Onze experimentele aanpak biedt een strategie om plasmide overvloed en antibioticaresistentie na verloop van tijd te volgen in bacteriële populaties.
Plasmiden spelen een belangrijke rol in microbiële ecologie en evolutie als voertuigen van laterale genoverdracht en reservoirs van accessoire-genfuncties in microbiële populaties. Dit is met name het geval bij snel veranderende omgevingen zoals fluctuerende antibiotica blootstelling. We hebben onlangs laten zien dat plasmiden de genen van antibioticaresistentie in Escherichia coli behouden zonder positieve selectie voor de plasmide aanwezigheid. Hier beschrijven we een experimenteel systeem dat het mogelijk maakt om zowel het plasmide genotype als het fenotype te volgen in lange termijn evolutie experimenten. We gebruiken moleculaire technieken om een model plasmide te ontwerpen die vervolgens wordt geïntroduceerd in een experimentele evolution batch-systeem benadering in een E. coli -host. We volgen de plasmide frequentie na verloop van tijd door het toepassen van replica plating van de E. coli populaties tijdens het kwantificeren van de antibioticaresistentie persistentie. Daarnaast monitoren we de conformatie van plasmiden in gastheer cellen door het analyseren van de omvang van plasmide multimer vorming door plasmide picknicken en agarose gel elektroforese. Een dergelijke aanpak stelt ons in staat om niet alleen de genoom grootte van veranderende plasmiden te visualiseren, maar ook hun topologische conformatie-een factor die zeer belangrijk is voor plasmide overname. Ons systeem combineert moleculaire strategieën met traditionele microbiologie benaderingen en biedt een set-up om plasmiden in bacteriële populaties gedurende een lange tijd te volgen. De gepresenteerde aanpak kan worden toegepast om in de toekomst een breed scala aan mobiele genetische elementen te bestuderen.
Plasmiden zijn circulaire, zelfreplicerende genetische elementen die alomtegenwoordig zijn in prokaryoten. Ze zijn agenten van laterale genoverdracht, omdat ze eigenschappen kunnen overdragen tussen microbiële populaties, en dus worden beschouwd als een belangrijke rol in de microbiële evolutie. Plasmiden zijn bestuurders van snelle aanpassing aan groeibeperkende voorwaarden gedurende korte tijd (bijvoorbeeld in aanwezigheid van antibiotica of pesticiden1) en zijn verantwoordelijk voor de lange termijn overgang naar andere lifestyle-modi (bijv. het ontstaan van pathogeniteit2). De meest opvallende voorbeelden voor de impact van plasmiden op overdracht van genen worden gedocumenteerd in ecosystemen die blootgesteld zijn aan fluctuerende niveaus van antibiotica, zoals medische klinieken of in industriële boerderijen3. Als gevolg van sterke positieve selectie, veel plasmiden coderen voor antimicrobiële resistentiegenen en worden vaak gevonden om te verlenen van multiresistance aan hun bacteriële gastheer. Plasmiden maken migratie mogelijk tussen populaties of bacteriesoorten, wat resulteert in een snelle vermeerdering van meervoudige antimicrobiële resistentie. Onder niet-selectieve omstandigheden zijn plasmiden niet essentieel voor de cel en worden ze vaak zelfs parasitaire elementen genoemd. Niettemin, plasmiden zijn alomtegenwoordig in de natuur en hun evolutie is zeer verweven met die van bacteriële chromosomen. Plasmide persistentie in natuurlijke omgevingen (fluctuerend en niet-selectief) blijft slecht begrepen, maar het is van groot belang voor ons begrip van de persistentie van antibioticaresistentiegenen in de natuur.
Experimentele evolutie is een krachtig hulpmiddel voor de studie van microbiële populaties4. Experimentele evolutie toonde aan dat het opleggen van een sterke selectie voor plasmide onderhoud leidt tot compenserende (d.w.z. adaptieve) evolutie van het plasmide of gastheer-chromosoom die de kosten van plasmide fitness vermindert en, op zijn beurt, plasmide overvloed vergemakkelijkt (d.w.z. plasmide persistentie)5,6,7. Dus, na de plasmide-host interactie na verloop van tijd kan belangrijke mechanismen van de aanpassing van beide elementen te onthullen. Bovendien, experimentele evolutie maakt het mogelijk om te kwantificeren de overvloed van plasmide dragende cellen in de tijd onder verschillende omstandigheden8,9,10.
Plasmide persistentie in evolutie experimenten kan worden bewaakt door verschillende strategieën, waaronder Flowcytometrie door fluorescerende geactiveerde celsortering (FACS)11, kwantitatieve PCR (qPCR)11, of in teelt-gebaseerde methoden. Flow cytometrie vereist een FACS machine en de introductie van een detecteerbaar (fluorescerende) marker gen, zoals het groene fluorescerende eiwit (GFP), op het plasmide. Echter, GFP expressie kan verschillende cellulaire eigenschappen veranderen en verder beïnvloeden de plasmide locatie in de cel12, die op zijn beurt kan invloed hebben op plasmide erfenis tijdens celdeling. Een qPCR-benadering voor het meten van plasmide overvloed kan zeer bevooroordeeld zijn door het plasmide kopie nummer, die sterk kan variëren langs bacteriële groeifase en na verloop van tijd13. Tot slot vereist een benadering op basis van cultuur en plating de introductie van een selecteerbaar marker gen. Dit kan een antibiotica-resistentie-gen zijn, dat vaak wordt gecodeerd op natuurlijke plasmiden; Er is dus geen genetische manipulatie nodig. Antibioticaresistentie kan worden gevolgd door een traditionele replica plating aanpak. Dus, om te studeren natuurlijke plasmide dynamiek, replica plating is zeer geschikt voor het bewaken van plasmide gecodeerde antibiotica resisitance14.
Om plasmide moleculen te visualiseren (bijv. om de plasmide grootte te evalueren) kunnen verschillende methoden worden toegepast. Hele plasmiden kunnen worden versterkt met behulp van een PCR-gebaseerde benadering. Dit vereist echter het ontwerp van specifieke primers, die een uitdaging kunnen zijn tijdens een evolutie-experiment, omdat de plasmide sequentie na verloop van tijd kan veranderen. Bovendien is het moeilijk om plasmide multimers te versterken in een PCR-gebaseerde benadering door meerdere bindingsplaatsen voor de PCR-primers. Multimere plasmide moleculen kunnen verschijnen na plasmide replicatie beëindiging of door recombinatie van plasmide moleculen en zijn meestal georiënteerd kop-tot-staart15. Een andere benadering van plasmide visualisatie combineert enzymatische vertering van plasmide moleculen door DNA-enzym die ofwel klieven of Nick een plasmide DNA-streng met agarose gel elektroforese analyse. Hetzelfde plasmide van verschillende groottes (bijv. monomeren versus multimers) resulteert in verschillende gelmobiliteiten die kunnen worden waargenomen bij het visualiseren van de plasmide moleculen. Deze aanpak maakt visualisatie en kwantificering van verschillende plasmide conformaties (d.w.z. multimerization toestanden) mogelijk. De plasmide conformatie kan worden gebruikt als indicator van plasmide stabiliteit, omdat plasmide multimers vaak verloren gaan tijdens Cell Division16.
In een recent werk volgden we plasmide persistentie in omstandigheden die niet selectief waren voor plasmide overvloed (d.w.z. zonder antibiotica selectie). We vergeleek plasmide persistentie bij twee verschillende temperaturen (20 °C en 37 °C) en drie bevolkings grootten (d.w.z. verdunnings percentages). Door verschillende verdunnings percentages of bevolkings knelpunten toe te passen kan het onderzoek naar de invloed van de bevolkingsomvang op de bacteriële en plasmide evolutie worden onderzocht. Op basis van onze resultaten stellen we voor dat plasmiden neutraal kunnen zijn voor hun bacteriële gastheer en de stabiliteit kunnen evolueren zonder enige selectiedruk8. De geëvolueerde plasmide stabiliteit wordt verleend door de reductie van de plasmide multimer formatie8.
Hier presenteren we een protocol voor de kwantificering van plasmide persistentie en onderzoek naar plasmide evolutie met betrekking tot het behoud van antibioticaresistentiegenen. De methode heeft verschillende stappen, met inbegrip van het inbrengen van een antibioticumresistentie gen aan een model plasmide (die kan worden weggelaten bij gebruik van een natuurlijke resistentie plasmide), gevolgd door het gebruik van experimentele evolutie om te beoordelen van het potentieel van het plasmide te behouden onder niet-selectieve omstandigheden tijdens het bepalen van de plasmide frequentie dynamiek in de tijd met behulp van replica plating, en de analyse van het plasmide genoom door visualisatie. Het hier beschreven protocol is ontworpen om de evolutie en persistentie van plasmiden te onderzoeken, maar het kan ook worden toegepast om de evolutie van de chromosoom resistentiegenen (of andere marker genen) na verloop van tijd te volgen.
In dit protocol presenteren we een aanpak die technieken in moleculaire biologie, experimentele evolutie en DNA-visualisatie combineert om de rol van plasmide evolutie voor de persistentie van antibioticaresistentie bij bacteriën te onderzoeken. Hoewel de gepresenteerde aanpak methoden van verschillende onderzoeksgebieden combineert, zijn alle toegepaste technieken eenvoudig en kunnen worden uitgevoerd in een standaard laboratorium voor microbiologie.
De meest kritische stappen in het protocol omvatten de constructie van de modelsysteem stam die de genetische validering van het plasmide dragende genotype omvat. In het bijzonder coderen veel plasmiden natuurlijk antibioticaresistentiegenen. De lezer kan dus stap 1 van het protocol weglaten en direct doorgaan met stap 2. Vervolgens moeten de evolutie experimenten een willekeurig ontwerp van replicaatpopulaties bevatten, zodat de resultaten niet bevooroordeeld zijn door de positie van de replicaatpopulaties in de diepe-put-plaat. Daarnaast is het vooral belangrijk om de seriële Transfer-en verdunnings stappen in het Evolution-experiment zorgvuldig uit te voeren, omdat besmetting de resultaten zou vervalsen. Ten slotte, replica plating moet worden uitgevoerd met grote zorgvuldigheid. Grote kolonie grootte kan een probleem zijn, maar het kan worden vermeden door het inbroed van de platen voor minder dan 24 h. Evenzo, het aantal kolonies op een plaat kan bias replica plating resultaten. Daarom moeten populaties worden verdund voorafgaand aan het plating en replicatie.
Een van de grootste voordelen van onze aanpak is dat deze eenvoudig kan worden gereproduceerd zonder de noodzaak van zware apparatuur. Bovendien, een ander voordeel van replica plating te volgen marker genen is dat alleen levende cellen worden geëvalueerd, in tegenstelling tot flow flowcytometrieonderzoeken of qPCR waarin dode cellen kunnen worden geëvalueerd als levend. Dus, replica plating introduceert minder bias voor het tellen van plasmide dragende cellen. Niettemin, een beperking van de replica plating kan de grootte van de bevolking (dat wil zeggen, Cell Number) dat is mogelijk om te evalueren in een experimentele run.
Met behulp van onze aanpak hebben we onlangs laten zien dat plasmide stabiliteits evolutie de persistentie van antibioticaresistentiegenen in bacteriën potentieert. Zo ontwikkelden we een aanpak als een instrument om plasmide gemedieerde resistentie persistentie te volgen, die van groot belang is om resistentie na verloop van tijd te volgen, vooral onder omstandigheden zonder de aanwezigheid van antibiotica.
The authors have nothing to disclose.
We danken Gor Margaryan voor creatieve ondersteuning en technische assistentie. Dit werk werd gesteund door de ZMB Young Scientist Grant 2017/2018 (toegekend aan TW) en het DFG focus programma 1819 (Grant No. DA1202/2-1 toegekend aan TD).
96-deep-well plates | Starlab | ||
96-deep-well plates | Roth | EN07.1 | 2 ml, square |
96-deep-well plates (cryo) | Starlab | E1702-8400 | Micro-Dilution Tube System |
Colony counter | Stuart | SC6+ | |
Cotton velvet | drapery shop | 100 % cotton required | |
Electrophoresis chamber | BioRad | Agarose gel electrophoresis | |
Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
Electroporation cuvettes | BioRad | 1652089 | 0.1 cm |
Electroporator | BioRad | 1652660 | |
GeneJet Gel Extraction kit | Thermo Fisher Scientific | K0832 | PCR fragment clean-up |
GeneJet Plasmid Miniprep kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Plasmid extraction kit |
Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50125852 | |
Incubator (plate shaker) | Heidolph | 1000 | |
Incubator (shaker) | New Brunswick Scientific | Innova 44 | |
Inoculating loops | Sigma-Aldrich | ||
Multi-channel pippetes | Eppendorf | 3125000052, 3125000028 | |
Multi-channel pippetes | Capp | ME8-1250R | |
NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND2000 | |
Oligonucleotides | Eurofines | ||
Petri dishes | Sigma-Aldrich | ||
Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
Pipettes | Eppendorf | 3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063, | |
PlasmidSafe enzyme | Epicentre | 10059400 | |
Reaction tubes | Eppendorf | 30125150 | |
Replica block & metal ring | VWR | 601-3401 | PVC cylinder 69 mm; ring 102cm |
Resctriction enzymes | New England Biolabs | ||
Thermocycler | BioRad | T100 |