert stam E. coli MG1655 pCon.
2. monitoring van plasmide dragende bacteriën onder verschillende omstandigheden in de tijd
Opmerking: het evolutie experiment wordt uitgevoerd met plasmide dragende stammen onder niet-selectieve omstandigheden (LB-media) in twee temperaturen (37 °C en 20 °C) en drie populatie knelpunt grootten. Het experimentele ontwerp wordt gebruikt om plasmide persistentie onder verschillende omstandigheden te bestuderen.
- Ontwerp van een evolutie experiment te volgen plasmide frequentie na verloop van tijd (Figuur 2)
- Plaat de geconstrueerde plasmide-dragende stam (E. coli MG1655 pCon) op lb agar platen aangevuld met antibiotica (kanamycine 25 μg/ml) en incuberen 's nachts bij 37 °c.
- Bereid 96 diep-goed platen met 1 mL LB medium in elke put. Als de bacteriële voor ouders, kies acht willekeurige geïsoleerde kolonies van de agar plaat in onafhankelijke putten. Inbroed de platen bij 37 °C en 450 RPM op een plaat Shaker voor 24 uur. bereid een bevroren glycerol kolf van de voorouderlijke klonen.
- De volgende dag brengen de acht replicaatpopulaties over naar nieuwe diepliggende platen volgens het experimentele ontwerp (Figuur 2). De culturen worden verdund 1:100 (grote knelpunt, L), 1:1000 (medium knelpunt, M), of 1:10000 (kleine knelpunt, S) in een totaal volume van 1 mL LB met PBS voor verdunning. De verdunde culturen worden beide geïnfiltreerd bij 37 °C en 20 °C.
Opmerking: het is zeer belangrijk om te controleren op kruisbesmetting in de 96-Deep-well plate. Gebruik dus een dambord plaat ontwerp door het intercaleren van geënt putten met bacterievrij LB medium. Gebruik dit patroon door het hele evolution-experiment. - De op 37 °C geïnde culturen worden elke 12 uur overgebracht, terwijl de culturen bij 20 °C elke 24 uur worden overgebracht.
Opmerking: tijdens elke overdrachts gebeurtenis wordt de knelpunt grootte behandeling toegepast en wordt de seriële overdracht herhaald over een totaal van 98 overdrachten. Het aantal overdrachten is afhankelijk van het experimentele ontwerp van de lezers. - Bereid een bevroren glycerol kolf van alle populaties regelmatig, 2x per week.
- Monitoring van de plasmide frequentie door replica plating (Figuur 3)
Opmerking: tijdens het Evolution-experiment wordt de frequentie van plasmide dragende cellen in de populatie geschat op basis van het aantal hosts. Het protocol voor het plateren van replica's wordt weergegeven in afbeelding 3.- Om de plasmide frequentie in de populatie tijdens het Evolution-experiment te bepalen, worden stationaire culturen op een seriële wijze verdund en verguld op niet-selectieve LB agar-platen. Pas de verdunning aan volgens een opbrengst van 250-500 kolonies per plaat.
Opmerking: bereid dikke LB agar-platen vóór de beplating (~ 30 mL agar). - De geplateerde populaties worden geïnineerd voor een nachtelijke groei op basis van hun groei temperatuur in het experiment.
Let op: de kolonies moeten klein zijn, dus inbroed < 24 uur bij 37 °C. - Na de nachtelijke groei, tellen alle kolonies met behulp van een handmatige of geautomatiseerde kolonie Count station en bereken de totale bacterie populatiegrootte in de culturen.
Opmerking: kolonies aan de rand van de agar-plaat mogen niet in het totale aantal bacteriële cellen worden opgenomen. - Steriliseren vierkante stukken (~ 20 x 20 cm) van katoen fluweel door autoclaven.
Opmerking: de fluwelen doek moet 100% katoen zijn om autoclaveerbaar te zijn. Het is belangrijk om het doek na sterilisatie te drogen. - Na sterilisatie van de fluwelen doek, plaats het doek op een ronde blok en bevestig het met een metalen ring. Het is cruciaal om rimpels te voorkomen. Plaats de plaat voorzichtig met de gekweekte kolonies (agar naar beneden gericht) op het vaste fluwelen doek oppervlak. Zorg ervoor dat alle kolonies het fluwelen oppervlak aanraken door de Petri schaal op een ronde manier zorgvuldig te tikken.
- Verwijder voorzichtig de LB agar plaat en plaats een selectief bord aangevuld met antibiotica (kanamycine 25 μg/mL) op de fluwelen doek. Zorg ervoor dat de plaat alle fluweel aanraakt door voorzichtig op de Petri schaal te tikken zoals eerder beschreven. Verwijder daarna de plaat. Laat de platen bij kamertemperatuur staan voor een nachtelijke groei.
- De volgende dag, evalueer zowel de LB agar plaat en de selectieve plaat. Kolonies die groeien op de selectieve media worden geteld als plasmide hosts (dat wil zeggen, antibiotica resistent), terwijl kolonie-vrije vlekken zijn kolonies die plasmide vrij waren en zijn dus niet resistent tegen het antibioticum (dat wil zeggen, verloor het plasmide). Dit wordt gedaan door de platen over elkaar te plaatsen en de groei te vergelijken (d.w.z. alle ontbrekende kolonies markeren) en het kolonie nummer op beide platen te tellen. Dit levert het aantal cellen op dat tijdens het Evolution-experiment het plasmide verloor.
- Herhaal deze procedure op regelmatige wijze over het hele evolutie-experiment (bijv. elke 14 overdrachten).
- Om de plasmide frequentie in de populatie tijdens het Evolution-experiment te bepalen, worden stationaire culturen op een seriële wijze verdund en verguld op niet-selectieve LB agar-platen. Pas de verdunning aan volgens een opbrengst van 250-500 kolonies per plaat.
3. visualisatie van plasmide multimers met behulp van gel elektroforese
Opmerking: plasmide extractie van laag-Copy plasmiden leidt vaak tot besmetting met hostchromosomaal DNA dat voorafgaand aan visualisatie enzymatisch moet worden verteerd.
- Extract plasmide DNA uit een stationaire celkweek van 5 mL met alkalische lysis zoals beschreven in stap 1,5.
- Behandel daarna het geëxtraheerde plasmide DNA met een ATP-afhankelijke DNase die alleen chromosomen DNA snijdt om chromosomale DNA-besmetting te verwijderen (Zie tabel met materialen). Inincuberen bij 37 °C gedurende 30 min. Reinig daarna het DNA met een Kit naar keuze.
- Om open cirkel moleculen van alle plasmide conformaties (monomeren of multimers) te maken, inbroed de plasmide DNA monsters met een picknicken enzym (nb. bsrdi) en inbroed gedurende 30 minuten bij 65 °c.
- Parallel, om lineaire plasmide moleculen (d.w.z. voor plasmide grootte vergelijking) te maken, gebruikt u een restrictie-enzym van uw keuze (bijv. hindiii) dat het plasmide één keer Slaid.
Opmerking: Dit resulteert in lineaire DNA-plasmide monomeren. Open cirkel moleculen migreren niet op een lineaire manier. - Om de grootte en de conformatie van de plasmide te visualiseren, elektroforese de verkreukeld en lineaire plasmide DNA monsters voor 120 min bij 4,3 V/cm in een 1% (w/V) agarose gel en 1 × TAE buffer. De monsters zijn gekleurd met Midori Green en de gel wordt gevisualiseerd op een gelbeeldvormings systeem (Zie tabel met materialen). Gebruik een 1 KBP ladder.
Representative Results
Hier presenteren we een benadering voor het bestuderen van plasmide evolutie door plasmide persistentie in een populatie te kwantificeren. Ten eerste laten we zien hoe het bouwen van de plasmide dragen E. coli stam MG1655 pCon die vervolgens wordt geïntroduceerd om een evolutie experiment. Ten tweede presenteren we een eenvoudige methode om de overvloed aan plasmide te volgen in de zich ontwikkelende bacteriële populaties. Ten slotte laten we zien hoe plasmide molecuul grootte en conformatie te visualiseren.
In ons vorige werk8 met behulp van de gepresenteerde aanpak voerden we een evolutie experiment na de persistentie van antibioticaresistentie plasmiden in E. coli bij afwezigheid van antibiotica (Figuur 4). Onze representatieve resultaten tonen de evolutie van populaties bij 37 °C en een verdunnings percentage van 10-4. Na de overvloed aan plasmide dragende cellen, observeerden we in de loop van de tijd een afname van de frequentie plasmide ontvangende cellen (Figuur 4). Onze aanpak stelde ons in staat om te ontdekken dat het plasmide verlies het gevolg was van de gecondenseerde plasmide genoom architectuur, die leidde tot plasmide instabiliteit veroorzaakt door conflicten geïntroduceerd door transcriptie van het Verzets gen en replicatie van het plasmide zelf. Door het visualiseren van de plasmide moleculen konden we ontdekken dat deze conflicten leidden tot een instabiele plasmide conformatie (d.w.z. plasmide multimer formatie, Figuur 5). Niettemin, we waargenomen plasmide stabiliteits evolutie zonder de blootstelling aan antibiotica (Figuur 4). De geëvolueerde stabiliteit werd verleend door een plasmide intrinsieke duplicatie die de transcriptie-replicatieconflicten afgeschaft en leidde tot de vorming van stabiel geërfd plasmiden. Onze resultaten tonen dus het belang van recombinatie en genoom versterking in adaptieve evolutie van genetische elementen.
Figuur 1: plasmide ontwerp van pCON. Schematische weergave van de kloon strategie die wordt gebruikt om het plasmide pCON te bouwen. De plasmide backbone (pBBR1) en het antibioticumresistentie-gen (nptii) zijn PCR-versterkt en gefuseerd door isotherme Fusion20. Dit levert de plasmide pCON en de stam MG1655 pCON. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: ontwerp van het lange termijn evolutie experiment. Schematische weergave van de seriële overdracht experiment. De plasmide-dragende (pCON) populaties worden geplateerd op selectieve media. Voorouderlijke kolonies worden willekeurig uit de plaat gekozen en geïntroduceerd in een seriële transfersysteem. De overdrachten worden uitgevoerd met drie verschillende verdunnings benaderingen om bevolkings bottlenecks van verschillende groottes te simuleren. De verdunningen worden sereen herhaald. Het experiment wordt uitgevoerd in twee temperatuur regimes. De plasmide-host frequentie wordt gemeten langs het experiment via replica plating. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: replica plating. Schematische weergave van de stappen die worden gebruikt in replica plating van bacteriële populaties. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: representatieve pCON-frequentie in de loop van de tijd. pCON persistentie wordt weergegeven als het aantal hosts (representatieve replicaten) tijdens het Evolution-experiment. Voor 98 overdrachten evolueerden pCON plasmide populaties onder niet-selectieve omstandigheden met een verdunningsfactor van 10-4. Alle replicaten die de plasmide pCON dragen daalden in de populatie. Daarna werden de populaties blootgesteld aan antibiotica voor een nachtelijke incubatie en werden ze opnieuw gekweekt onder niet-selectieve omstandigheden om te testen op de evolutie van plasmide stabiliteit. Dit cijfer is gewijzigd van Wein et al.8Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: representatieve analyse van de plasmide conformatie. Visualisatie van het model plasmide pCON. Gevisualiseerd is het onbehandelde plasmide DNA direct na het uitpakken, gelineariseerd plasmide DNA, en behandeld met DNase die alleen chromosomaal DNA snijdt, evenals enzymatisch verkreukeld DNA (dat wil zeggen, open cirkel plasmide DNA). Linearizing the plasmide toont aan dat alle plasmiden van dezelfde grootte zijn. Het verwijderen van chromosomaal DNA en picknicken pCon onthult de aanwezigheid van Dimeren en andere multimers. Dit cijfer is gewijzigd van Wein et al.8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
In dit protocol presenteren we een aanpak die technieken in moleculaire biologie, experimentele evolutie en DNA-visualisatie combineert om de rol van plasmide evolutie voor de persistentie van antibioticaresistentie bij bacteriën te onderzoeken. Hoewel de gepresenteerde aanpak methoden van verschillende onderzoeksgebieden combineert, zijn alle toegepaste technieken eenvoudig en kunnen worden uitgevoerd in een standaard laboratorium voor microbiologie.
De meest kritische stappen in het protocol omvatten de constructie van de modelsysteem stam die de genetische validering van het plasmide dragende genotype omvat. In het bijzonder coderen veel plasmiden natuurlijk antibioticaresistentiegenen. De lezer kan dus stap 1 van het protocol weglaten en direct doorgaan met stap 2. Vervolgens moeten de evolutie experimenten een willekeurig ontwerp van replicaatpopulaties bevatten, zodat de resultaten niet bevooroordeeld zijn door de positie van de replicaatpopulaties in de diepe-put-plaat. Daarnaast is het vooral belangrijk om de seriële Transfer-en verdunnings stappen in het Evolution-experiment zorgvuldig uit te voeren, omdat besmetting de resultaten zou vervalsen. Ten slotte, replica plating moet worden uitgevoerd met grote zorgvuldigheid. Grote kolonie grootte kan een probleem zijn, maar het kan worden vermeden door het inbroed van de platen voor minder dan 24 h. Evenzo, het aantal kolonies op een plaat kan bias replica plating resultaten. Daarom moeten populaties worden verdund voorafgaand aan het plating en replicatie.
Een van de grootste voordelen van onze aanpak is dat deze eenvoudig kan worden gereproduceerd zonder de noodzaak van zware apparatuur. Bovendien, een ander voordeel van replica plating te volgen marker genen is dat alleen levende cellen worden geëvalueerd, in tegenstelling tot flow flowcytometrieonderzoeken of qPCR waarin dode cellen kunnen worden geëvalueerd als levend. Dus, replica plating introduceert minder bias voor het tellen van plasmide dragende cellen. Niettemin, een beperking van de replica plating kan de grootte van de bevolking (dat wil zeggen, Cell Number) dat is mogelijk om te evalueren in een experimentele run.
Met behulp van onze aanpak hebben we onlangs laten zien dat plasmide stabiliteits evolutie de persistentie van antibioticaresistentiegenen in bacteriën potentieert. Zo ontwikkelden we een aanpak als een instrument om plasmide gemedieerde resistentie persistentie te volgen, die van groot belang is om resistentie na verloop van tijd te volgen, vooral onder omstandigheden zonder de aanwezigheid van antibiotica.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Gor Margaryan voor creatieve ondersteuning en technische assistentie. Dit werk werd gesteund door de ZMB Young Scientist Grant 2017/2018 (toegekend aan TW) en het DFG focus programma 1819 (Grant No. DA1202/2-1 toegekend aan TD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-deep-well plates | Starlab | ||
| 96-deep-well plates | Roth | EN07.1 | 2 ml, square |
| 96-deep-well plates (cryo) | Starlab | E1702-8400 | Micro-Dilution Tube System |
| Colony counter | Stuart | SC6+ | |
| Cotton velvet | drapery shop | 100 % cotton required | |
| Electrophoresis chamber | BioRad | Agarose gel electrophoresis | |
| Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
| Electroporation cuvettes | BioRad | 1652089 | 0.1 cm |
| Electroporator | BioRad | 1652660 | |
| GeneJet Gel Extraction kit | Thermo Fisher Scientific | K0832 | PCR fragment clean-up |
| GeneJet Plasmid Miniprep kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Plasmid extraction kit |
| Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50125852 | |
| Incubator (plate shaker) | Heidolph | 1000 | |
| Incubator (shaker) | New Brunswick Scientific | Innova 44 | |
| Inoculating loops | Sigma-Aldrich | ||
| Multi-channel pippetes | Eppendorf | 3125000052, 3125000028 | |
| Multi-channel pippetes | Capp | ME8-1250R | |
| NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND2000 | |
| Oligonucleotides | Eurofines | ||
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | ||
| Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
| Pipettes | Eppendorf | 3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063, | |
| PlasmidSafe enzyme | Epicentre | 10059400 | |
| Reaction tubes | Eppendorf | 30125150 | |
| Replica block & metal ring | VWR | 601-3401 | PVC cylinder 69 mm; ring 102cm |
| Resctriction enzymes | New England Biolabs | ||
| Thermocycler | BioRad | T100 |
References
- San Millan, A. Evolution of plasmid-mediated antibiotic resistance in the clinical context. Trends in Microbiology. 26 (12), 978-985 (2018).
- Bruto, M., James, A., et al. Vibrio crassostreae, a benign oyster colonizer turned into a pathogen after plasmid acquisition. The ISME Journal. 11 (4), 1043-1052 (2017).
- von Wintersdorff, C. J. H., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7 (110), 305-310 (2016).
- Lenski, R. E. Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations. ISME Journal. 11 (10), 2181-2194 (2017).
- De Gelder, L., Williams, J. J., Ponciano, J. E. M., Sota, M., Top, E. M. Adaptive plasmid evolution results in host-range expansion of a broad-host-range plasmid. Genetics. 178 (4), 2179-2190 (2008).
- Harrison, E., Guymer, D., Spiers, A. J., Paterson, S., Brockhurst, M. A. Parallel compensatory evolution stabilizes plasmids across the parasitism-mutualism continuum. Current Biology. 25 (15), 2034-2039 (2015).
- Bouma, J. E., Lenski, R. E.
- Wein, T., Hülter, N. F., Mizrahi, I., Dagan, T. Emergence of plasmid stability under nonselective conditions maintains antibiotic resistance. Nature Communications. 10 (1), 2595 (2019).
- Loftie-Eaton, W., et al. Compensatory mutations improve general permissiveness to antibiotic resistance plasmids. Nature Ecology & Evolution. 1 (9), 1354-1363 (2017).
- Millan, A. S., et al. Positive selection and compensatory adaptation interact to stabilize non-transmissible plasmids. Nature Communications. 5 (1), 1-11 (2014).
- Loftie-Eaton, W., Tucker, A., Norton, A., Top, E. M. Flow cytometry and real-time quantitative PCR as tools for assessing plasmid persistence. Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5439-5446 (2014).
- Münch, K. M., et al. Polar fixation of plasmids during recombinant protein production in Bacillus megaterium results in population heterogeneity. Applied and Environmental Microbiology. 81 (17), 5976-5986 (2015).
- Jahn, M., Vorpahl, C., Hübschmann, T., Harms, H., Müller, S. Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR. Microbial Cell Factories. 15 (1), 211 (2016).
- Lederberg, J., Lederberg, M. E. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. Journal of Bacteriology. 63, 399-406 (1952).
- Summers, D. K., Sherratt, D. J. Multimerization of high copy number plasmids causes instability: ColE1 encodes a determinant essential for plasmid monomerization and stability. Cell. 36 (4), 1097-1103 (1984).
- Summers, D. K., Beton, C. W., Withers, H. L. Multicopy plasmid instability: the dimer catastrophe hypothesis. Molecular Microbiology. 8 (6), 1031-1038 (1993).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
- Ilhan, J., et al. Segregational drift and the interplay between plasmid copy number and evolvability. Molecular Biology and Evolution. 36 (3), 472-486 (2019).
- Beck, E., Ludwig, G., Auerswald, E. A., Reiss, B., Schaller, H. Nucleotide sequence and exact localization of the neomycin phosphotransferase gene from transposon Tn5. Gene. 19 (3), 327-336 (1982).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
