Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Kvantificering af plasmid-medieret antibiotikaresistens i en eksperimentel Evolution-tilgang

doi: 10.3791/60749 Published: December 14, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Vores eksperimentelle tilgang giver en strategi for at følge plasmid tæthed og antibiotikaresistens over tid i bakterie populationer.

Abstract

Plasmider spiller en stor rolle i mikrobiel økologi og Evolution som køretøjer af lateral gen overførsel og reservoirer af tilbehør gen funktioner i mikrobielle populationer. Dette er især tilfældet under hurtigt skiftende miljøer, såsom udsving i eksponeringen for antibiotika. Vi har for nylig vist, at plasmider opretholder antibiotikaresistensgener i Escherichia coli uden positiv udvælgelse til plasmid tilstedeværelse. Her beskriver vi et eksperimentelt system, der gør det muligt at følge både plasmid genotype og fænotype i langsigtede evolutions eksperimenter. Vi bruger molekylære teknikker til at designe en model plasmid, der efterfølgende introduceres til en eksperimentel Evolution batch system tilgang i en E. coli vært. Vi følger plasmid frekvens over tid ved at anvende replika plating af E. coli populationer samtidig kvantificere antibiotikaresistens vedholdenhed. Derudover overvåger vi konformationen af plasmid'er i værtscellerne ved at analysere omfanget af plasmid Multimer dannelse ved plasmid nicking og agrose gel elektroforese. En sådan tilgang giver os mulighed for at visualisere ikke kun genomstørrelsen af udviklende plasmider, men også deres topologiske kropsbygning-en faktor, der er meget vigtig for plasmid-arv. Vores system kombinerer molekylære strategier med traditionelle mikrobiologiske tilgange og giver en opsætning til at følge plasmider i bakterie populationer over en lang tid. Den præsenterede tilgang kan anvendes til at studere en bred vifte af mobile genetiske elementer i fremtiden.

Introduction

Plasmider er cirkulære, selvkopierende genetiske elementer, der er allestedsnærværende i prokaryoter. De er agenter for lateral genoverførsel, da de kan overføre træk mellem mikrobielle populationer og derfor anses for at spille en vigtig rolle i mikrobiel evolution. Plasmider er drivkræfter for hurtig tilpasning til vækst begrænsende forhold over en kort tid (f. eks. ved tilstedeværelse af antibiotika eller pesticider1) og er ansvarlige for langsigtet overgang til andre livsstils tilstande (f. eks. fremkomsten af patogenicitet2). De mest slående eksempler på virkningen af plasmider på overførsel af gener er dokumenteret i økosystemer udsat for svingende niveauer af antibiotika, såsom medicinske klinikker eller i industrielle bedrifter3. På grund af stærk positiv udvælgelse, mange plasmider kode for antimikrobiel resistensgener og er ofte fundet at give multiresistens til deres bakterielle vært. Plasmider muliggør migration mellem populationer eller bakteriearter, hvilket resulterer i en hurtig udbredelse af multipel antimikrobiel resistens. Under ikke-selektive forhold er plasmider ikke afgørende for cellen og omtales ofte endda som parasitære elementer. Ikke desto mindre, plasmider er allestedsnærværende i naturen og deres udvikling er meget sammenflettet med den af bakterielle kromosomer. Plasmid persistens i naturlige miljøer (svingende og ikke-selektive) er stadig dårligt forstået, men det er af stor betydning for vores forståelse af persistens af antibiotikaresistensgener i naturen.

Eksperimentel evolution er et effektivt værktøj til studiet af mikrobielle populationer4. Eksperimentel Evolution viste, at indførelse af stærk udvælgelse til plasmid vedligeholdelse fører til kompenserende (dvs. adaptiv) udvikling af plasmid eller Host kromosom, der reducerer plasmid fitness omkostninger og, til gengæld, letter plasmid overflod (dvs. plasmid vedholdenhed)5,6,7. Således, efter plasmid-vært interaktion over tid kan afsløre vigtige mekanismer for tilpasning af begge elementer. Endvidere, eksperimentel Evolution gør det muligt at kvantificere den overflod af plasmid-bærende celler med tiden under forskellige betingelser8,9,10.

Plasmid persistens i Evolution eksperimenter kan overvåges af flere strategier, herunder flow cytometri ved fluorescerende aktiveret celle sortering (FACS)11, kvantitativ PCR (qPCR)11, eller i dyrknings-baserede metoder. Flowcytometri kræver en FACS-maskine og indførelse af et detekterbart (fluorescerende) markør-gen, såsom det grønne fluorescerende protein (GFP), på plasmid. GFP-udtryk kan dog ændre flere cellulære egenskaber og påvirker desuden plasmid-placeringen i cellen12, hvilket igen kan påvirke plasmid-arv under celledeling. En qPCR tilgang til måling af plasmid overflod kan være meget partisk af plasmid kopi nummer, som kan variere meget langs bakteriel vækstfase og med tiden13. Endelig kræver en kultur baseret og plating tilgang, at der indføres et valgbart markør-gen. Dette kan være et antibiotikum resistens gen, som ofte er kodet på naturlige plasmider; Derfor er ingen genetisk manipulation nødvendig. Antibiotikaresistens kan efterfølges af en traditionel replikeringsmetode. Således, at studere naturlige plasmid dynamik, replika plating er velegnet til at overvåge plasmid-kodet antibiotika resisitance14.

At visualisere plasmid molekyler (f. eks, at evaluere plasmid størrelse) flere metoder kan anvendes. Hele plasmider kan forstærkes ved hjælp af en PCR-baseret tilgang. Dette kræver dog design af specifikke primere, som kan være udfordrende under et Evolution eksperiment, fordi plasmid sekvens kan ændre sig over tid. Derudover er det vanskeligt at forstærke plasmid-multimere i en PCR-baseret tilgang på grund af flere bindingssteder for PCR-primerne. Multimeric plasmid molekyler kan forekomme efter plasmid replikation opsigelse eller gennem rekombination af plasmid molekyler og er for det meste orienteret hoved-til-hale15. En anden tilgang af plasmid visualisering kombinerer enzymatisk fordøjelse af plasmid molekyler af DNA endonukleaser, der enten kløver eller Nick en plasmid DNA-streng med agopstået gel elektroforese analyse. Den samme plasmid af forskellige størrelser (f. eks monomerer vs. multimere) resulterer i forskellige gel-moteter, der kan observeres, når visualisere plasmid molekyler. Denne fremgangsmåde muliggør visualisering og kvantificering af forskellige plasmid-konstellationer (dvs. multimeriserings tilstande). Plasmid-konformationen kan anvendes som indikator for plasmid-stabilitet, da plasmid-multimere ofte mistes under celle division16.

I et nyligt arbejde, vi fulgte plasmid persistens i forhold, der ikke var selektive for plasmid overflod (dvs., uden antibiotika udvælgelse). Vi sammenlignede plasmid persistens ved to forskellige temperaturer (20 °C og 37 °C) og tre populations størrelser (dvs. fortyndings hastigheder). Anvendelse af forskellige fortyndings hastigheder, eller befolknings flaskehalse, giver mulighed for undersøgelse af indflydelsen af befolkningens størrelse på bakteriel og plasmid Evolution. Baseret på vores resultater, foreslår vi, at plasmider kan være neutral over for deres bakterielle vært og kan udvikle stabilitet uden valg Tryk8. Den udviklede plasmid stabilitet er tillagt ved reduktion af plasmid Multimer dannelse8.

Her præsenterer vi en protokol til kvantificering af plasmid persistens og undersøgelse af plasmid Evolution med hensyn til vedligeholdelse af antibiotikaresistensgener. Metoden har flere trin, herunder indsættelse af et antibiotikum resistens gen til en model plasmid (som kan udelades, når du bruger en naturlig resistens plasmid), efterfulgt af brugen af eksperimentel evolution til at vurdere potentialet i plasmid til at fortsætte under ikke-selektive betingelser, mens bestemme plasmid frekvens dynamik over tid ved hjælp af replika plating, og analysen af plasmid genom ved visualisering. Den protokol, der er beskrevet her, var designet til at undersøge udviklingen og persistens af plasmider, men det kan også anvendes til at følge udviklingen af kromosomale resistensgener (eller andre markørgener) over tid.

Protocol

1. konstruktion af en model plasmid transporterer en antibiotikaresistens gen

Bemærk: stammen Escherichia coli K-12 MG1655 blev anvendt som model organisme i alle eksperimenter (DSM No. 18039, tysk samling af mikroorganismer og cellekulturer, DSMZ). Stammen E. coli DH5α17 blev brugt under plasmid konstruktion.

  1. PCR forstærker plasmid-rygraden efter dit valg og forstærker modstands genet, herunder Promoter-regionen, ved PCR (figur 1).
    1. PCR forstærker plasmid backbone ved hjælp af en high-fidelity polymerase og oligonukleotider pBBR1_for (5 '-gcggccaccggctggct-3 ') og pBBR1_rev (5 '-taccggcgcggcagcgtgaccc-3 ') på plasmid Template pLC (genbank Acc. no. MH238456)18.
    2. PCR forstærker resistens genet nptII , herunder Native Tn5 Promoter19 ved hjælp af en high-fidelity polymerase og oligonukleotider nptII_gib_for (5 '-gcgccggtagatctgctcatgtttgaagcttcacgctgccgca-3 ') og nptII_gib_rev (5 '-cggtggccgccaaaaaggccatccgtcaggtcagaagaactcgt-3 '). NptII -genet koder for neomycin fosfotransferase og giver resistens over for kanamycin.
      Bemærk: design primere til modstands genet med ca. 20 BP af komplementær sekvens til plasmid-rygraden, som det vil blive smeltet til.
  2. Rengør begge PCR-fragmenter med et sæt, du vælger.
  3. Deltag i det rensede antibiotikaresistens-gen PCR-produkt (inklusive dets promotor-region) til det rensede plasmid-backbone og sikrde homologe regioner ved hjælp af isotermisk montage20, ved 50 °c i 60 min.
  4. Elektroporat det smeltet produkt i stammen E. coli DH5α.
    1. 2 μL af produktet indføres fra trin 1,3 til 40 μL elektro kompetente celler i 2 mm kuvetter ved 4 °C og 2,5 kV. Resuspension af celler i 1 mL lysogeny bouillon (LB) medium.
    2. Den totale volumen overføres til en mikrofuge slange, og der inkubes 1 t ved 37 °C ved omrystning ved 250 rpm i en orbital shaker for at give mulighed for at ekspressions markøren på plasmid.
    3. Plade 100 μL af cellerne på LB-agarplader indeholdende det relevante antibiotikum (kanamycin 25 μg/mL) til at udvælge antibiotikaresistens genet og således vælge til plasmid-bærende celler. Drej resten, Fjern supernatanten, resuspender cellerne i 100 μL LB og pladen på en selektiv agar plade. Pladerne inkubates ved 37 °C i 24 timer.
  5. For at verificere kloner, udtrække de konstruerede plasmider via alkalisk lysis ved hjælp af en kommerciel mini-prep kit.
    1. Høst 5 mL af den stationære overnight kultur ved centrifugering ved 12.000 x g ved stuetemperatur. Resuspender cellerne i opblanding opløsning, derefter lysere og neutralisere celle opløsningen. Centrifuger i 5 minutter ved 12.000 x g.
    2. Supernatanten overføres til DNA-bindings kolonnen i sættet, og kolonnen vaskes to gange med 500 μL vaskeopløsning, der centrifugerer 2x, før kolonne membranen fjernes med elueringsbuffer.
    3. Udfør sanger sekvensering af plasmid for at bekræfte, at sekvensen er korrekt.
  6. Når plasmid gyldighed er verificeret, elektroporat plasmid (nu pCON) i stammen E. coli MG1655 som beskrevet ovenfor. Dette giver stamme E. coli MG1655 pCon.

2. overvågning af plasmid-transporterer bakterier under forskellige forhold over tid

Bemærk: evolutions eksperimentet udføres med plasmid-bærende stammer under ikke-selektive forhold (LB-medier) i to temperaturer (37 °C og 20 °C) og tre befolknings flaskehals størrelser. Det eksperimentelle design bruges til at studere plasmid persistens under forskellige betingelser.

  1. Design af et Evolution eksperiment at følge plasmid hyppighed over tid (figur 2)
    1. Plade den konstruerede plasmid-bærende stamme (E. coli MG1655 pCon) på lb agar plader suppleret med antibiotika (kanamycin 25 μg/ml) og inkubere natten over ved 37 °c.
    2. Forbered 96 dybtliggende plader med 1 mL LB medium i hver brønd. Som de bakterielle forfædre, plukke otte tilfældige isolerede kolonier fra agar pladen i uafhængige brønde. Pladerne inkuberes ved 37 °C og 450 rpm på en plade shaker i 24 timer. Forbered en frosset glycerol bestand af de forfædres kloner.
    3. Den næste dag overfører de otte replikate populationer til nye dybtliggende plader i henhold til det eksperimentelle design (figur 2). Kulturerne fortyndes 1:100 (stor flaskehals, L), 1:1000 (medium flaskehals, M) eller 1:10000 (lille flaskehals, S) i et samlet volumen på 1 mL LB med PBS til fortynding. De fortyndede kulturer inkuberet begge ved 37 °C og 20 °C.
      Bemærk: det er meget vigtigt at kontrollere for krydskontaminering i 96-Deep-Well Plate. Brug således et skakbræt plade design ved at interkalere inokulerede brønde med bakterie frit LB-medium. Brug dette mønster gennem hele Evolution eksperiment.
    4. De kulturer, der inkuberet ved 37 °C, overføres hver 12 h, mens kulturer ved 20 °C overføres hver 24 h.
      Bemærk: under hver overførsels hændelse anvendes flaskehals størrelses behandlingen, og den serielle overførsel gentages over i alt 98 overførsler. Antallet af overførsler vil afhænge af læsernes eksperimentelle design.
    5. Forbered en frosset glycerol bestand af alle populationer regelmæssigt, 2x om ugen.
  2. Overvågning af plasmid frekvens ved replika plating (figur 3)
    Bemærk: under evolutions eksperimentet anslås hyppigheden af plasmid-bærende celler i populationen fra andelen af værter. Replikeringsprotokollen er vist i figur 3.
    1. For at bestemme plasmid-frekvensen i populationen under evolutions eksperimentet er stationære kulturer serielt fortyndet og belagt på ikke-selektive LB-agarplader. Juster fortyndingen efter et udbytte på 250-500 kolonier pr. plade.
      Bemærk: Forbered tykke LB-agarplader før plating (~ 30 mL agar).
    2. De belagte populationer inkuberet for natten vækst i henhold til deres vækst temperatur i forsøget.
      Bemærk: kolonierne skal være små, og der inkubates således < 24 timer ved 37 °C.
    3. Efter overnight vækst, tælle alle kolonier ved hjælp af en manuel eller automatiseret koloni tælle Station og beregne den samlede bakterie bestanden størrelse i kulturerne.
      Bemærk: kolonier på kanten af agarpladen bør ikke inkluderes i det totale bakterie celletal.
    4. Steriliser firkantede stykker (~ 20 x 20 cm) af bomuld fløjl ved autoklave.
      Bemærk: fløjl klud skal være 100% bomuld, der skal autoklaveres. Det er vigtigt at tørre kluden efter sterilisering.
    5. Efter sterilisering af fløjl klud, placere kluden på en rund blok og ordne det med en metalring. Det er afgørende at undgå rynker. Placer forsigtigt pladen med de dyrkede kolonier (Agar vendt nedad) på den faste fløjls klud overflade. Sørg for, at alle kolonier røre fløjl overfladen ved omhyggeligt at tappe på Petri skålen i en cirkulær måde.
    6. Tag forsigtigt LB-agar pladen af, og Anbring en selektiv plade suppleret med antibiotika (kanamycin 25 μg/mL) på fløjl kluden. Sørg for, at pladen rører alle fløjl ved omhyggeligt at tappe på Petri skålen som beskrevet før. Derefter fjernes pladen. Efterlad pladerne ved stuetemperatur for natten vækst.
    7. Næste dag evalueres både LB-agar pladen og den selektive plade. Kolonier, der vokser på de selektive medier, tælles som plasmid-værter (dvs. antibiotikaresistente), mens koloni frie pletter er kolonier, der var plasmid-frie og derfor ikke resistente over for antibiotika (dvs. mistede plasmid). Dette gøres ved at placere pladerne over hinanden og sammenligne væksten (dvs. markere eventuelle manglende kolonier) og tælle koloni nummeret på begge plader. Dette giver det antal celler, der mistede plasmid under evolutions eksperimentet.
    8. Gentag denne procedure langs hele evolutions eksperimentet på en regelmæssig måde (f. eks. hver 14 overførsler).

3. visualisering af plasmid multimere ved hjælp af gel elektroforese

Bemærk: plasmid ekstraktion af lav-kopi plasmider fører ofte til kontaminering med Host kromosomalt DNA, som skal være enzymatisk fordøjet før visualisering.

  1. Ekstrakt plasmid DNA fra en 5 mL stationær overnight cellekultur ved hjælp af alkalisk lyse som beskrevet i trin 1,5.
  2. Bagefter behandles det ekstraherede plasmid-DNA med en ATP-afhængig DNase, der kun skærer kromosomalt DNA for at fjerne kromosomal DNA-kontaminering (Se tabel over materialer). Inkuber ved 37 °C i 30 min. bagefter Rengør DNA'ET med et sæt efter eget valg.
  3. For at skabe åbne cirkel molekyler af alle plasmid konstellationer (monomerer eller multimere), Inkubér plasmid-DNA-prøverne med et nicking-enzym (NB. b) og Inkuber i 30 min ved 65 °C.
  4. Parallelt, at skabe lineære plasmid molekyler (dvs., for plasmid størrelse sammenligning), bruge et restriktionsenzym efter eget valg (f. eks HindIII), der kløver plasmid én gang.
    Bemærk: Dette resulterer i lineære DNA plasmid monomerer. Åbne cirkel molekyler migrerer ikke lineært.
  5. For at visualisere plasmid størrelse og kropsbygning, elektrophorese den spinalis og lineær plasmid DNA prøver for 120 min ved 4,3 V/cm i en 1% (w/V) agopstået gel og 1 × Tae buffer. Prøverne farves med Midori Green, og gelen visualiseres på et gelbilledbehandlings system (Se tabel over materialer). Brug en 1 KBP stige.

Representative Results

Her præsenterer vi en tilgang til at studere plasmid evolution ved at kvantificere plasmid persistens i en population. Først viser vi hvordan man opbygger plasmid transporterer E. coli stamme MG1655 pCon, der efterfølgende introduceres til et Evolution eksperiment. For det andet præsenterer vi en ligetil metode til at følge plasmid overflod i de udviklende bakterie populationer. Endelig viser vi hvordan man visualiserer plasmid molekyle størrelse og kropsbygning.

I vores tidligere arbejde8 ved hjælp af den præsenterede tilgang gennemførte vi et Evolution eksperiment efter persistens af antibiotikaresistens plasmider i E. coli i fravær af antibiotika (figur 4). Vores repræsentative resultater viser udviklingen i populationer ved 37 °C og en fortyndings hastighed på 10-4. Efter den overflod af plasmid-bærende celler observerede vi et fald i frekvensen plasmid-transporterer Host celler over tid (figur 4). Vores tilgang gjorde det muligt for os at opdage, at plasmid tab var et resultat af den kondenserede plasmid genom arkitektur, som førte til plasmid ustabilitet forårsaget af konflikter indført ved transkriptionen af modstands genet og replikation af plasmid selv. Visualisering af plasmid-molekylerne gjorde det muligt for os at opdage, at disse konflikter førte til en ustabil plasmid-konstellation (dvs. plasmid-multimdannelse, figur 5). Ikke desto mindre observerede vi plasmid stabilitet Evolution uden eksponering for antibiotika (figur 4). Den udviklede stabilitet blev tildelt af en plasmid iboende duplikering, der afskaffede transkriptionsreplikation konflikter og førte til dannelsen af stabilt nedarvede plasmider. Vores resultater viser således vigtigheden af rekombinering og genomforstærkning i adaptiv udvikling af genetiske elementer.

Figure 1
Figur 1: plasmid design af pCON. Skematisk gengivelse af klonings strategien, der anvendes til at opbygge plasmid pCON. Plasmid backbone (pBBR1) og antibiotikaresistens genet (nptII) er PCR amplificeret og fusionerede med isotermisk fusion20. Dette giver plasmid pCON og stammen MG1655 pCON. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: udformning af det langsigtede evolutions eksperiment. Skematisk gengivelse af det serielle overførsels eksperiment. De plasmid-bærende (pCON) populationer er belagt på selektive medier. Forfædres kolonier udvælges tilfældigt fra pladen og introduceres til et serielt overførselssystem. Overførslerne gennemføres med tre forskellige fortyndings metoder for at simulere befolknings flaskehalse af forskellig størrelse. Fortyndinger gentages serielt. Forsøget udføres i to temperatur regimer. Plasmid-Host frekvensen måles langs eksperimentet via replika plating. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: replika plating. Skematisk repræsentation af de trin, der anvendes i replika plating af bakterie populationer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: repræsentativ pCON-hyppighed over tid. pCON persistens er vist som andelen af værter (repræsentative replikat populationer) under Evolution eksperiment. For 98-overførsler udviklede pCON plasmid populationer under ikke-selektive forhold med en fortyndingsfaktor på 10-4. Alle replikater, der bærer plasmid pCON, faldt i populationen. Bagefter blev befolkningerne udsat for antibiotika til natten inkubation og blev dyrket igen under ikke-selektive betingelser for at teste for plasmid stabilitet Evolution. Dette tal er blevet ændret fra Wein et al.8venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: repræsentativ analyse af plasmid-konstellationen. Visualisering af modellen plasmid pCON. Visualiseret er det ubehandlede plasmid-DNA direkte efter ekstraktion, lineariseret plasmid-DNA, og behandlet med DNase, der kun skærer kromosomalt DNA samt enzymatisk spinalis DNA (dvs. Open Circle plasmid DNA). Linearizing plasmid viser, at alle plasmider er af samme størrelse. Fjernelse af kromosomal DNA og nicking pCon afslører tilstedeværelsen af dimerer og andre multimere. Dette tal er blevet ændret fra Wein et al.8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

I denne protokol præsenterer vi en tilgang, der kombinerer teknikker i molekylær biologi, eksperimentel evolution og DNA-visualisering for at undersøge rollen af plasmid Evolution for persistens af antibiotikaresistens i bakterier. Selv om den præsenterede tilgang kombinerer metoder fra forskellige forskningsområder, alle de anvendte teknikker er ligetil og kan udføres i en standard Mikrobiologi laboratorium.

De mest kritiske trin i protokollen omfatter konstruktionen af modellen system stamme, der omfatter den genetiske validering af plasmid-bærende genotype. Især, mange plasmider naturligt indkode antibiotikaresistensgener. Derfor kan læseren udelade trin 1 i protokollen og gå direkte videre med trin 2. Dernæst bør evolutions forsøgene omfatte et tilfældigt design af replikate populationer, således at resultaterne ikke er partiske ved placeringen af de replikate populationer i Deep-Well pladen. Desuden er det især vigtigt at omhyggeligt gennemføre de serielle overførsel og fortynding trin i Evolution eksperiment som forurening ville forfalske resultaterne. Endelig, replika plating skal udføres med stor omhu. Stor koloni størrelse kan være et problem, men det kan undgås ved inkubning af pladerne for mindre end 24 h. Tilsvarende, antallet af kolonier på en plade kan bias replika plating resultater. Derfor, populationer skal fortyndes før plating og replikation.

En af de største fordele ved vores tilgang er, at er let kan gengives uden behov for tungt udstyr. Desuden er en anden fordel ved replika plating at følge markørgener, at kun levende celler evalueres, i modsætning til flow flowcytometri eller qPCR, hvor døde celler kan evalueres som levende. Således, replika plating introducerer mindre bias til optælling af plasmid-bærende celler. Ikke desto mindre, en begrænsning af replika plating kan være befolkningens størrelse (dvs. celle nummer), der er muligt at evaluere i en eksperimentel kørsel.

Ved hjælp af vores tilgang, har vi for nylig vist, at plasmid stabilitet Evolution potentiates persistens af antibiotikaresistensgener i bakterier. Således udviklede vi en tilgang som et redskab til at følge plasmid-medieret resistens vedholdenhed, der er af stor betydning at følge resistens over tid, især under forhold uden tilstedeværelsen af antibiotika.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker gor Margaryan for kreativ støtte og teknisk assistance. Dette arbejde blev støttet af ZMB Young Scientist Grant 2017/2018 (tildelt TW) og DFG Focus-programmet 1819 (Grant No. DA1202/2-1 tildelt til TD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-deep-well plates Starlab
96-deep-well plates Roth EN07.1 2 ml, square
96-deep-well plates (cryo) Starlab E1702-8400 Micro-Dilution Tube System
Colony counter Stuart SC6+
Cotton velvet drapery shop 100 % cotton required
Electrophoresis chamber BioRad Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis power supply BioRad 1645070 Agarose gel electrophoresis
Electroporation cuvettes BioRad 1652089 0.1 cm
Electroporator BioRad 1652660
GeneJet Gel Extraction kit Thermo Fisher Scientific K0832 PCR fragment clean-up
GeneJet Plasmid Miniprep kit Thermo Fisher Scientific K0503 Plasmid extraction kit
Gibson Assembly New England Biolabs E2611S
Incubator Thermo Fisher Scientific 50125852
Incubator (plate shaker) Heidolph 1000
Incubator (shaker) New Brunswick Scientific Innova 44
Inoculating loops Sigma-Aldrich
Multi-channel pippetes Eppendorf 3125000052, 3125000028
Multi-channel pippetes Capp ME8-1250R
NanoDrop 2000/2000c Thermo Fisher Scientific ND2000
Oligonucleotides Eurofines
Petri dishes Sigma-Aldrich
Phusion Polymerase Thermo Fisher Scientific F533S
Pipettes Eppendorf 3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063,
PlasmidSafe enzyme Epicentre 10059400
Reaction tubes Eppendorf 30125150
Replica block & metal ring VWR 601-3401 PVC cylinder 69 mm; ring 102cm
Resctriction enzymes New England Biolabs
Thermocycler BioRad T100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. San Millan, A. Evolution of plasmid-mediated antibiotic resistance in the clinical context. Trends in Microbiology. 26, (12), 978-985 (2018).
  2. Bruto, M., James, A., et al. Vibrio crassostreae, a benign oyster colonizer turned into a pathogen after plasmid acquisition. The ISME Journal. 11, (4), 1043-1052 (2017).
  3. von Wintersdorff, C. J. H., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, (110), 305-310 (2016).
  4. Lenski, R. E. Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations. ISME Journal. 11, (10), 2181-2194 (2017).
  5. De Gelder, L., Williams, J. J., Ponciano, J. E. M., Sota, M., Top, E. M. Adaptive plasmid evolution results in host-range expansion of a broad-host-range plasmid. Genetics. 178, (4), 2179-2190 (2008).
  6. Harrison, E., Guymer, D., Spiers, A. J., Paterson, S., Brockhurst, M. A. Parallel compensatory evolution stabilizes plasmids across the parasitism-mutualism continuum. Current Biology. 25, (15), 2034-2039 (2015).
  7. Bouma, J. E., Lenski, R. E. Evolution of a bacteria/plasmid association. Nature. 335, (6188), 351-352 (1988).
  8. Wein, T., Hülter, N. F., Mizrahi, I., Dagan, T. Emergence of plasmid stability under nonselective conditions maintains antibiotic resistance. Nature Communications. 10, (1), 2595 (2019).
  9. Loftie-Eaton, W., et al. Compensatory mutations improve general permissiveness to antibiotic resistance plasmids. Nature Ecology & Evolution. 1, (9), 1354-1363 (2017).
  10. Millan, A. S., et al. Positive selection and compensatory adaptation interact to stabilize non-transmissible plasmids. Nature Communications. 5, (1), 1-11 (2014).
  11. Loftie-Eaton, W., Tucker, A., Norton, A., Top, E. M. Flow cytometry and real-time quantitative PCR as tools for assessing plasmid persistence. Applied and Environmental Microbiology. 80, (17), 5439-5446 (2014).
  12. Münch, K. M., et al. Polar fixation of plasmids during recombinant protein production in Bacillus megaterium results in population heterogeneity. Applied and Environmental Microbiology. 81, (17), 5976-5986 (2015).
  13. Jahn, M., Vorpahl, C., Hübschmann, T., Harms, H., Müller, S. Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR. Microbial Cell Factories. 15, (1), 211 (2016).
  14. Lederberg, J., Lederberg, M. E. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. Journal of Bacteriology. 63, 399-406 (1952).
  15. Summers, D. K., Sherratt, D. J. Multimerization of high copy number plasmids causes instability: ColE1 encodes a determinant essential for plasmid monomerization and stability. Cell. 36, (4), 1097-1103 (1984).
  16. Summers, D. K., Beton, C. W., Withers, H. L. Multicopy plasmid instability: the dimer catastrophe hypothesis. Molecular Microbiology. 8, (6), 1031-1038 (1993).
  17. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166, (4), 557-580 (1983).
  18. Ilhan, J., et al. Segregational drift and the interplay between plasmid copy number and evolvability. Molecular Biology and Evolution. 36, (3), 472-486 (2019).
  19. Beck, E., Ludwig, G., Auerswald, E. A., Reiss, B., Schaller, H. Nucleotide sequence and exact localization of the neomycin phosphotransferase gene from transposon Tn5. Gene. 19, (3), 327-336 (1982).
  20. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, (5), 343-345 (2009).
Kvantificering af plasmid-medieret antibiotikaresistens i en eksperimentel Evolution-tilgang
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wein, T., Stücker, F. T., Hülter, N. F., Dagan, T. Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach. J. Vis. Exp. (154), e60749, doi:10.3791/60749 (2019).More

Wein, T., Stücker, F. T., Hülter, N. F., Dagan, T. Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach. J. Vis. Exp. (154), e60749, doi:10.3791/60749 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter