Vores eksperimentelle tilgang giver en strategi for at følge plasmid tæthed og antibiotikaresistens over tid i bakterie populationer.
Plasmider spiller en stor rolle i mikrobiel økologi og Evolution som køretøjer af lateral gen overførsel og reservoirer af tilbehør gen funktioner i mikrobielle populationer. Dette er især tilfældet under hurtigt skiftende miljøer, såsom udsving i eksponeringen for antibiotika. Vi har for nylig vist, at plasmider opretholder antibiotikaresistensgener i Escherichia coli uden positiv udvælgelse til plasmid tilstedeværelse. Her beskriver vi et eksperimentelt system, der gør det muligt at følge både plasmid genotype og fænotype i langsigtede evolutions eksperimenter. Vi bruger molekylære teknikker til at designe en model plasmid, der efterfølgende introduceres til en eksperimentel Evolution batch system tilgang i en E. coli vært. Vi følger plasmid frekvens over tid ved at anvende replika plating af E. coli populationer samtidig kvantificere antibiotikaresistens vedholdenhed. Derudover overvåger vi konformationen af plasmid’er i værtscellerne ved at analysere omfanget af plasmid Multimer dannelse ved plasmid nicking og agrose gel elektroforese. En sådan tilgang giver os mulighed for at visualisere ikke kun genomstørrelsen af udviklende plasmider, men også deres topologiske kropsbygning-en faktor, der er meget vigtig for plasmid-arv. Vores system kombinerer molekylære strategier med traditionelle mikrobiologiske tilgange og giver en opsætning til at følge plasmider i bakterie populationer over en lang tid. Den præsenterede tilgang kan anvendes til at studere en bred vifte af mobile genetiske elementer i fremtiden.
Plasmider er cirkulære, selvkopierende genetiske elementer, der er allestedsnærværende i prokaryoter. De er agenter for lateral genoverførsel, da de kan overføre træk mellem mikrobielle populationer og derfor anses for at spille en vigtig rolle i mikrobiel evolution. Plasmider er drivkræfter for hurtig tilpasning til vækst begrænsende forhold over en kort tid (f. eks. ved tilstedeværelse af antibiotika eller pesticider1) og er ansvarlige for langsigtet overgang til andre livsstils tilstande (f. eks. fremkomsten af patogenicitet2). De mest slående eksempler på virkningen af plasmider på overførsel af gener er dokumenteret i økosystemer udsat for svingende niveauer af antibiotika, såsom medicinske klinikker eller i industrielle bedrifter3. På grund af stærk positiv udvælgelse, mange plasmider kode for antimikrobiel resistensgener og er ofte fundet at give multiresistens til deres bakterielle vært. Plasmider muliggør migration mellem populationer eller bakteriearter, hvilket resulterer i en hurtig udbredelse af multipel antimikrobiel resistens. Under ikke-selektive forhold er plasmider ikke afgørende for cellen og omtales ofte endda som parasitære elementer. Ikke desto mindre, plasmider er allestedsnærværende i naturen og deres udvikling er meget sammenflettet med den af bakterielle kromosomer. Plasmid persistens i naturlige miljøer (svingende og ikke-selektive) er stadig dårligt forstået, men det er af stor betydning for vores forståelse af persistens af antibiotikaresistensgener i naturen.
Eksperimentel evolution er et effektivt værktøj til studiet af mikrobielle populationer4. Eksperimentel Evolution viste, at indførelse af stærk udvælgelse til plasmid vedligeholdelse fører til kompenserende (dvs. adaptiv) udvikling af plasmid eller Host kromosom, der reducerer plasmid fitness omkostninger og, til gengæld, letter plasmid overflod (dvs. plasmid vedholdenhed)5,6,7. Således, efter plasmid-vært interaktion over tid kan afsløre vigtige mekanismer for tilpasning af begge elementer. Endvidere, eksperimentel Evolution gør det muligt at kvantificere den overflod af plasmid-bærende celler med tiden under forskellige betingelser8,9,10.
Plasmid persistens i Evolution eksperimenter kan overvåges af flere strategier, herunder flow cytometri ved fluorescerende aktiveret celle sortering (FACS)11, kvantitativ PCR (qPCR)11, eller i dyrknings-baserede metoder. Flowcytometri kræver en FACS-maskine og indførelse af et detekterbart (fluorescerende) markør-gen, såsom det grønne fluorescerende protein (GFP), på plasmid. GFP-udtryk kan dog ændre flere cellulære egenskaber og påvirker desuden plasmid-placeringen i cellen12, hvilket igen kan påvirke plasmid-arv under celledeling. En qPCR tilgang til måling af plasmid overflod kan være meget partisk af plasmid kopi nummer, som kan variere meget langs bakteriel vækstfase og med tiden13. Endelig kræver en kultur baseret og plating tilgang, at der indføres et valgbart markør-gen. Dette kan være et antibiotikum resistens gen, som ofte er kodet på naturlige plasmider; Derfor er ingen genetisk manipulation nødvendig. Antibiotikaresistens kan efterfølges af en traditionel replikeringsmetode. Således, at studere naturlige plasmid dynamik, replika plating er velegnet til at overvåge plasmid-kodet antibiotika resisitance14.
At visualisere plasmid molekyler (f. eks, at evaluere plasmid størrelse) flere metoder kan anvendes. Hele plasmider kan forstærkes ved hjælp af en PCR-baseret tilgang. Dette kræver dog design af specifikke primere, som kan være udfordrende under et Evolution eksperiment, fordi plasmid sekvens kan ændre sig over tid. Derudover er det vanskeligt at forstærke plasmid-multimere i en PCR-baseret tilgang på grund af flere bindingssteder for PCR-primerne. Multimeric plasmid molekyler kan forekomme efter plasmid replikation opsigelse eller gennem rekombination af plasmid molekyler og er for det meste orienteret hoved-til-hale15. En anden tilgang af plasmid visualisering kombinerer enzymatisk fordøjelse af plasmid molekyler af DNA endonukleaser, der enten kløver eller Nick en plasmid DNA-streng med agopstået gel elektroforese analyse. Den samme plasmid af forskellige størrelser (f. eks monomerer vs. multimere) resulterer i forskellige gel-moteter, der kan observeres, når visualisere plasmid molekyler. Denne fremgangsmåde muliggør visualisering og kvantificering af forskellige plasmid-konstellationer (dvs. multimeriserings tilstande). Plasmid-konformationen kan anvendes som indikator for plasmid-stabilitet, da plasmid-multimere ofte mistes under celle division16.
I et nyligt arbejde, vi fulgte plasmid persistens i forhold, der ikke var selektive for plasmid overflod (dvs., uden antibiotika udvælgelse). Vi sammenlignede plasmid persistens ved to forskellige temperaturer (20 °C og 37 °C) og tre populations størrelser (dvs. fortyndings hastigheder). Anvendelse af forskellige fortyndings hastigheder, eller befolknings flaskehalse, giver mulighed for undersøgelse af indflydelsen af befolkningens størrelse på bakteriel og plasmid Evolution. Baseret på vores resultater, foreslår vi, at plasmider kan være neutral over for deres bakterielle vært og kan udvikle stabilitet uden valg Tryk8. Den udviklede plasmid stabilitet er tillagt ved reduktion af plasmid Multimer dannelse8.
Her præsenterer vi en protokol til kvantificering af plasmid persistens og undersøgelse af plasmid Evolution med hensyn til vedligeholdelse af antibiotikaresistensgener. Metoden har flere trin, herunder indsættelse af et antibiotikum resistens gen til en model plasmid (som kan udelades, når du bruger en naturlig resistens plasmid), efterfulgt af brugen af eksperimentel evolution til at vurdere potentialet i plasmid til at fortsætte under ikke-selektive betingelser, mens bestemme plasmid frekvens dynamik over tid ved hjælp af replika plating, og analysen af plasmid genom ved visualisering. Den protokol, der er beskrevet her, var designet til at undersøge udviklingen og persistens af plasmider, men det kan også anvendes til at følge udviklingen af kromosomale resistensgener (eller andre markørgener) over tid.
I denne protokol præsenterer vi en tilgang, der kombinerer teknikker i molekylær biologi, eksperimentel evolution og DNA-visualisering for at undersøge rollen af plasmid Evolution for persistens af antibiotikaresistens i bakterier. Selv om den præsenterede tilgang kombinerer metoder fra forskellige forskningsområder, alle de anvendte teknikker er ligetil og kan udføres i en standard Mikrobiologi laboratorium.
De mest kritiske trin i protokollen omfatter konstruktionen af modellen system stamme, der omfatter den genetiske validering af plasmid-bærende genotype. Især, mange plasmider naturligt indkode antibiotikaresistensgener. Derfor kan læseren udelade trin 1 i protokollen og gå direkte videre med trin 2. Dernæst bør evolutions forsøgene omfatte et tilfældigt design af replikate populationer, således at resultaterne ikke er partiske ved placeringen af de replikate populationer i Deep-Well pladen. Desuden er det især vigtigt at omhyggeligt gennemføre de serielle overførsel og fortynding trin i Evolution eksperiment som forurening ville forfalske resultaterne. Endelig, replika plating skal udføres med stor omhu. Stor koloni størrelse kan være et problem, men det kan undgås ved inkubning af pladerne for mindre end 24 h. Tilsvarende, antallet af kolonier på en plade kan bias replika plating resultater. Derfor, populationer skal fortyndes før plating og replikation.
En af de største fordele ved vores tilgang er, at er let kan gengives uden behov for tungt udstyr. Desuden er en anden fordel ved replika plating at følge markørgener, at kun levende celler evalueres, i modsætning til flow flowcytometri eller qPCR, hvor døde celler kan evalueres som levende. Således, replika plating introducerer mindre bias til optælling af plasmid-bærende celler. Ikke desto mindre, en begrænsning af replika plating kan være befolkningens størrelse (dvs. celle nummer), der er muligt at evaluere i en eksperimentel kørsel.
Ved hjælp af vores tilgang, har vi for nylig vist, at plasmid stabilitet Evolution potentiates persistens af antibiotikaresistensgener i bakterier. Således udviklede vi en tilgang som et redskab til at følge plasmid-medieret resistens vedholdenhed, der er af stor betydning at følge resistens over tid, især under forhold uden tilstedeværelsen af antibiotika.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker gor Margaryan for kreativ støtte og teknisk assistance. Dette arbejde blev støttet af ZMB Young Scientist Grant 2017/2018 (tildelt TW) og DFG Focus-programmet 1819 (Grant No. DA1202/2-1 tildelt til TD).
96-deep-well plates | Starlab | ||
96-deep-well plates | Roth | EN07.1 | 2 ml, square |
96-deep-well plates (cryo) | Starlab | E1702-8400 | Micro-Dilution Tube System |
Colony counter | Stuart | SC6+ | |
Cotton velvet | drapery shop | 100 % cotton required | |
Electrophoresis chamber | BioRad | Agarose gel electrophoresis | |
Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
Electroporation cuvettes | BioRad | 1652089 | 0.1 cm |
Electroporator | BioRad | 1652660 | |
GeneJet Gel Extraction kit | Thermo Fisher Scientific | K0832 | PCR fragment clean-up |
GeneJet Plasmid Miniprep kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Plasmid extraction kit |
Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50125852 | |
Incubator (plate shaker) | Heidolph | 1000 | |
Incubator (shaker) | New Brunswick Scientific | Innova 44 | |
Inoculating loops | Sigma-Aldrich | ||
Multi-channel pippetes | Eppendorf | 3125000052, 3125000028 | |
Multi-channel pippetes | Capp | ME8-1250R | |
NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND2000 | |
Oligonucleotides | Eurofines | ||
Petri dishes | Sigma-Aldrich | ||
Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
Pipettes | Eppendorf | 3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063, | |
PlasmidSafe enzyme | Epicentre | 10059400 | |
Reaction tubes | Eppendorf | 30125150 | |
Replica block & metal ring | VWR | 601-3401 | PVC cylinder 69 mm; ring 102cm |
Resctriction enzymes | New England Biolabs | ||
Thermocycler | BioRad | T100 |