हमारा प्रायोगिक दृष्टिकोण बैक्टीरियल आबादी में समय के साथ प्लाज्मिड बहुतायत और एंटीबायोटिक प्रतिरोध का पालन करने की रणनीति प्रदान करता है।
प्लाज्मिड्स माइक्रोबियल पारिस्थितिकी और विकास में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं क्योंकि पार्श्व जीन हस्तांतरण और माइक्रोबियल आबादी में सहायक जीन कार्यों के जलाशयों के वाहन। यह विशेष रूप से तेजी से बदलते वातावरण के तहत मामला है जैसे कि एंटीबायोटिक दवाओं के जोखिम में उतार-चढ़ाव । हमने हाल ही में दिखाया कि प्लाज्मिड उपस्थिति के लिए सकारात्मक चयन के बिना एस्चेरिचिया कोलाई में एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन बनाए रखते हैं। यहां हम एक प्रायोगिक प्रणाली का वर्णन करते हैं जो दीर्घकालिक विकास प्रयोगों में प्लाज्मिड जीनोटाइप और फेनोटाइप दोनों का पालन करने की अनुमति देता है। हम आणविक तकनीकों का उपयोग एक मॉडल प्लाज्मिड डिजाइन करने के लिए करते हैं जिसे बाद में ई. कोलाई होस्ट में एक प्रयोगात्मक विकास बैच सिस्टम दृष्टिकोण से पेश किया जाता है। हम समय के साथ प्लाज्मिड आवृत्ति का पालन करें ई. कोलाई आबादी की प्रतिकृति चढ़ाना लागू करने के द्वारा, जबकि एंटीबायोटिक प्रतिरोध हठ मात्रा । इसके अलावा, हम प्लाज्मिड निकिंग और अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा प्लाज्मिड मल्टीमर गठन की सीमा का विश्लेषण करके मेजबान कोशिकाओं में प्लाज्मिड की संरचना की निगरानी करते हैं। इस तरह के एक दृष्टिकोण हमें न केवल विकसित प्लाज्मिड के जीनोम आकार की कल्पना करने की अनुमति देता है, लेकिन यह भी उनके स्थलोलॉजिकल संरचना-प्लाज्मिड विरासत के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण कारक । हमारी प्रणाली पारंपरिक माइक्रोबायोलॉजी दृष्टिकोण के साथ आणविक रणनीतियों को जोड़ती है और लंबे समय से बैक्टीरियल आबादी में प्लाज्मिड का पालन करने के लिए एक सेट-अप प्रदान करती है। प्रस्तुत दृष्टिकोण भविष्य में मोबाइल आनुवंशिक तत्वों की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
प्लाज्मिड गोलाकार होते हैं, जो स्वयं को दोहराने वाले आनुवंशिक तत्व होते हैं जो प्रोकैरियोट्स में सर्वव्यापी होते हैं। वे पार्श्व जीन हस्तांतरण के एजेंट हैं, क्योंकि वे माइक्रोबियल आबादी के बीच लक्षण स्थानांतरित कर सकते हैं, और इस प्रकार माइक्रोबियल विकास में एक प्रमुख भूमिका निभाने के लिए माना जाता है । प्लाज्मिड कम समय में विकास-सीमित स्थितियों के लिए तेजी से अनुकूलन के चालक हैं (उदाहरण के लिए, एंटीबायोटिक दवाओं या कीटनाशकों की उपस्थिति में1)और अन्य जीवनशैली मोड में दीर्घकालिक संक्रमण के लिए जिम्मेदार हैं (उदाहरण के लिए, रोगजनकता2का उद्भव)। जीन के हस्तांतरण पर प्लाज्मिड के प्रभाव के लिए सबसे उल्लेखनीय उदाहरण एंटीबायोटिक दवाओं के उतार-चढ़ाव वाले स्तरों के संपर्क में आने वाले पारिस्थितिकी प्रणालियों में प्रलेखित किए जाते हैं, जैसे चिकित्सा क्लीनिक या औद्योगिक खेतों में3। मजबूत सकारात्मक चयन के कारण, कई प्लाज्मिड एंटीमाइक्रोबियल प्रतिरोध जीन के लिए एन्कोड करते हैं और अक्सर अपने बैक्टीरियल होस्ट को बहुप्रतिरोधक प्रदान करने के लिए पाए जाते हैं। प्लाज्मिड आबादी या बैक्टीरियल प्रजातियों के बीच प्रवास को सक्षम करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप कई रोगाणुरोधी प्रतिरोध का तेजी से प्रचार होता है। अचयनात्मक परिस्थितियों में प्लाज्मिड सेल के लिए आवश्यक नहीं हैं और अक्सर परजीवी तत्वों के रूप में भी जाना जाता है। फिर भी, प्लाज्मिड प्रकृति में सर्वव्यापी हैं और उनका विकास बैक्टीरियल गुणसूत्रों के साथ अत्यधिक जुड़ा हुआ है। प्राकृतिक वातावरण में प्लाज्मिड हठ (उतार-चढ़ाव और गैर-चयनात्मक) खराब समझ में आता है, फिर भी प्रकृति में एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के हठ के बारे में हमारी समझ के लिए यह उच्च महत्व का है।
प्रायोगिक विकास माइक्रोबियल आबादी4के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । प्रायोगिक विकास ने दिखादिया कि प्लाज्मिड रखरखाव के लिए मजबूत चयन लगाने से प्लाज्मिड या होस्ट गुणसूत्र का प्रतिपूरक (यानी अनुकूली) विकास होता है जो प्लाज्मिड फिटनेस लागत को कम करता है और बदले में, प्लाज्मिड बहुतायत (यानी प्लाज्मिड हठ)5,6,7की सुविधा प्रदान करता है। इस प्रकार, समय के साथ प्लाज्मिड-होस्ट इंटरैक्शन के बाद दोनों तत्वों के अनुकूलन के महत्वपूर्ण तंत्र प्रकट हो सकते हैं। इसके अलावा, प्रायोगिक विकास8,9,10विभिन्न परिस्थितियों में समय के साथ प्लाज्मिड-ले जाने वाली कोशिकाओं की बहुतायत को निर्धारित करने में सक्षम बनाता है।
विकास प्रयोगों में प्लाज्मिड हठ फ्लोरोसेंट एक्टिवेटेड सेल छंटाई (एफएसीएस)11,मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर)11,या खेती आधारित तरीकों में प्रवाह साइटोमेट्री सहित कई रणनीतियों द्वारा निगरानी की जा सकती है। फ्लो साइटोमेट्री को प्लाज्मिड पर एक एफएसीएस मशीन और एक डिटेक्टेबल (फ्लोरोसेंट) मार्कर जीन की शुरुआत की आवश्यकता होती है, जैसे कि ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी), प्लाज्मिड पर। हालांकि, जीएफपी अभिव्यक्ति कई सेलुलर गुणों को बदल सकती है और इसके अलावा सेल12में प्लाज्मिड स्थान को प्रभावित कर सकती है, जो बदले में सेल डिवीजन के दौरान प्लाज्मिड विरासत को प्रभावित कर सकती है। प्लाज्मिड बहुतायत को मापने के लिए एक क्यूपीसीआर दृष्टिकोण प्लाज्मिड कॉपी संख्या से अत्यधिक पक्षपाती हो सकता है, जो बैक्टीरियल विकास चरण औरसमय 13के साथ बहुत भिन्न हो सकता है। अंत में, एक संस्कृति आधारित और चढ़ाना दृष्टिकोण एक चयन मार्कर जीन की शुरूआत की आवश्यकता है । यह एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन हो सकता है, जिसे अक्सर प्राकृतिक प्लाज्मिड पर एन्कोड किया जाता है; इस प्रकार, कोई आनुवंशिक हेरफेर आवश्यक नहीं है। एंटीबायोटिक प्रतिरोध एक पारंपरिक प्रतिकृति चढ़ाना दृष्टिकोण के बाद किया जा सकता है । इस प्रकार, प्राकृतिक प्लाज्मिड गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए, प्रतिकृति चढ़ाना प्लाज्मिड-एन्कोडेड एंटीबायोटिक रिसिजिटेंस14की निगरानी के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।
प्लाज्मिड अणुओं की कल्पना करने के लिए (उदाहरण के लिए, प्लाज्मिड आकार का मूल्यांकन करने के लिए) कई विधियां लागू की जा सकती हैं। पीसीआर-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करके पूरे प्लाज्मिड को परिलक्षित किया जा सकता है। हालांकि, इसके लिए विशिष्ट प्राइमर के डिजाइन की आवश्यकता होती है, जो विकास प्रयोग के दौरान चुनौतीपूर्ण हो सकता है, क्योंकि प्लाज्मिड अनुक्रम समय के साथ बदल सकता है। इसके अलावा, पीसीआर प्राइमर के लिए कई बाध्यकारी साइटों के कारण पीसीआर आधारित दृष्टिकोण में प्लाज्मिड मल्टीमर्स को बढ़ाना मुश्किल है। बहुमेरिक प्लाज्मिड अणु प्लाज्मिड प्रतिकृति समाप्ति के बाद या प्लाज्मिड अणुओं के पुनर्संयोजन के माध्यम से दिखाई दे सकते हैं और ज्यादातर सिर से पूंछ15उन्मुख होते हैं। प्लाज्मिड विज़ुअलाइज़ेशन का एक और दृष्टिकोण डीएनए एंनोन्यूकलीज द्वारा प्लाज्मिड अणुओं के एंजाइमैटिक पाचन को जोड़ती है जो या तो क्लीव या निक एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस विश्लेषण के साथ एक प्लाज्मिड डीएनए स्ट्रैंड को निक करता है। विभिन्न आकारों (जैसे, मोनोमर बनाम मल्टीमर) का एक ही प्लाज्मिड विभिन्न जेल गतिशीलता में परिणाम देता है जिसे प्लाज्मिड अणुओं की कल्पना करते समय देखा जा सकता है। यह दृष्टिकोण विभिन्न प्लाज्मिड संरचनाओं (यानी मल्टीमराइजेशन राज्यों) के दृश्य और मात्राकरण को सक्षम बनाता है। प्लाज्मिड संरचना को प्लाज्मिड स्थिरता के संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि सेल डिवीजन16के दौरान प्लाज्मिड मल्टीमर अक्सर खो जाते हैं।
हाल ही में एक काम में, हम शर्तों में प्लाज्मिड हठ का पालन किया है कि प्लाज्मिड बहुतायत के लिए चयनात्मक नहीं थे (यानी, एंटीबायोटिक चयन के बिना) । हमने प्लाज्मिड हठ की तुलना दो अलग-अलग तापमान (20 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस) और तीन जनसंख्या आकार (यानी कमजोर पड़ने की दर) पर की। विभिन्न कमजोर पड़ने की दरों, या जनसंख्या बाधाओं को लागू करना, बैक्टीरियल और प्लाज्मिड विकास पर जनसंख्या आकार के प्रभाव की जांच के लिए अनुमति देता है। हमारे परिणामों के आधार पर, हम प्रस्ताव है कि प्लाज्मिड ्स अपने जीवाणु मेजबान के लिए तटस्थ हो सकता है और किसी भी चयन दबाव8के बिना स्थिरता विकसित कर सकते हैं । विकसित प्लाज्मिड स्थिरता प्लाज्मिड मल्टीमर गठन8की कमी से प्रदान की जाती है ।
यहां, हम एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के रखरखाव के संबंध में प्लाज्मिड हठ और प्लाज्मिड विकास की जांच की मात्रा के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । विधि में कई कदम हैं, जिनमें एक मॉडल प्लाज्मिड के लिए एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन का सम्मिलन शामिल है (जिसे प्राकृतिक प्रतिरोध प्लाज्मिड का उपयोग करते समय छोड़ा जा सकता है), इसके बाद प्लाज्मिड की क्षमता का आकलन करने के लिए प्रायोगिक विकास का उपयोग जारी रहता है प्रतिकृति चढ़ाना का उपयोग करके समय के साथ प्लाज्मिड आवृत्ति गतिशीलता का निर्धारण करते समय गैर-चयनात्मक परिस्थितियों में, और दृश्य द्वारा प्लाज्मिड जीनोम का विश्लेषण। यहां वर्णित प्रोटोकॉल को प्लाज्मिड्स के विकास और दृढ़ता की जांच करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, लेकिन इसे समय के साथ गुणसूत्र प्रतिरोध जीन (या अन्य मार्कर जीन) के विकास का पालन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में, हम एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं जो बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक प्रतिरोध के हठ के लिए प्लाज्मिड विकास की भूमिका की जांच करने के लिए आणविक जीव विज्ञान, प्रयोगात्मक विकास और डीएनए दृश्य में तकनीकों को जोड़ती है। हालांकि प्रस्तुत दृष्टिकोण विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों से तरीकों को जोड़ती है, सभी लागू तकनीकों सीधा कर रहे है और एक मानक माइक्रोबायोलॉजी प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया जा सकता है ।
प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम मॉडल प्रणाली तनाव है कि प्लाज्मिड ले जाने जीनोटाइप के आनुवंशिक सत्यापन भी शामिल है के निर्माण में शामिल हैं । विशेष रूप से, कई प्लाज्मिड स्वाभाविक रूप से एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन को एन्कोड करते हैं। इस प्रकार, पाठक प्रोटोकॉल के चरण 1 को छोड़ सकता है और सीधे चरण 2 के साथ आगे बढ़ सकता है। इसके बाद, विकास प्रयोगों में आबादी को दोहराने का एक यादृच्छिक डिजाइन शामिल होना चाहिए ताकि परिणाम गहरी अच्छी तरह से प्लेट में दोहराने वाली आबादी की स्थिति से पक्षपाती न हों। इसके अलावा, विकास प्रयोग में सीरियल ट्रांसफर और कमजोर पड़ने वाले चरणों को सावधानीपूर्वक संचालित करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि संदूषण परिणामों को ग़लत साबित करेगा। अंत में, प्रतिकृति चढ़ाना बड़ी सावधानी के साथ आयोजित किया जाना चाहिए। बड़ी कॉलोनी का आकार एक मुद्दा हो सकता है, लेकिन 24 घंटे से कम समय के लिए प्लेटों को इनक्यूबेटकरी करके इससे बचा जा सकता है। इसी तरह, एक प्लेट पर कालोनियों की संख्या प्रतिकृति चढ़ाना परिणाम पूर्वाग्रह हो सकता है । इसलिए, चढ़ाना और प्रतिकृति से पहले आबादी को पतला करने की आवश्यकता है।
हमारे दृष्टिकोण का सबसे बड़ा लाभ यह है कि आसानी से भारी उपकरणों की आवश्यकता के बिना पुन: पेश किया जा सकता है । इसके अलावा, मार्कर जीन का पालन करने के लिए प्रतिकृति चढ़ाना का एक और लाभ यह है कि केवल जीवित कोशिकाओं का मूल्यांकन किया जाता है, प्रवाह साइटोमेट्री या क्यूपीसीआर के विपरीत जिसमें मृत कोशिकाओं को जीवित के रूप में मूल्यांकन किया जा सकता है। इस प्रकार, प्रतिकृति चढ़ाना प्लाज्मिड-ले जाने वाली कोशिकाओं की गिनती के लिए कम पूर्वाग्रह का परिचय देता है। बहरहाल, प्रतिकृति चढ़ाना की एक सीमा जनसंख्या आकार (यानी, सेल संख्या) है कि एक प्रयोगात्मक रन में मूल्यांकन करने के लिए संभव है हो सकता है ।
हमारे दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने हाल ही में दिखाया है कि प्लाज्मिड स्थिरता विकास बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के हठ को शक्तिशाली बनाता है। इस प्रकार, हमने प्लाज्मिड-मध्यस्थता प्रतिरोध हठ का पालन करने के लिए एक उपकरण के रूप में एक दृष्टिकोण विकसित किया है जो एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति के बिना विशेष रूप से शर्तों के तहत समय के साथ प्रतिरोध का पालन करने के लिए उच्च महत्व का है।
The authors have nothing to disclose.
हम रचनात्मक सहायता और तकनीकी सहायता के लिए गोर मार्गआर्यन को धन्यवाद देते हैं । इस काम को जेडएमबी यंग साइंटिस्ट ग्रांट 2017/2018 (TW को सम्मानित) और डीएफजी फोकस प्रोग्राम 1819 (ग्रांट नंबर एक) ने सपोर्ट किया था। DA1202/2-1 टीडी को सम्मानित किया गया) ।
96-deep-well plates | Starlab | ||
96-deep-well plates | Roth | EN07.1 | 2 ml, square |
96-deep-well plates (cryo) | Starlab | E1702-8400 | Micro-Dilution Tube System |
Colony counter | Stuart | SC6+ | |
Cotton velvet | drapery shop | 100 % cotton required | |
Electrophoresis chamber | BioRad | Agarose gel electrophoresis | |
Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
Electroporation cuvettes | BioRad | 1652089 | 0.1 cm |
Electroporator | BioRad | 1652660 | |
GeneJet Gel Extraction kit | Thermo Fisher Scientific | K0832 | PCR fragment clean-up |
GeneJet Plasmid Miniprep kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Plasmid extraction kit |
Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50125852 | |
Incubator (plate shaker) | Heidolph | 1000 | |
Incubator (shaker) | New Brunswick Scientific | Innova 44 | |
Inoculating loops | Sigma-Aldrich | ||
Multi-channel pippetes | Eppendorf | 3125000052, 3125000028 | |
Multi-channel pippetes | Capp | ME8-1250R | |
NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND2000 | |
Oligonucleotides | Eurofines | ||
Petri dishes | Sigma-Aldrich | ||
Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
Pipettes | Eppendorf | 3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063, | |
PlasmidSafe enzyme | Epicentre | 10059400 | |
Reaction tubes | Eppendorf | 30125150 | |
Replica block & metal ring | VWR | 601-3401 | PVC cylinder 69 mm; ring 102cm |
Resctriction enzymes | New England Biolabs | ||
Thermocycler | BioRad | T100 |