Vår eksperimentelle tilnærming gir en strategi for å følge plasmider overflod og antibiotikaresistens over tid i bakterielle populasjoner.
Plasmider spiller en viktig rolle i mikrobiell økologi og evolusjon som kjøretøyer av lateral genoverføring og reservoarer av tilbehør gen funksjoner i mikrobielle populasjoner. Dette er spesielt tilfelle under raskt skiftende miljøer som varierende antibiotika eksponering. Vi har nylig viste at plasmider opprettholde antibiotikaresistens gener i Escherichia coli uten positivt valg for plasmider tilstedeværelse. Her beskriver vi et eksperimentelt system som gjør det mulig å følge både de plasmider genotype og fenotype i langsiktige utviklings eksperimenter. Vi bruker molekylære teknikker for å designe en modell plasmider som senere introduseres til en eksperimentell evolusjon batch system tilnærming i en E. coli Host. Vi følger plasmider frekvens over tid ved å bruke kopi plating av E. coli populasjoner mens kvantifisere antibiotikaresistens utholdenhet. I tillegg overvåker vi konformasjon av plasmider i vert celler ved å analysere omfanget av plasmider multimer formasjon av plasmider skår og agarose gel elektroforese. En slik tilnærming gir oss mulighet til å visualisere ikke bare Genova størrelsen på utvikling plasmider men også deres topologisk konformasjon-en faktor svært viktig for plasmider arv. Vårt system kombinerer molekylære strategier med tradisjonelle mikrobiologi og gir et oppsett for å følge plasmider i bakterie populasjoner over lang tid. Den presenterte tilnærmingen kan anvendes for å studere et bredt spekter av mobile genetiske elementer i fremtiden.
Plasmider er sirkulære, selv-replikere genetiske elementer som er allestedsnærværende i prokaryoter. De er agenter for lateral genoverføring, som de kan overføre trekk mellom mikrobielle populasjoner, og dermed anses å spille en viktig rolle i mikrobiell evolusjon. Plasmider er drivere av rask tilpasning til vekst-begrensende forhold over en kort tid (f. eks, i nærvær av antibiotika eller sprøytemidler1) og er ansvarlig for langsiktig overgang til andre livsstil moduser (f. eks fremveksten av patogenitet2). De mest slående eksemplene på virkningen av plasmider ved overføring av gener er dokumentert i økosystemer eksponert for varierende grad av antibiotika, slik som medisinske klinikker eller i industrielle gårder3. På grunn av sterke positive valg, mange plasmider kode for antimikrobielle resistens gener og er ofte funnet å konferere multiresistance til sin bakteriell vert. Plasmider aktivere migrasjon mellom populasjoner eller bakterielle arter, noe som resulterer i en rask spredning av flere antimikrobielle resistens. Under selektivt forhold plasmider er ikke avgjørende for cellen og er ofte også referert til som parasitt elementer. Likevel, plasmider er allestedsnærværende i naturen og deres evolusjon er svært sammenvevd med at av bakteriell kromosomer. Plasmider utholdenhet i naturlige miljøer (varierende og selektivt) er fortsatt dårlig forstått, men det er av stor betydning for vår forståelse av utholdenhet av antibiotikaresistens gener i naturen.
Eksperimentell evolusjon er et kraftig verktøy for studiet av mikrobielle populasjoner4. Eksperimentell evolusjon viste at imponerende sterkt utvalg for plasmider vedlikehold fører til kompenserende (dvs. adaptive) utviklingen av plasmider eller verts kromosom som reduserer plasmider fitness kostnader og i sin tur Letter plasmider overflod (dvs. plasmider utholdenhet)5,6,7. Således, etter plasmider-vert interaksjon over tid kan avdekke viktige mekanismer for tilpasning av begge elementene. I tillegg gjør eksperimentell evolusjon det mulig for en å kvantifisere overflod av plasmider-bærende celler over tid under ulike forhold8,9,10.
Plasmider utholdenhet i evolusjon eksperimenter kan overvåkes av flere strategier, inkludert flyt flowcytometri av fluorescerende aktivert celle sortering (FACS)11, kvantitativ PCR (qPCR)11, eller i dyrking-baserte metoder. Flow flowcytometri krever en FACS maskin og innføringen av et synlig (fluorescerende) markør gen, slik som det grønne fluorescerende proteinet (GFP), på plasmider. Imidlertid kan GFP uttrykk endre flere cellulære egenskaper og dessuten påvirke plasmider plassering i cellen12, som igjen kan påvirke plasmider arv under celledeling. En qPCR tilnærming for å måle plasmider overflod kan være svært partisk av plasmider kopi nummer, som kan variere sterkt langs bakteriell vekstfase og over tid13. Endelig, en kultur-basert og plating tilnærming krever innføring av en valgbar markør genet. Dette kan være et antibiotikaresistens gen, som ofte er kodet på naturlig plasmider; Dermed er ingen genetisk manipulering nødvendig. Antibiotikaresistens kan etterfølges av en tradisjonell kopi plating tilnærming. Således, for å studere naturlig plasmider dynamikk, er kopi plating godt egnet til å overvåke plasmider-kodet antibiotika resisitance14.
For å visualisere plasmider molekyler (for eksempel for å evaluere plasmider størrelse) kan flere metoder anvendes. Hele plasmider kan forsterkes ved hjelp av en PCR-basert tilnærming. Dette krever imidlertid utformingen av spesifikke primere, som kan være utfordrende under en evolusjon eksperiment, fordi plasmider sekvensen kan endres over tid. I tillegg er det vanskelig å forsterke plasmider multimers i en PCR-basert tilnærming på grunn av flere bindings områder for PCR-primere. Multimeric plasmider molekyler kan vises etter plasmider replikering oppsigelse eller gjennom rekombinasjon av plasmider molekyler og er for det meste orientert Head-to-tail15. En annen tilnærming til plasmider visualisering kombinerer enzymatisk fordøyelse av plasmider molekyler av DNA endonucleases som enten Cleave eller Nick en plasmider DNA strand med agarose gel elektroforese analyse. De samme plasmider i forskjellige størrelser (f.eks. monomerer vs. multimers) resulterer i forskjellige gel-mobilities som kan observeres ved visualisering av plasmider molekyler. Denne tilnærmingen muliggjør visualisering og kvantifisering av ulike plasmider konformasjonen (dvs. multimerization tilstander). Den plasmider konformasjon kan brukes som en indikator på plasmider stabilitet, som plasmider multimers er ofte tapt under celle divisjon16.
I et nylig arbeid, fulgte vi plasmider utholdenhet i forhold som ikke var selektiv for plasmider overflod (dvs. uten antibiotika). Vi sammenlignet plasmider utholdenhet ved to forskjellige temperaturer (20 ° c og 37 ° c) og tre befolknings størrelser (dvs. fortynnings rater). Bruk av ulike fortynning priser, eller befolknings flaskehalser, gjør det mulig for etterforskningen av innflytelsen av befolkningen størrelse på bakteriell og plasmider evolusjon. Basert på våre resultater, foreslår vi at plasmider kan være nøytral til deres bakteriell vert og kan utvikle stabilitet uten valg trykk8. Den utviklede plasmider stabiliteten er gitt ved reduksjon av plasmider multimer formasjon8.
Her presenterer vi en protokoll for kvantifisering av plasmider utholdenhet og etterforskning av plasmider evolusjon i forhold til vedlikehold av antibiotikaresistens gener. Metoden har flere trinn, inkludert innsetting av et antibiotikaresistens gen til en modell plasmider (som kan utelates ved bruk av en naturlig motstand plasmider), etterfulgt av bruk av eksperimentell evolusjon å vurdere potensialet i plasmider å vedvare under selektivt forhold mens bestemme plasmider frekvens dynamikk over tid ved hjelp av kopi plating, og analysen av plasmider Genova ved visualisering. Protokollen beskrevet her var utformet for å undersøke utviklingen og utholdenhet av plasmider, men det kan også anvendes for å følge utviklingen av kromosom resistens gener (eller andre markør gener) over tid.
I denne protokollen, presenterer vi en tilnærming som kombinerer teknikker i molekylærbiologi, eksperimentell evolusjon, og DNA-visualisering for å undersøke rollen til plasmider evolusjon for utholdenhet av antibiotikaresistens i bakterier. Selv om presentert tilnærming kombinerer metoder fra ulike forskningsområder, alle de anvendte teknikkene er grei og kan utføres i en standard mikrobiologi laboratorium.
De mest kritiske trinnene i protokollen inkluderer bygging av modellen systembelastningen som inkluderer genetisk validering av plasmider-bærende genotype. Spesielt mange plasmider naturlig kode antibiotikaresistens gener. Dermed kan leseren utelate trinn 1 i protokollen og direkte fortsette med trinn 2. Deretter bør utviklingen eksperimenter inkludere en tilfeldig utforming av replikere populasjoner slik at resultatene ikke er forutinntatt av plasseringen av replikere populasjoner i dyp-brønn plate. I tillegg er det spesielt viktig å nøye gjennomføre seriell overføring og fortynning trinnene i utviklingen eksperimentet som forurensning ville forfalske resultatene. Til slutt bør kopi plating utføres med stor forsiktighet. Stor koloni størrelse kan være et problem, men det kan unngås ved incubating platene for mindre enn 24 h. Tilsvarende kan antall kolonier på en plate bias kopi plating resultater. Derfor må populasjoner fortynnes før plating og replikering.
En av de største fordelene med vår tilnærming er som lett kan reproduseres uten behov for tungt utstyr. I tillegg er en annen fordel med kopi plating å følge markør gener som bare leverceller evalueres, i motsetning til flyt flowcytometri eller qPCR der døde celler kan evalueres som levende. Dermed introduserer kopi plating mindre bias til telling av plasmider-bærende celler. Likevel, en begrensning av kopi plating kan være befolkningen størrelse (dvs. celle nummer) som er mulig å evaluere i en eksperimentell kjøre.
Ved hjelp av vår tilnærming, har vi nylig vist at plasmider stabilitet evolusjon potenserer utholdenhet av antibiotikaresistens gener i bakterier. Dermed utviklet vi en tilnærming som et verktøy for å følge plasmider-mediert motstand utholdenhet som er av høy viktighet å følge motstanden over tid, spesielt under forhold uten tilstedeværelse av antibiotika.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker gor Margaryan for kreativ støtte og teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av ZMB Young forsker Grant 2017/2018 (tildelt TW) og DFG fokus programmet 1819 (Grant no. DA1202/2-1 tildelt TD).
96-deep-well plates | Starlab | ||
96-deep-well plates | Roth | EN07.1 | 2 ml, square |
96-deep-well plates (cryo) | Starlab | E1702-8400 | Micro-Dilution Tube System |
Colony counter | Stuart | SC6+ | |
Cotton velvet | drapery shop | 100 % cotton required | |
Electrophoresis chamber | BioRad | Agarose gel electrophoresis | |
Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
Electroporation cuvettes | BioRad | 1652089 | 0.1 cm |
Electroporator | BioRad | 1652660 | |
GeneJet Gel Extraction kit | Thermo Fisher Scientific | K0832 | PCR fragment clean-up |
GeneJet Plasmid Miniprep kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Plasmid extraction kit |
Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50125852 | |
Incubator (plate shaker) | Heidolph | 1000 | |
Incubator (shaker) | New Brunswick Scientific | Innova 44 | |
Inoculating loops | Sigma-Aldrich | ||
Multi-channel pippetes | Eppendorf | 3125000052, 3125000028 | |
Multi-channel pippetes | Capp | ME8-1250R | |
NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND2000 | |
Oligonucleotides | Eurofines | ||
Petri dishes | Sigma-Aldrich | ||
Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
Pipettes | Eppendorf | 3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063, | |
PlasmidSafe enzyme | Epicentre | 10059400 | |
Reaction tubes | Eppendorf | 30125150 | |
Replica block & metal ring | VWR | 601-3401 | PVC cylinder 69 mm; ring 102cm |
Resctriction enzymes | New England Biolabs | ||
Thermocycler | BioRad | T100 |