Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Kvantifisering av plasmider-mediert antibiotikaresistens i en eksperimentell Evolution Approach

doi: 10.3791/60749 Published: December 14, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Vår eksperimentelle tilnærming gir en strategi for å følge plasmider overflod og antibiotikaresistens over tid i bakterielle populasjoner.

Abstract

Plasmider spiller en viktig rolle i mikrobiell økologi og evolusjon som kjøretøyer av lateral genoverføring og reservoarer av tilbehør gen funksjoner i mikrobielle populasjoner. Dette er spesielt tilfelle under raskt skiftende miljøer som varierende antibiotika eksponering. Vi har nylig viste at plasmider opprettholde antibiotikaresistens gener i Escherichia coli uten positivt valg for plasmider tilstedeværelse. Her beskriver vi et eksperimentelt system som gjør det mulig å følge både de plasmider genotype og fenotype i langsiktige utviklings eksperimenter. Vi bruker molekylære teknikker for å designe en modell plasmider som senere introduseres til en eksperimentell evolusjon batch system tilnærming i en E. coli Host. Vi følger plasmider frekvens over tid ved å bruke kopi plating av E. coli populasjoner mens kvantifisere antibiotikaresistens utholdenhet. I tillegg overvåker vi konformasjon av plasmider i vert celler ved å analysere omfanget av plasmider multimer formasjon av plasmider skår og agarose gel elektroforese. En slik tilnærming gir oss mulighet til å visualisere ikke bare Genova størrelsen på utvikling plasmider men også deres topologisk konformasjon-en faktor svært viktig for plasmider arv. Vårt system kombinerer molekylære strategier med tradisjonelle mikrobiologi og gir et oppsett for å følge plasmider i bakterie populasjoner over lang tid. Den presenterte tilnærmingen kan anvendes for å studere et bredt spekter av mobile genetiske elementer i fremtiden.

Introduction

Plasmider er sirkulære, selv-replikere genetiske elementer som er allestedsnærværende i prokaryoter. De er agenter for lateral genoverføring, som de kan overføre trekk mellom mikrobielle populasjoner, og dermed anses å spille en viktig rolle i mikrobiell evolusjon. Plasmider er drivere av rask tilpasning til vekst-begrensende forhold over en kort tid (f. eks, i nærvær av antibiotika eller sprøytemidler1) og er ansvarlig for langsiktig overgang til andre livsstil moduser (f. eks fremveksten av patogenitet2). De mest slående eksemplene på virkningen av plasmider ved overføring av gener er dokumentert i økosystemer eksponert for varierende grad av antibiotika, slik som medisinske klinikker eller i industrielle gårder3. På grunn av sterke positive valg, mange plasmider kode for antimikrobielle resistens gener og er ofte funnet å konferere multiresistance til sin bakteriell vert. Plasmider aktivere migrasjon mellom populasjoner eller bakterielle arter, noe som resulterer i en rask spredning av flere antimikrobielle resistens. Under selektivt forhold plasmider er ikke avgjørende for cellen og er ofte også referert til som parasitt elementer. Likevel, plasmider er allestedsnærværende i naturen og deres evolusjon er svært sammenvevd med at av bakteriell kromosomer. Plasmider utholdenhet i naturlige miljøer (varierende og selektivt) er fortsatt dårlig forstått, men det er av stor betydning for vår forståelse av utholdenhet av antibiotikaresistens gener i naturen.

Eksperimentell evolusjon er et kraftig verktøy for studiet av mikrobielle populasjoner4. Eksperimentell evolusjon viste at imponerende sterkt utvalg for plasmider vedlikehold fører til kompenserende (dvs. adaptive) utviklingen av plasmider eller verts kromosom som reduserer plasmider fitness kostnader og i sin tur Letter plasmider overflod (dvs. plasmider utholdenhet)5,6,7. Således, etter plasmider-vert interaksjon over tid kan avdekke viktige mekanismer for tilpasning av begge elementene. I tillegg gjør eksperimentell evolusjon det mulig for en å kvantifisere overflod av plasmider-bærende celler over tid under ulike forhold8,9,10.

Plasmider utholdenhet i evolusjon eksperimenter kan overvåkes av flere strategier, inkludert flyt flowcytometri av fluorescerende aktivert celle sortering (FACS)11, kvantitativ PCR (qPCR)11, eller i dyrking-baserte metoder. Flow flowcytometri krever en FACS maskin og innføringen av et synlig (fluorescerende) markør gen, slik som det grønne fluorescerende proteinet (GFP), på plasmider. Imidlertid kan GFP uttrykk endre flere cellulære egenskaper og dessuten påvirke plasmider plassering i cellen12, som igjen kan påvirke plasmider arv under celledeling. En qPCR tilnærming for å måle plasmider overflod kan være svært partisk av plasmider kopi nummer, som kan variere sterkt langs bakteriell vekstfase og over tid13. Endelig, en kultur-basert og plating tilnærming krever innføring av en valgbar markør genet. Dette kan være et antibiotikaresistens gen, som ofte er kodet på naturlig plasmider; Dermed er ingen genetisk manipulering nødvendig. Antibiotikaresistens kan etterfølges av en tradisjonell kopi plating tilnærming. Således, for å studere naturlig plasmider dynamikk, er kopi plating godt egnet til å overvåke plasmider-kodet antibiotika resisitance14.

For å visualisere plasmider molekyler (for eksempel for å evaluere plasmider størrelse) kan flere metoder anvendes. Hele plasmider kan forsterkes ved hjelp av en PCR-basert tilnærming. Dette krever imidlertid utformingen av spesifikke primere, som kan være utfordrende under en evolusjon eksperiment, fordi plasmider sekvensen kan endres over tid. I tillegg er det vanskelig å forsterke plasmider multimers i en PCR-basert tilnærming på grunn av flere bindings områder for PCR-primere. Multimeric plasmider molekyler kan vises etter plasmider replikering oppsigelse eller gjennom rekombinasjon av plasmider molekyler og er for det meste orientert Head-to-tail15. En annen tilnærming til plasmider visualisering kombinerer enzymatisk fordøyelse av plasmider molekyler av DNA endonucleases som enten Cleave eller Nick en plasmider DNA strand med agarose gel elektroforese analyse. De samme plasmider i forskjellige størrelser (f.eks. monomerer vs. multimers) resulterer i forskjellige gel-mobilities som kan observeres ved visualisering av plasmider molekyler. Denne tilnærmingen muliggjør visualisering og kvantifisering av ulike plasmider konformasjonen (dvs. multimerization tilstander). Den plasmider konformasjon kan brukes som en indikator på plasmider stabilitet, som plasmider multimers er ofte tapt under celle divisjon16.

I et nylig arbeid, fulgte vi plasmider utholdenhet i forhold som ikke var selektiv for plasmider overflod (dvs. uten antibiotika). Vi sammenlignet plasmider utholdenhet ved to forskjellige temperaturer (20 ° c og 37 ° c) og tre befolknings størrelser (dvs. fortynnings rater). Bruk av ulike fortynning priser, eller befolknings flaskehalser, gjør det mulig for etterforskningen av innflytelsen av befolkningen størrelse på bakteriell og plasmider evolusjon. Basert på våre resultater, foreslår vi at plasmider kan være nøytral til deres bakteriell vert og kan utvikle stabilitet uten valg trykk8. Den utviklede plasmider stabiliteten er gitt ved reduksjon av plasmider multimer formasjon8.

Her presenterer vi en protokoll for kvantifisering av plasmider utholdenhet og etterforskning av plasmider evolusjon i forhold til vedlikehold av antibiotikaresistens gener. Metoden har flere trinn, inkludert innsetting av et antibiotikaresistens gen til en modell plasmider (som kan utelates ved bruk av en naturlig motstand plasmider), etterfulgt av bruk av eksperimentell evolusjon å vurdere potensialet i plasmider å vedvare under selektivt forhold mens bestemme plasmider frekvens dynamikk over tid ved hjelp av kopi plating, og analysen av plasmider Genova ved visualisering. Protokollen beskrevet her var utformet for å undersøke utviklingen og utholdenhet av plasmider, men det kan også anvendes for å følge utviklingen av kromosom resistens gener (eller andre markør gener) over tid.

Protocol

1. bygging av en modell plasmider bærer en antibiotikaresistens gen

Merk: belastningen Escherichia coli K-12 MG1655 ble brukt som modell organisme i alle eksperimenter (DSM No. 18039, tysk samling av mikroorganismer og Cell kulturer, DSMZ). Belastningen E. coli DH5α17 ble brukt under plasmider konstruksjon.

  1. PCR forsterker plasmider ryggrad etter ditt valg og forsterker motstands genet inkludert arrangøren regionen ved PCR (figur 1).
    1. PCR forsterker plasmider ryggraden ved hjelp av en polymerase av høy kvalitet og oligonukleotider pBBR1_for (5 '-GCGGCCACCGGCTGGCT-3 ') og pBBR1_rev (5 '-TACCGGCGCGGCAGCGTGACCC-3 ') på plasmider malen pLC (GenBank ACC. no. MH238456)18.
    2. PCR forsterke motstanden genet nptII inkludert native Tn5 promoter19 ved hjelp av en high-fidelity polymerase og OLIGONUKLEOTIDER nptII_gib_for (5 '-GCGCCGGTAGATCTGCTCATGTTTGAAGCTTCACGCTGCCGCA-3 ') og nptII_gib_rev (5 '-CGGTGGCCGCCAAAAAGGCCATCCGTCAGGTCAGAAGAACTCGT-3 '). NptII -genet koder for en Neomycin fosfotransferase og gir motstand mot kanamycin.
      Merk: design primere for motstanden genet med ca 20 BP av komplementære sekvens til plasmider ryggraden at det vil bli smeltet til.
  2. Rengjør både PCR-fragmenter ved hjelp av et sett av ditt valg.
  3. Bli med renset antibiotikaresistens genet PCR produkt (inkludert promoter region) til renset plasmider ryggrad og sikring av homologe regionene ved hjelp isotermiske montering20, ved 50 ° c for 60 min.
  4. Electroporate den smeltet produktet i belastningen E. coli DH5α.
    1. Introduser 2 μL av produktet fra trinn 1,3 til 40 μL av electrocompetent celler i 2 mm kyvetter ved 4 ° c og 2,5 kV. Resuspend celler i 1 mL lysogeny buljong (LB) medium.
    2. Overfør det totale volumet til et microfuge rør og ruge 1 t ved 37 ° c risting ved 250 RPM i en orbital shaker for å muliggjøre uttrykk for motstands merket på plasmider.
    3. Plate 100 μL av cellene på LB agar plater som inneholder riktig antibiotika (kanamycin 25 μg/mL) for å velge for antibiotikaresistens genet og dermed velge for plasmider-bærende celler. Snurr ned resten, fjerne supernatanten, resuspend cellene i 100 μL LB og plate på en selektiv agar plate. Ruge platene ved 37 ° c i 24 timer.
  5. For å verifisere kloner, Pakk den konstruerte plasmider via alkalisk lyse med en kommersiell mini-prep Kit.
    1. Harvest 5 mL av den stasjonære natten kultur ved sentrifugering ved 12 000 x g ved romtemperatur. Resuspend cellene i blanding oppløsning, deretter lyse og nøytralisere celle løsning. Sentrifuger for 5 min ved 12 000 x g.
    2. Overfør supernatanten til DNA bindings Kol onnen som følger med settet, og vask kolonnen to ganger med 500 μL vaskeløsning sentrifugering 2x før tent av Kol onne membranen med eluering buffer.
    3. Utfør sanger-sekvensering av plasmider for å bekrefte at sekvensen er riktig.
  6. Når plasmider gyldighet er bekreftet, electroporate den plasmider (nå pCON) i belastningen E. coli MG1655 som beskrevet ovenfor. Dette gir belastning E. coli MG1655 pCON.

2. overvåking av plasmider under ulike forhold over tid

Merk: utviklingen eksperimentet er utført med plasmider-bærende belastninger under selektivt forhold (LB Media) i to temperaturer (37 ° c og 20 ° c) og tre befolkning flaskehalser størrelser. Den eksperimentelle designen brukes til å studere plasmider utholdenhet under ulike forhold.

  1. Design av en evolusjon eksperiment for å følge plasmider frekvens over tid (figur 2)
    1. Plate den konstruerte plasmider-bærende belastning (E. coli MG1655 pCON) på lb agar plater supplert med antibiotika (kanamycin 25 μg/ml) og ruge over natten ved 37 ° c.
    2. Forbered 96 dype brønn plater med 1 mL LB medium i hver brønn. Som bakterielle forfedre, plukke åtte tilfeldige isolerte kolonier fra agar plate i uavhengige brønner. Ruge platene ved 37 ° c og 450 RPM på en plate shaker for 24 h. Forbered en frossen glyserol lager av Ancestral kloner.
    3. Den neste dagen overføre de åtte replikere populasjoner i nye Deep-brønn plater i henhold til eksperimentell design (figur 2). Kulturene er fortynnet 1:100 (stor flaskehals, L), 1:1000 (middels flaskehals, M), eller 1:10000 (liten flaskehals, S) i et total volum på 1 mL LB ved bruk av PBS for fortynning. De fortynnede kulturene er begge inkubert ved 37 ° c og 20 ° c.
      Merk: det er svært viktig å kontrollere for krysskontaminering i 96-dyp-brønn platen. Dermed bruker en sjakkbrett plate design av interkalering inokulert brønner med bakterier-fri LB medium. Bruk dette mønsteret gjennom hele evolusjonen eksperimentet.
    4. Kulturene som inkubert ved 37 ° c blir overført hver 12 h, mens kulturer ved 20 ° c blir overført hver 24 h.
      Merk: under hver overføring hendelse flaskehalsen størrelses behandling påføres og seriell overføring gjentas over totalt 98 overføringer. Antallet overføringer vil avhenge av lesernes eksperimentelle design.
    5. Forbered en frossen glyserol lager av alle populasjoner regelmessig, 2x i uken.
  2. Overvåking av plasmider frekvens ved kopi plating (Figur 3)
    Merk: i løpet av utviklingen eksperimentet, hyppigheten av plasmider i befolkningen er anslått fra andelen av verter. Replikaen plating protokollen er vist i Figur 3.
    1. For å bestemme plasmider frekvens i befolkningen under evolusjonen eksperimentet, stasjonære kulturer er serielt fortynnet og belagt på selektivt LB agar plater. Juster fortynning i henhold til en avkastning på 250-500 kolonier per plate.
      Merk: Forbered tykke LB agar plater før plating (~ 30 mL agar).
    2. De belagte populasjoner er inkubert for over natten vekst i henhold til deres vekst temperatur i eksperimentet.
      Merk: koloniene må være små, og dermed ruge < 24 timer ved 37 ° c.
    3. Etter over natten vekst, telle alle kolonier ved hjelp av en manuell eller automatisert koloni telle stasjon og beregne den totale bakterielle Befolkningsstørrelsen i kulturer.
      Merk: kolonier på kanten av agar platen bør ikke inkluderes i den totale bakterie celle tellingen.
    4. Sterilisere firkantede brikker (~ 20 x 20 cm) bomulls fløyel ved autoklavering.
      Merk: fløyel kluten må være 100% bomull for å være autoklaverbar. Det er viktig å tørke kluten etter sterilisering.
    5. Etter sterilisering av fløyel klut, plassere kluten på en rund blokk og fikse det med en metall ring. Det er avgjørende å unngå rynker. Forsiktig plassere platen med de voksne koloniene (agar vendt ned) på den faste fløyel klut overflaten. Sørg for at alle kolonier berører fløyel overflaten ved å trykke forsiktig på Petri parabolen i en sirkulær måte.
    6. Forsiktig fjerne LB agar plate og plassere en selektiv plate supplert med antibiotika (kanamycin 25 μg/mL) på fløyel klut. Pass på at platen berører alle fløyel ved å trykke forsiktig på Petri parabolen som beskrevet før. Etterpå fjerner du platen. La platene i romtemperatur for overnatting vekst.
    7. Neste dag, evaluere både LB agar plate og selektiv plate. Kolonier som vokser på selektiv Media telles som plasmider verter (dvs. antibiotika resistente), mens koloni-frie flekker er kolonier som var plasmider og er således ikke motstandsdyktig mot antibiotika (dvs. mistet plasmider). Dette gjøres ved å plassere platene over hverandre og sammenligne veksten (dvs. markere eventuelle manglende kolonier) og telle kolonien nummeret på begge platene. Dette gir antall celler som mistet plasmider under utviklingen eksperimentet.
    8. Gjenta denne prosedyren langs hele utviklingen eksperimentet på en vanlig måte (for eksempel hver 14 overføringer).

3. visualisering av plasmider multimers ved hjelp av gel elektroforese

Merk: plasmider ekstraksjon av lav-kopi plasmider ofte fører til forurensning med vert kromosom DNA som må enzymatisk fordøyd før visualisering.

  1. Pakk plasmider DNA fra en 5 mL stasjonær over natten cellekultur ved hjelp av alkalisk lyse som beskrevet i trinn 1,5.
  2. Etterpå kan du behandle det utpakkede plasmider DNA med en ATP-avhengig DNase som bare kutter kromosom DNA for å fjerne kromosom DNA-forurensning (se tabell over materialer). Ruge ved 37 ° c i 30 min. etterpå, rengjør DNA ved hjelp av et sett av ditt valg.
  3. For å skape åpne sirkel molekyler av alle plasmider konformasjonen (monomerer eller multimers), ruge de plasmider DNA-prøvene med et skår enzym (NB. BsrDI) og ruge i 30 min ved 65 ° c.
  4. Parallelt, for å lage lineære plasmider molekyler (dvs. for plasmider størrelse sammenligning), bruk en restriksjon enzym av ditt valg (f. eks, HindIII) som kløyver plasmider gang.
    Merk: Dette resulterer i lineær DNA plasmider monomerer. Åpne sirkel molekyler ikke migrere på en lineær måte.
  5. For å visualisere plasmider størrelse og konformasjon, electrophorese de nicked og lineære plasmider DNA-prøvene for 120 min ved 4,3 V/cm i en 1% (w/V) agarose gel og 1 × TAE buffer. Prøvene er farget med Midori grønn og gelen er visualisere på en gel Imaging system (se tabell over materialer). Bruk en 1 KBP stige.

Representative Results

Her presenterer vi en tilnærming for å studere plasmider evolusjon ved kvantifisere plasmider utholdenhet i en befolkning. Først viser vi hvordan å bygge plasmider bærer E. coli stamme MG1655 pCON som senere introdusert til en evolusjon eksperiment. For det andre presenterer vi en grei metode for å følge plasmider overflod i utviklingen av bakterielle populasjoner. Til slutt viser vi hvordan du kan visualisere plasmider molekylstørrelse og konformasjon.

I vårt forrige arbeid8 bruker presenterte tilnærmingen vi gjennomførte en evolusjon eksperiment etter utholdenhet av antibiotikaresistens plasmider i E. coli i fravær av antibiotika (Figur 4). Våre representative resultater viser utviklingen av populasjoner ved 37 ° c og en fortynnings rate på 10-4. Etter overflod av plasmider, observerte vi en nedgang i hyppigheten plasmider-bærende verts celler over tid (Figur 4). Vår tilnærming gjorde det mulig for oss å oppdage at det plasmider tapet var et resultat av den kondensert plasmider-arkitekturen, noe som førte til plasmider ustabilitet forårsaket av konflikter introdusert av transkripsjon av motstands genet og replikering av plasmider selv. Visualisering av plasmider molekyler gjorde oss i stand til å oppdage at disse konfliktene førte til en ustabil plasmider konformasjon (dvs. plasmider multimer formasjon, figur 5). Likevel observerte vi plasmider stabilitet evolusjon uten eksponering for antibiotika (Figur 4). Den utviklet stabilitet ble overdratt av en plasmider iboende duplisering som avskaffet den transkripsjon-replikering konflikter og førte til dannelsen av stabilt arvet plasmider. Våre resultater viser således viktigheten av rekombinasjon og Genova forsterkning i adaptiv utvikling av genetiske elementer.

Figure 1
Figur 1: plasmider utforming av pCON. Skjematisk fremstilling av kloning strategien brukes til å bygge plasmider pCON. Plasmider ryggrad (pBBR1) og antibiotikaresistens genet (nptII) er PCR forsterket og smeltet sammen av isotermiske Fusion20. Dette gir plasmider pCON og belastningen MG1655 pCON. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: design av langsiktig evolusjon eksperimentet. Skjematisk fremstilling av det serielle overførings eksperimentet. Plasmider (pCON)-populasjonen er belagt på selektive medier. Ancestral kolonier er tilfeldig valgt fra platen og introdusert til en seriell overføring system. Overføringene er gjennomført med tre ulike fortynning tilnærminger for å simulere befolknings flaskehalser i forskjellige størrelser. Fortynninger er serielt gjentas. Eksperimentet er gjennomført i to temperatur regimer. Frekvensen for plasmider måles langs eksperimentet via kopi belegg. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: kopi belegg. Skjematisk fremstilling av trinnene brukt i kopi plating av bakterie populasjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: representativ pCON-frekvens over tid. pCON utholdenhet er vist som andelen av vertene (representative replikere populasjoner) i løpet av utviklingen eksperimentet. For 98 overføringer, pCON plasmider populasjoner utviklet seg under selektivt forhold med en fortynning faktor på 10-4. Alle replikeres bærer plasmider pCON redusert i befolkningen. Etterpå ble befolkningen utsatt for antibiotika for overnatting inkubasjons og ble dyrket igjen under selektivt forhold for å teste for plasmider stabilitet evolusjon. Dette tallet er endret fra Wein et al.8Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: representative analyse av plasmider konformasjon. Visualisering av modellen plasmider pCON. Visualisere er ubehandlet plasmider DNA rett etter utpakking, linearized plasmider DNA, og behandlet med DNase som bare kutter kromosom DNA samt enzymatisk nicked DNA (dvs. åpen sirkel plasmider DNA). Linearizing plasmider viser at alle plasmider er av samme størrelse. Fjerne kromosom DNA og skår pCON avslører tilstedeværelsen av dimers og andre multimers. Dette tallet er endret fra Wein et al.8. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

I denne protokollen, presenterer vi en tilnærming som kombinerer teknikker i molekylærbiologi, eksperimentell evolusjon, og DNA-visualisering for å undersøke rollen til plasmider evolusjon for utholdenhet av antibiotikaresistens i bakterier. Selv om presentert tilnærming kombinerer metoder fra ulike forskningsområder, alle de anvendte teknikkene er grei og kan utføres i en standard mikrobiologi laboratorium.

De mest kritiske trinnene i protokollen inkluderer bygging av modellen systembelastningen som inkluderer genetisk validering av plasmider-bærende genotype. Spesielt mange plasmider naturlig kode antibiotikaresistens gener. Dermed kan leseren utelate trinn 1 i protokollen og direkte fortsette med trinn 2. Deretter bør utviklingen eksperimenter inkludere en tilfeldig utforming av replikere populasjoner slik at resultatene ikke er forutinntatt av plasseringen av replikere populasjoner i dyp-brønn plate. I tillegg er det spesielt viktig å nøye gjennomføre seriell overføring og fortynning trinnene i utviklingen eksperimentet som forurensning ville forfalske resultatene. Til slutt bør kopi plating utføres med stor forsiktighet. Stor koloni størrelse kan være et problem, men det kan unngås ved incubating platene for mindre enn 24 h. Tilsvarende kan antall kolonier på en plate bias kopi plating resultater. Derfor må populasjoner fortynnes før plating og replikering.

En av de største fordelene med vår tilnærming er som lett kan reproduseres uten behov for tungt utstyr. I tillegg er en annen fordel med kopi plating å følge markør gener som bare leverceller evalueres, i motsetning til flyt flowcytometri eller qPCR der døde celler kan evalueres som levende. Dermed introduserer kopi plating mindre bias til telling av plasmider-bærende celler. Likevel, en begrensning av kopi plating kan være befolkningen størrelse (dvs. celle nummer) som er mulig å evaluere i en eksperimentell kjøre.

Ved hjelp av vår tilnærming, har vi nylig vist at plasmider stabilitet evolusjon potenserer utholdenhet av antibiotikaresistens gener i bakterier. Dermed utviklet vi en tilnærming som et verktøy for å følge plasmider-mediert motstand utholdenhet som er av høy viktighet å følge motstanden over tid, spesielt under forhold uten tilstedeværelse av antibiotika.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker gor Margaryan for kreativ støtte og teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av ZMB Young forsker Grant 2017/2018 (tildelt TW) og DFG fokus programmet 1819 (Grant no. DA1202/2-1 tildelt TD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-deep-well plates Starlab
96-deep-well plates Roth EN07.1 2 ml, square
96-deep-well plates (cryo) Starlab E1702-8400 Micro-Dilution Tube System
Colony counter Stuart SC6+
Cotton velvet drapery shop 100 % cotton required
Electrophoresis chamber BioRad Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis power supply BioRad 1645070 Agarose gel electrophoresis
Electroporation cuvettes BioRad 1652089 0.1 cm
Electroporator BioRad 1652660
GeneJet Gel Extraction kit Thermo Fisher Scientific K0832 PCR fragment clean-up
GeneJet Plasmid Miniprep kit Thermo Fisher Scientific K0503 Plasmid extraction kit
Gibson Assembly New England Biolabs E2611S
Incubator Thermo Fisher Scientific 50125852
Incubator (plate shaker) Heidolph 1000
Incubator (shaker) New Brunswick Scientific Innova 44
Inoculating loops Sigma-Aldrich
Multi-channel pippetes Eppendorf 3125000052, 3125000028
Multi-channel pippetes Capp ME8-1250R
NanoDrop 2000/2000c Thermo Fisher Scientific ND2000
Oligonucleotides Eurofines
Petri dishes Sigma-Aldrich
Phusion Polymerase Thermo Fisher Scientific F533S
Pipettes Eppendorf 3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063,
PlasmidSafe enzyme Epicentre 10059400
Reaction tubes Eppendorf 30125150
Replica block & metal ring VWR 601-3401 PVC cylinder 69 mm; ring 102cm
Resctriction enzymes New England Biolabs
Thermocycler BioRad T100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. San Millan, A. Evolution of plasmid-mediated antibiotic resistance in the clinical context. Trends in Microbiology. 26, (12), 978-985 (2018).
  2. Bruto, M., James, A., et al. Vibrio crassostreae, a benign oyster colonizer turned into a pathogen after plasmid acquisition. The ISME Journal. 11, (4), 1043-1052 (2017).
  3. von Wintersdorff, C. J. H., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, (110), 305-310 (2016).
  4. Lenski, R. E. Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations. ISME Journal. 11, (10), 2181-2194 (2017).
  5. De Gelder, L., Williams, J. J., Ponciano, J. E. M., Sota, M., Top, E. M. Adaptive plasmid evolution results in host-range expansion of a broad-host-range plasmid. Genetics. 178, (4), 2179-2190 (2008).
  6. Harrison, E., Guymer, D., Spiers, A. J., Paterson, S., Brockhurst, M. A. Parallel compensatory evolution stabilizes plasmids across the parasitism-mutualism continuum. Current Biology. 25, (15), 2034-2039 (2015).
  7. Bouma, J. E., Lenski, R. E. Evolution of a bacteria/plasmid association. Nature. 335, (6188), 351-352 (1988).
  8. Wein, T., Hülter, N. F., Mizrahi, I., Dagan, T. Emergence of plasmid stability under nonselective conditions maintains antibiotic resistance. Nature Communications. 10, (1), 2595 (2019).
  9. Loftie-Eaton, W., et al. Compensatory mutations improve general permissiveness to antibiotic resistance plasmids. Nature Ecology & Evolution. 1, (9), 1354-1363 (2017).
  10. Millan, A. S., et al. Positive selection and compensatory adaptation interact to stabilize non-transmissible plasmids. Nature Communications. 5, (1), 1-11 (2014).
  11. Loftie-Eaton, W., Tucker, A., Norton, A., Top, E. M. Flow cytometry and real-time quantitative PCR as tools for assessing plasmid persistence. Applied and Environmental Microbiology. 80, (17), 5439-5446 (2014).
  12. Münch, K. M., et al. Polar fixation of plasmids during recombinant protein production in Bacillus megaterium results in population heterogeneity. Applied and Environmental Microbiology. 81, (17), 5976-5986 (2015).
  13. Jahn, M., Vorpahl, C., Hübschmann, T., Harms, H., Müller, S. Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR. Microbial Cell Factories. 15, (1), 211 (2016).
  14. Lederberg, J., Lederberg, M. E. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. Journal of Bacteriology. 63, 399-406 (1952).
  15. Summers, D. K., Sherratt, D. J. Multimerization of high copy number plasmids causes instability: ColE1 encodes a determinant essential for plasmid monomerization and stability. Cell. 36, (4), 1097-1103 (1984).
  16. Summers, D. K., Beton, C. W., Withers, H. L. Multicopy plasmid instability: the dimer catastrophe hypothesis. Molecular Microbiology. 8, (6), 1031-1038 (1993).
  17. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166, (4), 557-580 (1983).
  18. Ilhan, J., et al. Segregational drift and the interplay between plasmid copy number and evolvability. Molecular Biology and Evolution. 36, (3), 472-486 (2019).
  19. Beck, E., Ludwig, G., Auerswald, E. A., Reiss, B., Schaller, H. Nucleotide sequence and exact localization of the neomycin phosphotransferase gene from transposon Tn5. Gene. 19, (3), 327-336 (1982).
  20. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, (5), 343-345 (2009).
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wein, T., Stücker, F. T., Hülter, N. F., Dagan, T. Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach. J. Vis. Exp. (154), e60749, doi:10.3791/60749 (2019).More

Wein, T., Stücker, F. T., Hülter, N. F., Dagan, T. Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach. J. Vis. Exp. (154), e60749, doi:10.3791/60749 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter