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Genetics

एक प्रायोगिक विकास दृष्टिकोण में प्लाज्मिड-मध्यस्थता एंटीबायोटिक प्रतिरोध का परिमाणीकरण

doi: 10.3791/60749 Published: December 14, 2019
* These authors contributed equally

Summary

हमारा प्रायोगिक दृष्टिकोण बैक्टीरियल आबादी में समय के साथ प्लाज्मिड बहुतायत और एंटीबायोटिक प्रतिरोध का पालन करने की रणनीति प्रदान करता है।

Abstract

प्लाज्मिड्स माइक्रोबियल पारिस्थितिकी और विकास में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं क्योंकि पार्श्व जीन हस्तांतरण और माइक्रोबियल आबादी में सहायक जीन कार्यों के जलाशयों के वाहन। यह विशेष रूप से तेजी से बदलते वातावरण के तहत मामला है जैसे कि एंटीबायोटिक दवाओं के जोखिम में उतार-चढ़ाव । हमने हाल ही में दिखाया कि प्लाज्मिड उपस्थिति के लिए सकारात्मक चयन के बिना एस्चेरिचिया कोलाई में एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन बनाए रखते हैं। यहां हम एक प्रायोगिक प्रणाली का वर्णन करते हैं जो दीर्घकालिक विकास प्रयोगों में प्लाज्मिड जीनोटाइप और फेनोटाइप दोनों का पालन करने की अनुमति देता है। हम आणविक तकनीकों का उपयोग एक मॉडल प्लाज्मिड डिजाइन करने के लिए करते हैं जिसे बाद में ई. कोलाई होस्ट में एक प्रयोगात्मक विकास बैच सिस्टम दृष्टिकोण से पेश किया जाता है। हम समय के साथ प्लाज्मिड आवृत्ति का पालन करें ई. कोलाई आबादी की प्रतिकृति चढ़ाना लागू करने के द्वारा, जबकि एंटीबायोटिक प्रतिरोध हठ मात्रा । इसके अलावा, हम प्लाज्मिड निकिंग और अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा प्लाज्मिड मल्टीमर गठन की सीमा का विश्लेषण करके मेजबान कोशिकाओं में प्लाज्मिड की संरचना की निगरानी करते हैं। इस तरह के एक दृष्टिकोण हमें न केवल विकसित प्लाज्मिड के जीनोम आकार की कल्पना करने की अनुमति देता है, लेकिन यह भी उनके स्थलोलॉजिकल संरचना-प्लाज्मिड विरासत के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण कारक । हमारी प्रणाली पारंपरिक माइक्रोबायोलॉजी दृष्टिकोण के साथ आणविक रणनीतियों को जोड़ती है और लंबे समय से बैक्टीरियल आबादी में प्लाज्मिड का पालन करने के लिए एक सेट-अप प्रदान करती है। प्रस्तुत दृष्टिकोण भविष्य में मोबाइल आनुवंशिक तत्वों की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

प्लाज्मिड गोलाकार होते हैं, जो स्वयं को दोहराने वाले आनुवंशिक तत्व होते हैं जो प्रोकैरियोट्स में सर्वव्यापी होते हैं। वे पार्श्व जीन हस्तांतरण के एजेंट हैं, क्योंकि वे माइक्रोबियल आबादी के बीच लक्षण स्थानांतरित कर सकते हैं, और इस प्रकार माइक्रोबियल विकास में एक प्रमुख भूमिका निभाने के लिए माना जाता है । प्लाज्मिड कम समय में विकास-सीमित स्थितियों के लिए तेजी से अनुकूलन के चालक हैं (उदाहरण के लिए, एंटीबायोटिक दवाओं या कीटनाशकों की उपस्थिति में1)और अन्य जीवनशैली मोड में दीर्घकालिक संक्रमण के लिए जिम्मेदार हैं (उदाहरण के लिए, रोगजनकता2का उद्भव)। जीन के हस्तांतरण पर प्लाज्मिड के प्रभाव के लिए सबसे उल्लेखनीय उदाहरण एंटीबायोटिक दवाओं के उतार-चढ़ाव वाले स्तरों के संपर्क में आने वाले पारिस्थितिकी प्रणालियों में प्रलेखित किए जाते हैं, जैसे चिकित्सा क्लीनिक या औद्योगिक खेतों में3। मजबूत सकारात्मक चयन के कारण, कई प्लाज्मिड एंटीमाइक्रोबियल प्रतिरोध जीन के लिए एन्कोड करते हैं और अक्सर अपने बैक्टीरियल होस्ट को बहुप्रतिरोधक प्रदान करने के लिए पाए जाते हैं। प्लाज्मिड आबादी या बैक्टीरियल प्रजातियों के बीच प्रवास को सक्षम करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप कई रोगाणुरोधी प्रतिरोध का तेजी से प्रचार होता है। अचयनात्मक परिस्थितियों में प्लाज्मिड सेल के लिए आवश्यक नहीं हैं और अक्सर परजीवी तत्वों के रूप में भी जाना जाता है। फिर भी, प्लाज्मिड प्रकृति में सर्वव्यापी हैं और उनका विकास बैक्टीरियल गुणसूत्रों के साथ अत्यधिक जुड़ा हुआ है। प्राकृतिक वातावरण में प्लाज्मिड हठ (उतार-चढ़ाव और गैर-चयनात्मक) खराब समझ में आता है, फिर भी प्रकृति में एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के हठ के बारे में हमारी समझ के लिए यह उच्च महत्व का है।

प्रायोगिक विकास माइक्रोबियल आबादी4के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । प्रायोगिक विकास ने दिखादिया कि प्लाज्मिड रखरखाव के लिए मजबूत चयन लगाने से प्लाज्मिड या होस्ट गुणसूत्र का प्रतिपूरक (यानी अनुकूली) विकास होता है जो प्लाज्मिड फिटनेस लागत को कम करता है और बदले में, प्लाज्मिड बहुतायत (यानी प्लाज्मिड हठ)5,6,7की सुविधा प्रदान करता है। इस प्रकार, समय के साथ प्लाज्मिड-होस्ट इंटरैक्शन के बाद दोनों तत्वों के अनुकूलन के महत्वपूर्ण तंत्र प्रकट हो सकते हैं। इसके अलावा, प्रायोगिक विकास8,9,10विभिन्न परिस्थितियों में समय के साथ प्लाज्मिड-ले जाने वाली कोशिकाओं की बहुतायत को निर्धारित करने में सक्षम बनाता है।

विकास प्रयोगों में प्लाज्मिड हठ फ्लोरोसेंट एक्टिवेटेड सेल छंटाई (एफएसीएस)11,मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर)11,या खेती आधारित तरीकों में प्रवाह साइटोमेट्री सहित कई रणनीतियों द्वारा निगरानी की जा सकती है। फ्लो साइटोमेट्री को प्लाज्मिड पर एक एफएसीएस मशीन और एक डिटेक्टेबल (फ्लोरोसेंट) मार्कर जीन की शुरुआत की आवश्यकता होती है, जैसे कि ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी), प्लाज्मिड पर। हालांकि, जीएफपी अभिव्यक्ति कई सेलुलर गुणों को बदल सकती है और इसके अलावा सेल12में प्लाज्मिड स्थान को प्रभावित कर सकती है, जो बदले में सेल डिवीजन के दौरान प्लाज्मिड विरासत को प्रभावित कर सकती है। प्लाज्मिड बहुतायत को मापने के लिए एक क्यूपीसीआर दृष्टिकोण प्लाज्मिड कॉपी संख्या से अत्यधिक पक्षपाती हो सकता है, जो बैक्टीरियल विकास चरण औरसमय 13के साथ बहुत भिन्न हो सकता है। अंत में, एक संस्कृति आधारित और चढ़ाना दृष्टिकोण एक चयन मार्कर जीन की शुरूआत की आवश्यकता है । यह एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन हो सकता है, जिसे अक्सर प्राकृतिक प्लाज्मिड पर एन्कोड किया जाता है; इस प्रकार, कोई आनुवंशिक हेरफेर आवश्यक नहीं है। एंटीबायोटिक प्रतिरोध एक पारंपरिक प्रतिकृति चढ़ाना दृष्टिकोण के बाद किया जा सकता है । इस प्रकार, प्राकृतिक प्लाज्मिड गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए, प्रतिकृति चढ़ाना प्लाज्मिड-एन्कोडेड एंटीबायोटिक रिसिजिटेंस14की निगरानी के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।

प्लाज्मिड अणुओं की कल्पना करने के लिए (उदाहरण के लिए, प्लाज्मिड आकार का मूल्यांकन करने के लिए) कई विधियां लागू की जा सकती हैं। पीसीआर-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करके पूरे प्लाज्मिड को परिलक्षित किया जा सकता है। हालांकि, इसके लिए विशिष्ट प्राइमर के डिजाइन की आवश्यकता होती है, जो विकास प्रयोग के दौरान चुनौतीपूर्ण हो सकता है, क्योंकि प्लाज्मिड अनुक्रम समय के साथ बदल सकता है। इसके अलावा, पीसीआर प्राइमर के लिए कई बाध्यकारी साइटों के कारण पीसीआर आधारित दृष्टिकोण में प्लाज्मिड मल्टीमर्स को बढ़ाना मुश्किल है। बहुमेरिक प्लाज्मिड अणु प्लाज्मिड प्रतिकृति समाप्ति के बाद या प्लाज्मिड अणुओं के पुनर्संयोजन के माध्यम से दिखाई दे सकते हैं और ज्यादातर सिर से पूंछ15उन्मुख होते हैं। प्लाज्मिड विज़ुअलाइज़ेशन का एक और दृष्टिकोण डीएनए एंनोन्यूकलीज द्वारा प्लाज्मिड अणुओं के एंजाइमैटिक पाचन को जोड़ती है जो या तो क्लीव या निक एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस विश्लेषण के साथ एक प्लाज्मिड डीएनए स्ट्रैंड को निक करता है। विभिन्न आकारों (जैसे, मोनोमर बनाम मल्टीमर) का एक ही प्लाज्मिड विभिन्न जेल गतिशीलता में परिणाम देता है जिसे प्लाज्मिड अणुओं की कल्पना करते समय देखा जा सकता है। यह दृष्टिकोण विभिन्न प्लाज्मिड संरचनाओं (यानी मल्टीमराइजेशन राज्यों) के दृश्य और मात्राकरण को सक्षम बनाता है। प्लाज्मिड संरचना को प्लाज्मिड स्थिरता के संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि सेल डिवीजन16के दौरान प्लाज्मिड मल्टीमर अक्सर खो जाते हैं।

हाल ही में एक काम में, हम शर्तों में प्लाज्मिड हठ का पालन किया है कि प्लाज्मिड बहुतायत के लिए चयनात्मक नहीं थे (यानी, एंटीबायोटिक चयन के बिना) । हमने प्लाज्मिड हठ की तुलना दो अलग-अलग तापमान (20 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस) और तीन जनसंख्या आकार (यानी कमजोर पड़ने की दर) पर की। विभिन्न कमजोर पड़ने की दरों, या जनसंख्या बाधाओं को लागू करना, बैक्टीरियल और प्लाज्मिड विकास पर जनसंख्या आकार के प्रभाव की जांच के लिए अनुमति देता है। हमारे परिणामों के आधार पर, हम प्रस्ताव है कि प्लाज्मिड ्स अपने जीवाणु मेजबान के लिए तटस्थ हो सकता है और किसी भी चयन दबाव8के बिना स्थिरता विकसित कर सकते हैं । विकसित प्लाज्मिड स्थिरता प्लाज्मिड मल्टीमर गठन8की कमी से प्रदान की जाती है ।

यहां, हम एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के रखरखाव के संबंध में प्लाज्मिड हठ और प्लाज्मिड विकास की जांच की मात्रा के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । विधि में कई कदम हैं, जिनमें एक मॉडल प्लाज्मिड के लिए एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन का सम्मिलन शामिल है (जिसे प्राकृतिक प्रतिरोध प्लाज्मिड का उपयोग करते समय छोड़ा जा सकता है), इसके बाद प्लाज्मिड की क्षमता का आकलन करने के लिए प्रायोगिक विकास का उपयोग जारी रहता है प्रतिकृति चढ़ाना का उपयोग करके समय के साथ प्लाज्मिड आवृत्ति गतिशीलता का निर्धारण करते समय गैर-चयनात्मक परिस्थितियों में, और दृश्य द्वारा प्लाज्मिड जीनोम का विश्लेषण। यहां वर्णित प्रोटोकॉल को प्लाज्मिड्स के विकास और दृढ़ता की जांच करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, लेकिन इसे समय के साथ गुणसूत्र प्रतिरोध जीन (या अन्य मार्कर जीन) के विकास का पालन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है।

Protocol

1. एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन ले जाने वाले मॉडल प्लाज्मिड का निर्माण

नोट: तनाव Escherichia कोलाई K-12 MG1655 सभी प्रयोगों में मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया गया था (DSM नंबर 18039, सूक्ष्मजीवों और सेल संस्कृतियों, DSMZ के जर्मन संग्रह) । तनाव ई. कोलाई DH5α17 प्लाज्मिड निर्माण के दौरान इस्तेमाल किया गया था ।

  1. पीसीआर आपकी पसंद की प्लाज्मिड रीढ़ को बढ़ाती है और पीसीआर(चित्रा 1)द्वारा प्रमोटर क्षेत्र सहित प्रतिरोध जीन को बढ़ाती है।
    1. पीसीआर प्लाज्मिड टेम्पलेट पीएलएसी (जेनबैंक एसीसी नंबर) पर उच्च निष्ठा बहुलक और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स pBBR1_for (5'-जीसीजीजीसीजीसीजीसीटी-3') और pBBR1_rev (5'-TACCGGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCCCCC-3') का उपयोग करके प्लाज्मिड रीढ़ को बढ़ाती है। MH238456)18
    2. पीसीआर ने एक उच्च निष्ठा बहुलक और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स nptII_gib_for (5'-जीसीजीसीजीसीजीजीगागटसीटीसीटीसीटीसीटीसीटीजीटीजीजीजीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीसीए-3') और nptII_gib_rev (5'-सीजीजीजीजीसीसीएएएजीजीजीजीजीकैगकैगकैगजीएजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीएसीटीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजी एनपीटीआई जीन नियोमाइसिन फॉस्फोट्रांसफराज़ के लिए एन्कोड करता है और कानामाइसिन के प्रतिरोध को प्रदान करता है।
      नोट: प्लाज्मिड रीढ़ की हड्डी है कि यह करने के लिए जुड़े किया जाएगा करने के लिए पूरक अनुक्रम के लगभग 20 बीपी के साथ प्रतिरोध जीन के लिए प्राइमर डिजाइन ।
  2. अपनी पसंद की किट का उपयोग करके पीसीआर के दोनों टुकड़ों को साफ करें।
  3. शुद्ध प्लाज्मिड रीढ़ की हड्डी के लिए शुद्ध एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन पीसीआर उत्पाद (इसके प्रमोटर क्षेत्र सहित) में शामिल हों और 60 मिन के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर आइसोथर्मल असेंबली20का उपयोग करके समरूप क्षेत्रों को फ्यूज करें।
  4. तनाव ई. कोलाई DH5α में जुड़े उत्पाद इलेक्ट्रोपोरेट।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस और 2.5 केवी पर 2 मिमी क्यूवेट में इलेक्ट्रोसक्षम कोशिकाओं के 40 माइक्रोन में चरण 1.3 से उत्पाद के 2 माइक्रोन पेश करें। लिसोजेनी शोरबा (एलबी) माध्यम के 1 mL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    2. प्लाज्मिड पर प्रतिरोध मार्कर की अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देने के लिए एक कक्षीय शेखर में 250 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक माइक्रोफ्यूज ट्यूब और इनक्यूबेट 1 एच में कुल मात्रा स्थानांतरित करें।
    3. एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के लिए चयन करने के लिए उपयुक्त एंटीबायोटिक (kanamycin 25 μg/mL) युक्त पौंड आगर प्लेटों पर कोशिकाओं की प्लेट 100 μL और इस प्रकार प्लाज्मिड ले जाने वाली कोशिकाओं के लिए चयन करें । बाकी नीचे स्पिन, अतिशयोक्ति को दूर करने, १०० μL पौंड और एक चयनात्मक आगर प्लेट पर थाली में कोशिकाओं को फिर से निलंबित । प्लेटों को 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. क्लोन सत्यापित करने के लिए, एक वाणिज्यिक मिनी-प्रेप किट का उपयोग करके क्षारीय लिसिस के माध्यम से निर्मित प्लाज्मिड निकालें।
    1. कमरे के तापमान पर 12,000 x ग्राम पर अपकेंद्री रातोंरात संस्कृति की फसल 5 मिलीग्राम। पुनर्सस्पेंशन समाधान में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, फिर सेल समाधान को लायसे और बेअसर करें। 12,000 x ग्रामपर 5 मिन के लिए सेंट्रलाइज।
    2. किट में प्रदान किए गए डीएनए बाध्यकारी कॉलम में अधिष्ठाता को स्थानांतरित करें और कॉलम झिल्ली को ल्यूटियन बफर के साथ पतला करने से पहले कॉलम को 2x को केंद्रित करने से पहले कॉलम को दो बार 500 माइक्रोन वाशिंग सॉल्यूशन सेंट्रलाइज िंग के साथ धोएं।
    3. अनुक्रम सही है कि पुष्टि करने के लिए प्लाज्मिड के Sequencing प्रदर्शन करते हैं।
  6. एक बार प्लाज्मिड वैधता सत्यापित हो जाने के बाद, प्लाज्मिड (अब pCON) को स्ट्रेन ई. कोलाई MG1655 में इलेक्ट्रोपोरेट करें जैसा कि ऊपर वर्णित है। इससे पैदावार ई कोलाई एमजी1655 पीसीकॉन को तनाव देती है।

2. समय के साथ विभिन्न परिस्थितियों में प्लाज्मिड ले जाने वाले बैक्टीरिया की निगरानी

नोट: विकास प्रयोग दो तापमान (37 डिग्री सेल्सियस और 20 डिग्री सेल्सियस) और तीन जनसंख्या बाधा आकार में गैर-चयनात्मक परिस्थितियों (एलबी मीडिया) के तहत प्लाज्मिड-ले जाने वाले उपभेदों के साथ आयोजित किया जाता है। प्रायोगिक डिजाइन का उपयोग विभिन्न परिस्थितियों में प्लाज्मिड हठ का अध्ययन करने के लिए किया जाता है।

  1. समय के साथ प्लाज्मिड आवृत्ति का पालन करने के लिए एक विकास प्रयोग का डिजाइन(चित्रा 2)
    1. प्लेट पौंड आगर प्लेटों पर निर्मित प्लाज्मिड-ले जाने वाले तनाव(ई कोलाई एमजी1655 पीसीओन) एंटीबायोटिक दवाओं (कनामाइसिन 25 μg/mL) के साथ पूरक है और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
    2. प्रत्येक कुएं में एलबी माध्यम के 1 mL के साथ 96 गहरी अच्छी प्लेटें तैयार करें। जीवाणु पूर्वजों के रूप में, स्वतंत्र कुओं में आगर प्लेट से आठ यादृच्छिक अलग कालोनियों उठाओ । 24 घंटे के लिए प्लेट शेकर पर 37 डिग्री सेल्सियस और 450 आरपीएम पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
    3. अगले दिन प्रायोगिक डिजाइन(चित्रा 2)के अनुसार आठ प्रतिकृति आबादी को नई गहरी अच्छी तरह से प्लेटों में स्थानांतरित करते हैं। संस्कृतियों को कमजोर पड़ने के लिए पीबीएस का उपयोग करके 1-100 (बड़ी अड़चन, एल), 1:1,000 (मध्यम अड़चन, एम), या 1:10,000 (छोटी अड़चन, एस) को पतला किया जाता है। पतला संस्कृतियों दोनों 37 डिग्री सेल्सियस और 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड हैं।
      नोट: 96-डीप-वेल प्लेट में क्रॉस-संदूषण के लिए नियंत्रण करना बेहद महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, बैक्टीरिया मुक्त एलबी माध्यम के साथ टीका कुओं को इंटरकलिंग करके चेकरबोर्ड प्लेट डिजाइन का उपयोग करें। पूरे विकास प्रयोग के माध्यम से इस पैटर्न का प्रयोग करें।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड संस्कृतियों को हर 12 घंटे में स्थानांतरित किया जाता है जबकि 20 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों को हर 24 घंटे में स्थानांतरित किया जाता है।
      नोट: हर हस्तांतरण घटना के दौरान अड़चन आकार उपचार लागू किया जाता है और धारावाहिक हस्तांतरण कुल 98 स्थानान्तरण पर दोहराया जाता है। तबादलों की संख्या पाठकों के प्रायोगिक डिजाइन पर निर्भर करेगी ।
    5. नियमित रूप से सभी आबादी का एक जमे हुए ग्लाइसेरोल स्टॉक तैयार करें, सप्ताह में 2x।
  2. प्रतिकृति चढ़ाना द्वारा प्लाज्मिड आवृत्ति की निगरानी(चित्रा 3)
    नोट: विकास प्रयोग के दौरान, आबादी में प्लाज्मिड ले जाने वाली कोशिकाओं की आवृत्ति मेजबानों के अनुपात से अनुमानित है। प्रतिकृति चढ़ाना प्रोटोकॉल चित्र 3में दिखाया गया है ।
    1. विकास प्रयोग के दौरान आबादी में प्लाज्मिड आवृत्ति निर्धारित करने के लिए, स्थिर संस्कृतियों को क्रमिक रूप से पतला और गैर-चयनात्मक एलबी आगर प्लेटों पर चढ़ाया जाता है। प्रति प्लेट 250-500 कॉलोनियों की उपज के अनुसार कमजोर पड़ने को समायोजित करें।
      नोट: चढ़ाना (~ 30 mL आगर) से पहले मोटी पौंड आगर प्लेटें तैयार करें ।
    2. चढ़ाया आबादी प्रयोग में उनके विकास के तापमान के अनुसार रात भर के विकास के लिए इनक्यूबेटेड हैं ।
      नोट: कालोनियों को छोटा होने की जरूरत है, इस प्रकार 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट और एलटी; 24 एच।
    3. रातोंरात विकास के बाद, मैनुअल या स्वचालित कॉलोनी गिनती स्टेशन का उपयोग करके सभी उपनिवेशों को गिनें और संस्कृतियों में कुल बैक्टीरियल जनसंख्या आकार की गणना करें।
      नोट: आगर प्लेट के किनारे पर कालोनियों को कुल बैक्टीरियल सेल गिनती में शामिल नहीं किया जाना चाहिए।
    4. ऑटोक्लेविंग द्वारा कपास मखमल के वर्ग टुकड़ों (~ 20 x 20 सेमी) को स्टरलाइज करें।
      नोट: मखमली कपड़े को ऑटोक्लेव करने के लिए 100% कॉटन होना चाहिए। नसबंदी के बाद कपड़े को सुखाना जरूरी है।
    5. मखमली कपड़े की नसबंदी के बाद कपड़े को गोल ब्लॉक पर रखें और उसे धातु की अंगूठी से ठीक करें। झुर्रियों से बचना महत्वपूर्ण है। ध्यान से तय मखमल कपड़े की सतह पर उगाया कालोनियों (नीचे का सामना करना पड़ आगर) के साथ थाली जगह है । सुनिश्चित करें कि सभी उपनिवेश गोलाकार तरीके से पेट्री डिश पर सावधानीपूर्वक टैप करके मखमल की सतह को छूते हैं।
    6. ध्यान से पौंड आगर प्लेट को हटा दें और मखमल के कपड़े पर एंटीबायोटिक दवाओं (kanamycin 25 μg/mL) के साथ पूरक एक चयनात्मक प्लेट रखें । सुनिश्चित करें कि प्लेट पहले वर्णित पेट्री डिश पर सावधानीपूर्वक टैप करके सभी मखमल को छू रही है। बाद में, थाली निकालें। रात के विकास के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटों को छोड़ दें।
    7. अगले दिन एलबी आगर प्लेट और चुनिंदा थाली दोनों का मूल्यांकन करें। चुनिंदा मीडिया पर बढ़ने वाली कॉलोनियों को प्लाज्मिड होस्ट (यानी एंटीबायोटिक प्रतिरोधी) के रूप में गिना जाता है, जबकि कॉलोनी-मुक्त स्पॉट ऐसी उपनिवेश हैं जो प्लाज्मिड-फ्री थे और इस प्रकार एंटीबायोटिक के प्रतिरोधी नहीं हैं (यानी, प्लाज्मिड खो दिया है)। यह प्लेटों को एक दूसरे के ऊपर रखकर और विकास की तुलना (यानी, किसी भी लापता कॉलोनियों को चिह्नित करके) और दोनों प्लेटों पर कॉलोनी नंबर गिनकर किया जाता है। यह उन कोशिकाओं की संख्या पैदा करता है जो विकास प्रयोग के दौरान प्लाज्मिड खो देते हैं।
    8. पूरे विकास प्रयोग के साथ इस प्रक्रिया को नियमित तरीके से दोहराएं (उदाहरण के लिए, हर 14 स्थानान्तरण)।

3. जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करप्लाज्मिड मल्टीमर का दृश्य

नोट: कम कॉपी वाले प्लाज्मिड की प्लाज्मिड निष्कर्षण से अक्सर मेजबान गुणसूत्र डीएनए के साथ संदूषण होता है जिसे दृश्य से पहले एंजाइमैटिक रूप से पचाने की आवश्यकता होती है।

  1. चरण 1.5 में वर्णित क्षारीय लिसिस का उपयोग करके 5 मिलील स्थिर रातों की कोशिका संस्कृति से प्लाज्मिड डीएनए निकालें।
  2. बाद में, निकाले गए प्लाज्मिड डीएनए को एटीपी-निर्भर DNase के साथ इलाज करें जो गुणसूत्र डीएनए संदूषण को हटाने के लिए गुणसूत्र डीएनए में कटौती करता है (सामग्री की तालिकादेखें)। 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें बाद में अपनी पसंद की किट का इस्तेमाल कर डीएनए को साफ करें।
  3. सभी प्लाज्मिड संरचनाओं (मोनोमर या मल्टीमर) के खुले सर्कल अणुओं को बनाने के लिए, एक निकिंग एंजाइम (Nb.BsrDI) के साथ प्लाज्मिड डीएनए नमूनों को इनक्यूबेट करें और 65 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. समानांतर में, रैखिक प्लाज्मिड अणुओं (यानी, प्लाज्मिड आकार की तुलना के लिए) बनाने के लिए, अपनी पसंद के प्रतिबंध एंजाइम (जैसे, हिंडIII) का उपयोग करें जो प्लाज्मिड को एक बार छोड़ देता है।
    नोट: यह रैखिक डीएनए प्लाज्मिड मोनोमर में परिणाम है। खुले सर्कल अणु रैखिक तरीके से माइग्रेट नहीं करते हैं।
  5. प्लाज्मिड आकार और संरचना की कल्पना करने के लिए, इलेक्ट्रोफ्लोरीज एक 1% (w/v) अगारोज जेल और 1 × TAE बफर में 4.3 V/cm पर 120 min के लिए निकेड और रैखिक प्लाज्मिड डीएनए नमूनों। नमूनों को मिडोरी ग्रीन से दाग दिया जाता है और जेल को जेल इमेजिंग सिस्टम (सामग्री की तालिकादेखें) पर कल्पना की जाती है। 1 केबीपी सीढ़ी का प्रयोग करें।

Representative Results

यहां, हम एक जनसंख्या में प्लाज्मिड हठ मात्रा द्वारा प्लाज्मिड विकास का अध्ययन करने के लिए एक दृष्टिकोण पेश करते हैं । सबसे पहले, हम दिखाते हैं कि ई. कोलाई स्ट्रेन MG1655 pCON को ले जाने वाले प्लाज्मिड का निर्माण कैसे किया जाए जिसे बाद में एक विकास प्रयोग से पेश किया गया है। दूसरा, हम विकसित जीवाणु आबादी में प्लाज्मिड बहुतायत का पालन करने के लिए एक सीधा तरीका पेश करते हैं। अंत में, हम दिखाते हैं कि प्लाज्मिड अणु आकार और संरचना की कल्पना कैसे की जाए।

हमारे पिछलेकाम 8 प्रस्तुत दृष्टिकोण का उपयोग कर में हम एंटीबायोटिक दवाओं की अनुपस्थिति में ई. कोलाई में एंटीबायोटिक प्रतिरोध प्लाज्मिड्स के हठ के बाद एक विकास प्रयोग आयोजित(चित्रा 4)। हमारे प्रतिनिधि परिणाम 37 डिग्री सेल्सियस पर आबादी के विकास और 10-4की कमजोर पड़ने की दर दिखाते हैं . प्लाज्मिड-ले जाने वाली कोशिकाओं की बहुतायत के बाद, हमने समय के साथ आवृत्ति प्लाज्मिड-ले जाने वाली मेजबान कोशिकाओं(चित्रा 4)में कमी देखी। हमारे दृष्टिकोण ने हमें यह पता लगाने में सक्षम बनाया कि प्लाज्मिड लॉस संघनित प्लाज्मिड जीनोम वास्तुकला का परिणाम था, जिसके कारण प्रतिरोध जीन के प्रतिलेखन और प्लाज्मिड की प्रतिकृति के कारण होने वाले संघर्षों के कारण प्लाज्मिड अस्थिरता हुई। प्लाज्मिड अणुओं की कल्पना ने हमें यह पता लगाने में सक्षम बनाया कि इन संघर्षों ने एक अस्थिर प्लाज्मिड संरचना (यानी, प्लाज्मिड मल्टीमर गठन, चित्रा 5)का नेतृत्व किया। फिर भी, हमने एंटीबायोटिक दवाओं के संपर्क के बिना प्लाज्मिड स्थिरता विकास देखा(चित्र4)। विकसित स्थिरता को एक प्लाज्मिड आंतरिक दोहराव द्वारा प्रदान किया गया था जिसने प्रतिलेखन-प्रतिकृति संघर्षों को समाप्त कर दिया और स्थिर विरासत में मिली प्लाज्मिड के गठन का नेतृत्व किया। इस प्रकार हमारे परिणाम आनुवंशिक तत्वों के अनुकूली विकास में पुनर्संयोजन और जीनोम प्रवर्धन के महत्व को प्रदर्शित करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: pCON के प्लाज्मिड डिजाइन। क्लोनिंग रणनीति का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व प्लाज्मिड पीसीओन बनाने के लिए उपयोग किया जाता है। प्लाज्मिड रीढ़ (pBBR1) और एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन(एनपीटीआई)पीसीआर परिलक्षित होते हैं और आइसोथर्मल फ्यूजन20से जुड़े होते हैं। यह प्लाज्मिड pCON और तनाव MG1655 pCON पैदावार । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: दीर्घकालिक विकास प्रयोग का डिजाइन। धारावाहिक स्थानांतरण प्रयोग का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। प्लाज्मिड ले जाने (pCON) आबादी चुनिंदा मीडिया पर चढ़ाया जाता है । पैतृक उपनिवेशों बेतरतीब ढंग से थाली से चुना जाता है और एक धारावाहिक हस्तांतरण प्रणाली के लिए शुरू की जाती है। स्थानांतरण विभिन्न आकारों की जनसंख्या बाधाओं का अनुकरण करने के लिए तीन अलग-अलग कमजोर पड़ने वाले दृष्टिकोणों के साथ आयोजित किए जाते हैं। कमजोर पड़ने को क्रमिक रूप से दोहराया जाता है । यह प्रयोग दो तापमान व्यवस्थाओं में किया जाता है। प्लाज्मिड-होस्ट आवृत्ति प्रतिकृति चढ़ाना के माध्यम से प्रयोग के साथ मापा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिकृति चढ़ाना। बैक्टीरियल आबादी की प्रतिकृति चढ़ाना में उपयोग किए जाने वाले चरणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: समय के साथ प्रतिनिधि pCON आवृत्ति। pCON हठ विकास प्रयोग के दौरान मेजबान (प्रतिनिधि दोहराने आबादी) के अनुपात के रूप में दिखाया गया है । 98 स्थानान्तरण के लिए, पीकॉन प्लाज्मिड आबादी 10-4के कमजोर पड़ने वाले कारक के साथ गैर-चयनात्मक परिस्थितियों में विकसित हुई। प्लाज्मिड pCON ले जाने वाले सभी प्रतिकृतियों की आबादी में कमी आई। बाद में, आबादी रातोंरात ऊष्मायन के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के संपर्क में थे और प्लाज्मिड स्थिरता विकास के लिए परीक्षण करने के लिए गैर चयनात्मक परिस्थितियों में फिर से खेती की गई । इस आंकड़े को वेन एट अल से संशोधित किया गया है।8कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: प्लाज्मिड संरचना का प्रतिनिधि विश्लेषण। मॉडल प्लाज्मिड पकॉन का दृश्य। विजुअलाइज्ड अनइलाज प्लाज्मिड डीएनए सीधे निकालने के बाद, रैखिक प्लाज्मिड डीएनए है, और DNase के साथ इलाज किया जाता है जो केवल गुणसूत्र डीएनए के साथ-साथ एंजाइमैटिक रूप से निकाड डीएनए (यानी, ओपन सर्कल प्लाज्मिड डीएनए) में कटौती करता है। प्लाज्मिड को रैखिक करने से पता चलता है कि सभी प्लाज्मिड एक ही आकार के होते हैं। क्रोमोसोमल डीएनए और निकिंग पीसीओएन को हटाने से डिमर्स और अन्य मल्टीमर की उपस्थिति का पता चलता है। इस आंकड़े को वेन एट अल8से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं जो बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक प्रतिरोध के हठ के लिए प्लाज्मिड विकास की भूमिका की जांच करने के लिए आणविक जीव विज्ञान, प्रयोगात्मक विकास और डीएनए दृश्य में तकनीकों को जोड़ती है। हालांकि प्रस्तुत दृष्टिकोण विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों से तरीकों को जोड़ती है, सभी लागू तकनीकों सीधा कर रहे है और एक मानक माइक्रोबायोलॉजी प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया जा सकता है ।

प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम मॉडल प्रणाली तनाव है कि प्लाज्मिड ले जाने जीनोटाइप के आनुवंशिक सत्यापन भी शामिल है के निर्माण में शामिल हैं । विशेष रूप से, कई प्लाज्मिड स्वाभाविक रूप से एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन को एन्कोड करते हैं। इस प्रकार, पाठक प्रोटोकॉल के चरण 1 को छोड़ सकता है और सीधे चरण 2 के साथ आगे बढ़ सकता है। इसके बाद, विकास प्रयोगों में आबादी को दोहराने का एक यादृच्छिक डिजाइन शामिल होना चाहिए ताकि परिणाम गहरी अच्छी तरह से प्लेट में दोहराने वाली आबादी की स्थिति से पक्षपाती न हों। इसके अलावा, विकास प्रयोग में सीरियल ट्रांसफर और कमजोर पड़ने वाले चरणों को सावधानीपूर्वक संचालित करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि संदूषण परिणामों को ग़लत साबित करेगा। अंत में, प्रतिकृति चढ़ाना बड़ी सावधानी के साथ आयोजित किया जाना चाहिए। बड़ी कॉलोनी का आकार एक मुद्दा हो सकता है, लेकिन 24 घंटे से कम समय के लिए प्लेटों को इनक्यूबेटकरी करके इससे बचा जा सकता है। इसी तरह, एक प्लेट पर कालोनियों की संख्या प्रतिकृति चढ़ाना परिणाम पूर्वाग्रह हो सकता है । इसलिए, चढ़ाना और प्रतिकृति से पहले आबादी को पतला करने की आवश्यकता है।

हमारे दृष्टिकोण का सबसे बड़ा लाभ यह है कि आसानी से भारी उपकरणों की आवश्यकता के बिना पुन: पेश किया जा सकता है । इसके अलावा, मार्कर जीन का पालन करने के लिए प्रतिकृति चढ़ाना का एक और लाभ यह है कि केवल जीवित कोशिकाओं का मूल्यांकन किया जाता है, प्रवाह साइटोमेट्री या क्यूपीसीआर के विपरीत जिसमें मृत कोशिकाओं को जीवित के रूप में मूल्यांकन किया जा सकता है। इस प्रकार, प्रतिकृति चढ़ाना प्लाज्मिड-ले जाने वाली कोशिकाओं की गिनती के लिए कम पूर्वाग्रह का परिचय देता है। बहरहाल, प्रतिकृति चढ़ाना की एक सीमा जनसंख्या आकार (यानी, सेल संख्या) है कि एक प्रयोगात्मक रन में मूल्यांकन करने के लिए संभव है हो सकता है ।

हमारे दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने हाल ही में दिखाया है कि प्लाज्मिड स्थिरता विकास बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के हठ को शक्तिशाली बनाता है। इस प्रकार, हमने प्लाज्मिड-मध्यस्थता प्रतिरोध हठ का पालन करने के लिए एक उपकरण के रूप में एक दृष्टिकोण विकसित किया है जो एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति के बिना विशेष रूप से शर्तों के तहत समय के साथ प्रतिरोध का पालन करने के लिए उच्च महत्व का है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम रचनात्मक सहायता और तकनीकी सहायता के लिए गोर मार्गआर्यन को धन्यवाद देते हैं । इस काम को जेडएमबी यंग साइंटिस्ट ग्रांट 2017/2018 (TW को सम्मानित) और डीएफजी फोकस प्रोग्राम 1819 (ग्रांट नंबर एक) ने सपोर्ट किया था। DA1202/2-1 टीडी को सम्मानित किया गया) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-deep-well plates Starlab
96-deep-well plates Roth EN07.1 2 ml, square
96-deep-well plates (cryo) Starlab E1702-8400 Micro-Dilution Tube System
Colony counter Stuart SC6+
Cotton velvet drapery shop 100 % cotton required
Electrophoresis chamber BioRad Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis power supply BioRad 1645070 Agarose gel electrophoresis
Electroporation cuvettes BioRad 1652089 0.1 cm
Electroporator BioRad 1652660
GeneJet Gel Extraction kit Thermo Fisher Scientific K0832 PCR fragment clean-up
GeneJet Plasmid Miniprep kit Thermo Fisher Scientific K0503 Plasmid extraction kit
Gibson Assembly New England Biolabs E2611S
Incubator Thermo Fisher Scientific 50125852
Incubator (plate shaker) Heidolph 1000
Incubator (shaker) New Brunswick Scientific Innova 44
Inoculating loops Sigma-Aldrich
Multi-channel pippetes Eppendorf 3125000052, 3125000028
Multi-channel pippetes Capp ME8-1250R
NanoDrop 2000/2000c Thermo Fisher Scientific ND2000
Oligonucleotides Eurofines
Petri dishes Sigma-Aldrich
Phusion Polymerase Thermo Fisher Scientific F533S
Pipettes Eppendorf 3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063,
PlasmidSafe enzyme Epicentre 10059400
Reaction tubes Eppendorf 30125150
Replica block & metal ring VWR 601-3401 PVC cylinder 69 mm; ring 102cm
Resctriction enzymes New England Biolabs
Thermocycler BioRad T100

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References

  1. San Millan, A. Evolution of plasmid-mediated antibiotic resistance in the clinical context. Trends in Microbiology. 26, (12), 978-985 (2018).
  2. Bruto, M., James, A., et al. Vibrio crassostreae, a benign oyster colonizer turned into a pathogen after plasmid acquisition. The ISME Journal. 11, (4), 1043-1052 (2017).
  3. von Wintersdorff, C. J. H., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, (110), 305-310 (2016).
  4. Lenski, R. E. Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations. ISME Journal. 11, (10), 2181-2194 (2017).
  5. De Gelder, L., Williams, J. J., Ponciano, J. E. M., Sota, M., Top, E. M. Adaptive plasmid evolution results in host-range expansion of a broad-host-range plasmid. Genetics. 178, (4), 2179-2190 (2008).
  6. Harrison, E., Guymer, D., Spiers, A. J., Paterson, S., Brockhurst, M. A. Parallel compensatory evolution stabilizes plasmids across the parasitism-mutualism continuum. Current Biology. 25, (15), 2034-2039 (2015).
  7. Bouma, J. E., Lenski, R. E. Evolution of a bacteria/plasmid association. Nature. 335, (6188), 351-352 (1988).
  8. Wein, T., Hülter, N. F., Mizrahi, I., Dagan, T. Emergence of plasmid stability under nonselective conditions maintains antibiotic resistance. Nature Communications. 10, (1), 2595 (2019).
  9. Loftie-Eaton, W., et al. Compensatory mutations improve general permissiveness to antibiotic resistance plasmids. Nature Ecology & Evolution. 1, (9), 1354-1363 (2017).
  10. Millan, A. S., et al. Positive selection and compensatory adaptation interact to stabilize non-transmissible plasmids. Nature Communications. 5, (1), 1-11 (2014).
  11. Loftie-Eaton, W., Tucker, A., Norton, A., Top, E. M. Flow cytometry and real-time quantitative PCR as tools for assessing plasmid persistence. Applied and Environmental Microbiology. 80, (17), 5439-5446 (2014).
  12. Münch, K. M., et al. Polar fixation of plasmids during recombinant protein production in Bacillus megaterium results in population heterogeneity. Applied and Environmental Microbiology. 81, (17), 5976-5986 (2015).
  13. Jahn, M., Vorpahl, C., Hübschmann, T., Harms, H., Müller, S. Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR. Microbial Cell Factories. 15, (1), 211 (2016).
  14. Lederberg, J., Lederberg, M. E. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. Journal of Bacteriology. 63, 399-406 (1952).
  15. Summers, D. K., Sherratt, D. J. Multimerization of high copy number plasmids causes instability: ColE1 encodes a determinant essential for plasmid monomerization and stability. Cell. 36, (4), 1097-1103 (1984).
  16. Summers, D. K., Beton, C. W., Withers, H. L. Multicopy plasmid instability: the dimer catastrophe hypothesis. Molecular Microbiology. 8, (6), 1031-1038 (1993).
  17. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166, (4), 557-580 (1983).
  18. Ilhan, J., et al. Segregational drift and the interplay between plasmid copy number and evolvability. Molecular Biology and Evolution. 36, (3), 472-486 (2019).
  19. Beck, E., Ludwig, G., Auerswald, E. A., Reiss, B., Schaller, H. Nucleotide sequence and exact localization of the neomycin phosphotransferase gene from transposon Tn5. Gene. 19, (3), 327-336 (1982).
  20. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, (5), 343-345 (2009).
एक प्रायोगिक विकास दृष्टिकोण में प्लाज्मिड-मध्यस्थता एंटीबायोटिक प्रतिरोध का परिमाणीकरण
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Wein, T., Stücker, F. T., Hülter, N. F., Dagan, T. Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach. J. Vis. Exp. (154), e60749, doi:10.3791/60749 (2019).More

Wein, T., Stücker, F. T., Hülter, N. F., Dagan, T. Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach. J. Vis. Exp. (154), e60749, doi:10.3791/60749 (2019).

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