Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Количественная оценка плазмидно-опосредованного устойчивости к антибиотикам в экспериментальном подходе к эволюции

doi: 10.3791/60749 Published: December 14, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Наш экспериментальный подход обеспечивает стратегию по следу за изобилием плазмида и устойчивостью к антибиотикам с течением времени в бактериальных популяциях.

Abstract

Плазмиды играют важную роль в микробной экологии и эволюции как средства боковой передачи генов и резервуары вспомогательных функций генов в микробных популяциях. Это особенно актуально в условиях быстро меняющихся условий, таких как колебания воздействия антибиотиков. Недавно мы показали, что плазмиды поддерживают гены устойчивости к антибиотикам в escherichia coli без положительного отбора для присутствия плазмиды. Здесь мы описываем экспериментальную систему, которая позволяет следовать как плазмид генотип и фенотип в долгосрочных экспериментов эволюции. Мы используем молекулярные методы для разработки модели плазмида, которая впоследствии вводится в экспериментальный подход к системе пакетов эволюции в хостах кишечной палочки. Мы следуем плазмидной частоты с течением времени, применяя реплики покрытие e. coli населения при количественной устойчивости к антибиотикам. Кроме того, мы отслеживаем конформацию плазмидов в клетках-хозяинах, анализируя степень плазмидного мультимерного образования с помощью плазмидного никинга и электрофореза агарозного геля. Такой подход позволяет визуализировать не только размер генома эволюционных плазмидов, но и их топологический конформации - фактор, очень важный для плазмидного наследования. Наша система сочетает в себе молекулярные стратегии с традиционными подходами микробиологии и обеспечивает настройку для наблюдения за плазмидами в бактериальных популяциях в течение длительного времени. Представленный подход может быть применен для изучения широкого спектра мобильных генетических элементов в будущем.

Introduction

Плазмиды являются круговыми, самовоспроизводятся генетические элементы, которые повсеместно в прокариот. Они являются агентами боковой передачи генов, так как они могут передавать черты между микробными популяциями, и, таким образом, считаются играть важную роль в эволюции микробов. Плазмиды являются драйверами быстрой адаптации к условиям ограничения роста в течение короткого времени (например, при наличии антибиотиков или пестицидов1)и отвечают за долгосрочный переход к другим способам образа жизни (например, появление патогенности2). Наиболее яркие примеры воздействия плазмидов на передачу генов задокументированы в экосистемах, подверженных колебаниям уровней антибиотиков, таких как медицинские клиники или в промышленных фермах3. Из-за сильного положительного отбора, многие плазмиды кодируют для противомикробных генов устойчивости и часто встречаются, чтобы придать мультирезистентность их бактериального хозяина. Плазмиды позволяют миграцию между популяциями или бактериальными видами, что приводит к быстрому распространению множественной устойчивости к противомикробным препаратам. В неселективных условиях плазмиды не являются существенными для клетки и часто даже называют паразитическими элементами. Тем не менее, плазмиды являются вездесущими в природе, и их эволюция тесно переплетена с бактериальными хромосомами. Сохранение плазмиды в естественной среде (колеблющейся и неселективной) остается плохо изученным, но оно имеет большое значение для нашего понимания сохранения генов устойчивости к антибиотикам в природе.

Экспериментальная эволюция является мощным инструментом для изучения микробных популяций4. Экспериментальная эволюция показала, что навязывание сильного отбора для плазмидного обслуживания приводит к компенсационной (т.е. адаптивной) эволюции плазмидной или хост-хромосомы, что снижает стоимость плазмидной пригодности и, в свою очередь, облегчает изобилие плазмидных (т.е. плазмидную стойкость)5,6,7. Таким образом, после плазмид-хозяина взаимодействия с течением времени может выявить важные механизмы адаптации обоих элементов. Кроме того, экспериментальная эволюция позволяет количественно обилие плазмид-несущих клеток с течением времени при различных условиях8,9,10.

Плазменный упорство в экспериментах по эволюции может контролироваться несколькими стратегиями, включая цитометрию потока с помощью флуоресцентной активированной сортировки клеток (FACS)11, количественного ПЦР (qPCR)11, или в методах, основанных на выращивании. Цитометрия потока требует машины FACS и введения обнаруживаемого (флуоресцентного) маркерного гена, такого как зеленый флуоресцентный белок (GFP), на плазмид. Тем не менее, выражение GFP может изменить несколько клеточных свойств и, кроме того, влиять на плазмидное расположение в ячейке12, что, в свою очередь, может повлиять на плазмидное наследование во время деления клеток. подход qPCR для измерения изобилия плазмида может быть весьма предвзятым по плазмидной копии числа, которые могут сильно варьироваться вдоль стадии роста бактерий и с течением времени13. Наконец, подход, основанный на культуре и покрытие, требует введения выбираемого гена маркера. Это может быть ген устойчивости к антибиотикам, который часто кодируется на естественных плазмидах; таким образом, никаких генетических манипуляций не требуется. Устойчивость к антибиотикам может сопровождаться традиционным подходом к покрытию реплики. Таким образом, для изучения естественной плазмидной динамики, реплика покрытие хорошо подходит для мониторинга плазмид-кодированных антибиотиков резизитов14.

Для визуализации молекул плазмида (например, для оценки плазмидного размера) могут быть применены несколько методов. Целые плазмиды могут быть усилены с помощью подхода, основанного на ПЦР. Однако для этого требуется разработка конкретных грунтовок, которые могут быть сложными в ходе эксперимента по эволюции, поскольку плазмидная последовательность может меняться с течением времени. Кроме того, трудно усилить плазменовые мультимеры в подходе на основе ПЦР из-за нескольких связывающих сайтов для праймеров ПЦР. Многомерные молекулы плазмида могут появиться после прекращения репликации плазмида или через рекомбинацию молекул плазмида и в основном ориентированы голова к хвосту15. Другой подход плазмидвизуализации в сочетании ферментативного пищеварения молекул плазмида ДНК эндонуклеазов, которые либо расщеплять или ник плазмидной нити ДНК с агарозным гелем электрофорезанализа анализа. Одиниковый плазмид разных размеров (например, мономеры против мультимеров) приводит к различным гелевые мобилизующие, которые могут наблюдаться при визуализации молекул плазмида. Такой подход позволяет визуализировать и количественно измерить различные плазмидные конформации (т.е. состояния мультимеризации). Плазмидная конформация может быть использована в качестве индикатора плазмидной устойчивости, так как плазмидные мультимеры часто теряются во время деления клеток16.

В недавней работе мы следили за плазмидной настойчивостью в условиях, которые не были избирательными для изобилия плазмида (т.е. без отбора антибиотиков). Мы сравнили устойчивость плазмида при двух различных температурах (20 градусов по Цельсию и 37 градусов по Цельсию) и трех размерах популяции (т.е. коэффициенты разбавления). Применение различных показателей разбавления, или узких мест популяции, позволяет исследует влияние численности популяции на бактериальную и плазмидную эволюцию. Основываясь на наших результатах, мы предлагаем, что плазмиды могут быть нейтральными к их бактериального хозяина и может развиваться стабильность без какого-либо давления отбора8. Эволюция плазмидной стабильности присуждается сокращением плазмидного мультимерного образования8.

Здесь мы представляем протокол для количественной оценки сохранения плазмида и исследования плазмидной эволюции в отношении поддержания генов устойчивости к антибиотикам. Метод имеет несколько шагов, в том числе вставка гена устойчивости к антибиотикам в модель плазмида (который может быть опущен при использовании природной плазмиды устойчивости), а затем использование экспериментальной эволюции для оценки потенциала плазмида, чтобы сохранить в неселективных условиях при определении динамики плазмидной частоты с течением времени с помощью реплики покрытия, и анализ плазмидного генома путем визуализации. Описанный здесь протокол был разработан для изучения эволюции и сохранения плазмидов, но он также может быть применен для наблюдения за эволюцией генов хромосомной резистентности (или других генов маркеров) с течением времени.

Protocol

1. Конструкция модели плазмиды, несущей ген устойчивости к антибиотикам

ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм Escherichia coli K-12 MG1655 использовался в качестве образцового организма во всех экспериментах (DSM No 18039, Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур, DSM). Штамм E. coli DH5'17 использовался во время плазмидной конструкции.

  1. ПЦР усиливают плазменную основу по вашему выбору и усиливают ген сопротивления, включая область промотора по ПЦР(рисунок 1).
    1. ПЦР усиливают плазменную хребет с помощью полимеразы высокой точности и олигонуклеотидов pBBR1_for (5'-GCGGCCGGGGCTCT-3') и pBBR1_rev (5'-TACGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGT-3') на плазменных шаблонах pLC (GenBank acc. no. MH238456)18.
    2. PCR усиливают ген сопротивления nptII включая родной промоутер Tn5 19 с использованием полимеразы высокой точности и олигонуклеотидов nptII_gib_for (5'-GCGGGTAGCTCTCTCTCTCTTTTGACGTCACGCCGCA-3') и nptII_gib_rev (5'-CGGTGGCCCAAAAGGCC Ген nptII кодирует фосфотрансферазу неомицина и придает устойчивость канамицину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дизайн праймеров для гена сопротивления с примерно 20 bp дополнительной последовательности плазмидной позвоночника, что он будет слиты.
  2. Очистите оба фрагмента ПЦР, используя комплект по вашему выбору.
  3. Присоединяйтесь к очищенной устойчивости к антибиотикам генп ПЦР продукт (в том числе его промотор региона) для очищенной плазмидной позвоночника и сплавить гомологичные области с использованием изотермальной сборки20, при 50 кв кс в течение 60 мин.
  4. Электропорировать сросшиеся продукты в штамм E. coli DH5.
    1. Ввести 2 зл и l продукта со ступени 1,3 до 40 л электрокомпетентных клеток в 2 мм кюветы при 4 кВ и 2,5 кВ. Переплетить клетки в 1 мл лисогенного бульона (LB) среды.
    2. Перенесите общий объем в микрофугую трубку и инкубировать 1 ч при 37 градусах Постряски при 250 об/мин в орбитальном шейкере, чтобы обеспечить выражение маркера сопротивления на плазмиде.
    3. Плита 100 л клеток на пластинах агара LB, содержащих соответствующий антибиотик (канамицин 25 мкг/мл), чтобы выбрать ген устойчивости к антибиотикам и таким образом выбрать для плазмид-несущих клеток. Спин вниз остальные, удалить супернатант, resuspend клетки в 100 ЛЛ л. и пластины на селективной пластины агара. Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию в течение 24 ч.
  5. Для проверки клонов извлеките сконструированные плазмиды с помощью щелочным лисисом с помощью коммерческого мини-подготовительного комплекта.
    1. Урожай 5 мл стационарной ночной культуры центрифугипригана при температуре в комнате 12 000 х г. Resuspend клетки в растворе, затем лизировать и нейтрализовать клеточный раствор. Центрифуга в течение 5 мин при 12 000 х г.
    2. Перенесите супернатант в связывающую колонку ДНК, представленную в комплекте, и дважды промойте колонку с помощью 500-й л стирального раствора центрифугирование мембраны 2x, прежде чем вывести мембрану колонны с буфером элютации.
    3. Выполните секвенирование плазмиды Sanger, чтобы подтвердить, что последовательность верна.
  6. После того, как плазмид действительность проверяется, электропорат плазмиды (теперь pCON) в штамм E. coli MG1655, как описано выше. Это дает штамм E. coli MG1655 pCON.

2. Мониторинг плазмид-несущих бактерий в различных условиях с течением времени

ПРИМЕЧАНИЕ: Эволюция эксперимент проводится с плазмидно-несущих штаммов в неселективных условиях (LB media) в двух температурах (37 градусов по Цельсию и 20 градусов по Цельсию) и три популяции узких размеров. Экспериментальная конструкция используется для изучения плазмидной стойкости в различных условиях.

  1. Дизайн эволюционный эксперимент следовать плазмидной частоты с течением времени (Рисунок 2)
    1. Плита построен плазмид-несущий штамм(E. coli MG1655 pCON) на LB агар пластины дополнены антибиотиками (канамицин 25 мкг/мл) и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию.
    2. Приготовьте 96 глубоководных пластин с 1 мл среды LB в каждой скважине. Как бактериальные предки, выбрать восемь случайных изолированных колоний из агар пластины в независимых скважин. Инкубировать пластины при 37 градусах Цельсия и 450 об/мин на тарелке шейкера для 24 ч. Приготовьте замороженный глицерол бульон клонов предков.
    3. На следующий день передать восемь реплицировать популяции в новые глубоководные пластины в соответствии с экспериментальной конструкции(рисунок 2). Культуры разбавлены 1:100 (большое узкое место, L), 1:1,000 (среднее узкое место, M), или 1:10,000 (небольшое узкое место, S) в общем объеме 1 мл LB с использованием PBS для разбавления. Разбавленные культуры инкубируются при 37 градусах Цельсия и 20 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно контролировать перекрестное загрязнение в пластине 96-глубокой скважины. Таким образом, используйте конструкцию пластины, пересекая привитые скважины с безбактериевной средой LB. Используйте эту модель в рамках всего эксперимента эволюции.
    4. Культуры, инкубированные при 37 градусах Цельсия, передаются каждые 12 ч, в то время как культуры при 20 градусах Цельсия передаются каждые 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время каждого события передачи применяется обработка размера узких мест и серийная передача повторяется в общей сложности 98 переводов. Количество переводов будет зависеть от экспериментального дизайна читателей.
    5. Подготовьте замороженный глицерол запас всех популяций регулярно, 2 x в неделю.
  2. Мониторинг плазмидной частоты путем реплики покрытия (Рисунок 3)
    ПРИМЕЧАНИЕ: В ходе эксперимента по эволюции частота плазмидно-переносных клеток в популяции оценивается по доле хозяев. Протокол покрытия реплики отображается на рисунке 3.
    1. Для определения плазмидной частоты в популяции в ходе эксперимента по эволюции стационарные культуры последовательно разбавляются и покрываются неселективными агарными пластинами LB. Отрегулируйте разбавление в соответствии с урожайностью 250-500 колоний на тарелку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте толстые пластины lb агара до покрытия (агар 30 мл).
    2. Покрытые популяции инкубируются для ночного роста в зависимости от температуры роста в эксперименте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии должны быть небольшими, таким образом, инкубировать йlt;24 ч при 37 градусов по Цельсию.
    3. После ночного роста, подсчитайте все колонии с помощью ручной или автоматизированной станции подсчета колоний и вычислите общий размер бактериальной популяции в культурах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии на краю агаровой пластины не должны быть включены в общее количество бактериальных клеток.
    4. Стерилизовать квадратные куски (20 х 20 см) из хлопчатобумажного бархата путем автоклавирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: бархатная ткань должна быть 100% хлопка, чтобы быть autoclavable. Важно высушить ткань после стерилизации.
    5. После стерилизации бархатной ткани поместите ткань на круглый блок и зафиксируйте ее металлическим кольцом. Очень важно, чтобы избежать морщин. Аккуратно поместите тарелку с выращенными колониями (агаром вниз) на фиксированной бархатной ткани поверхности. Убедитесь, что все колонии коснуться бархатной поверхности, тщательно нажав на чашку Петри в круговой манере.
    6. Аккуратно снимите пластину LB агара и поместите селективную пластину, дополненную антибиотиками (канамицин 25 мкг/мл) на бархатную ткань. Убедитесь, что пластина касается всех бархат, тщательно нажав на чашку Петри, как описано ранее. После этого снимите тарелку. Оставьте пластины при комнатной температуре для ночного роста.
    7. На следующий день оцените как пластину lb агара, так и селективную пластину. Колонии, которые растут на селективных носителях, считаются плазмидными хозяевами (т.е. устойчивыми к антибиотикам), в то время как свободные от колоний места являются колониями, которые были без плазмида и, таким образом, не устойчивы к антибиотикам (т.е. утрачены плазмидными). Это делается путем размещения пластин друг над другом и сравнения роста (т.е. пометить любые отсутствующие колонии) и подсчета числа колоний на обеих пластинах. Это дает количество клеток, которые потеряли плазмида во время эксперимента эволюции.
    8. Повторите эту процедуру вдоль всего эксперимента эволюции в регулярном порядке (например, каждые 14 переводов).

3. Визуализация плазмидных мультимер с использованием геля электрофореза

ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида экстракции плазмиды с низким уровнем копирования часто приводит к загрязнению хост хромосомной ДНК, которая должна быть ферментативно усваивается до визуализации.

  1. Извлеките плазмидную ДНК из 5 мл стационарной ночной клеточной культуры с помощью щелочного лисиса, как описано в шаге 1.5.
  2. После этого, лечить извлеченные плазмидной ДНК с АТФ-зависимых DNase, что только сокращение хромосомной ДНК для удаления хромосомных загрязнения ДНК (см. Таблица материалов). Инкубировать при 37 градусах По Цельсию в течение 30 мин. После этого очистите ДНК с помощью комплекта по вашему выбору.
  3. Для создания молекул открытого круга всех плазмидных конформий (мономеров или мультимеров) инкубировать образцы плазмидной ДНК с ферментом nicking (Nb.BsrDI) и инкубировать в течение 30 мин при 65 градусах Цельсия.
  4. Параллельно, для создания линейных молекул плазмида (т.е. для сравнения размеров плазмида), используйте фермент ограничения по вашему выбору (например, HindIII), который расщепляет плазмид один раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это приводит к линейной ДНК плазмидных мономеров. Молекулы открытого круга не мигрируют линейным образом.
  5. Чтобы визуализировать размер плазмида и конформацию, электрофорезы nicked и линейных образцов плазмид ДНК в течение 120 минут при 4,3 V/cm в 1% (w/v) агарозный гель и буфер TAE 1". Образцы окрашены с Midori зеленый и гель визуализирован на гель визуализации системы (см. Таблица материалов). Используйте лестницу 1 кбит/с.

Representative Results

Здесь мы представляем подход к изучению плазмидной эволюции путем количественной оценки сохранения плазмидвой пластыря в популяции. Во-первых, мы покажем, как построить плазмид проведения E. coli штамм MG1655 pCON, который впоследствии вводится в эксперимент эволюции. Во-вторых, мы представляем простой метод следованизать за изобилием плазмиды в эволюционирует бактериальных населенностях. Наконец, мы показываем, как визуализировать размер молекулы плазмида и конформацию.

В нашей предыдущей работе8 с использованием представленного подхода мы провели эксперимент эволюции после сохранения устойчивости к антибиотикам плазмиды в кишечной палочке в отсутствие антибиотиков (Рисунок 4). Наши репрезентативные результаты показывают эволюцию популяций при 37 градусах Цельсия и скорости разбавления 10-4. После обилия плазмид-несущих клеток, мы наблюдали снижение частоты плазмид-несущих клеток-хозяев с течением времени(Рисунок 4). Наш подход позволил нам обнаружить, что потеря плазмида была результатом сгущенной плазмидной архитектуры генома, что привело к плазмидной нестабильности, вызванной конфликтами, введенными транскрипцией гена сопротивления и репликацией самой плазмиды. Визуализация молекул плазмида позволила нам обнаружить, что эти конфликты привели к нестабильной плазмидной конформации (т.е. плазмидное мультимерное образование, рисунок 5). Тем не менее, мы наблюдали плазмидную эволюцию стабильности без воздействия антибиотиков(рисунок 4). Эволюция стабильности была присваивается плазмидной внутренней дублирования, которые отменили транскрипции репликации конфликтов и привело к образованию стабильно унаследованных плазмидов. Таким образом, наши результаты демонстрируют важность рекомбинации и усиления генома в адаптивной эволюции генетических элементов.

Figure 1
Рисунок 1: Плазмидный дизайн pCON. Схематическое представление стратегии клонирования, используемой для построения плазмидного пкОН. Плазменный позвоночник (pBBR1) и ген устойчивости кантибиотикам (nptII) усиливаются и сливается с изотермальным синтезом20. Это дает плазмид pCON и штамм MG1655 pCON. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Дизайн долгосрочного эксперимента по эволюции. Схематическое представление эксперимента по серийному переводу. Популяции плазмид-несущих (pCON) покрываются селективными носителями. Колонии предков случайным образом выбираются из пластины и вводятся в систему серийного перевода. Переводы осуществляются с тремя различными подходами разбавления для имитации узких мест популяции различных размеров. Разбавления последовательно повторяются. Эксперимент проводится в двух температурных режимах. Частота плазмид-хозяина измеряется вдоль эксперимента с помощью реплики покрытия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Реплика покрытие. Схематическое представление шагов, используемых в репликации покрытия бактериальных популяций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Частота pCON представителя с течением времени. Настойчивость pCON показана как доля хостов (репрезентативных популяций репликации) в ходе эксперимента по эволюции. Для 98 переносов популяции плазмидных пластов pCON развивались в неселективных условиях с коэффициентом разбавления 10-4. Все репликации, несущие плазмидный пкон, уменьшились в популяции. После этого население подвергалось воздействию антибиотиков для ночной инкубации и вновь культивировалось в неселективных условиях для проверки на эволюцию плазмидной стабильности. Эта цифра была изменена с Wein et al.8Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Представительный анализ плазмидной конформации. Визуализация модели плазмид pCON. Визуализирована необработанная плазмидная ДНК сразу после извлечения, линейной плазмидной ДНК и обработана DNase, которая только режет хромосомную ДНК, а также ферментативно порезанные ДНК (т.е. открытый круг плазмидной ДНК). Линейная плазмида показывает, что все плазмиды имеют одинаковый размер. Удаление хромосомной ДНК и nicking pCON показывает наличие димеров и других мультимер. Эта цифра была изменена с Wein et al.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

В этом протоколе мы представляем подход, который сочетает в себе методы в молекулярной биологии, экспериментальной эволюции и визуализации ДНК, чтобы исследовать роль плазмидной эволюции для сохранения устойчивости к антибиотикам у бактерий. Хотя представленный подход сочетает в себе методы из различных областей исследований, все прикладные методы являются простыми и могут быть выполнены в стандартной микробиологической лаборатории.

Наиболее важными шагами в протоколе являются построение штамма модели системы, который включает в себя генетическую проверку генотипа плазмид-переноски. Примечательно, что многие плазмиды естественным образом кодируют гены устойчивости к антибиотикам. Таким образом, читатель может пропустить шаг 1 протокола и непосредственно приступить к шагу 2. Далее, эксперименты по эволюции должны включать в себя случайный дизайн реплицитных популяций, чтобы результаты не были предвзятыми положением реплицитных популяций в глубокой скважине. Кроме того, особенно важно тщательно проводить последовательные шаги передачи и разбавления в эксперименте эволюции, так как загрязнение фальсифицировало бы результаты. Наконец, реплики покрытие должно быть проведено с большой осторожностью. Большой размер колонии может быть проблемой, но его можно избежать, инкубируя пластины менее чем за 24 ч. Аналогичным образом, количество колоний на одной пластине может смещения реплики результатов покрытия. Поэтому популяции необходимо разбавлять до покрытия и репликации.

Одним из самых больших преимуществ нашего подхода является то, что это может быть легко воспроизведены без необходимости тяжелого оборудования. Кроме того, еще одним преимуществом реплики покрытия следовать маркер генов является то, что только живые клетки оцениваются, в отличие от потока цитометрии или qPCR, в котором мертвые клетки могут быть оценены как живые. Таким образом, реплика покрытия вводит меньше предвзятости к подсчету плазмид-несущих клеток. Тем не менее, одним из ограничений покрытия реплики может быть размер популяции (т.е. номер ячейки), который можно оценить в одном экспериментальном запуске.

Используя наш подход, мы недавно показали, что плазмидная эволюция стабильности потецекет сохранение генов устойчивости к антибиотикам в бактериях. Таким образом, мы разработали подход в качестве инструмента для последующей плазмид-опосредованной устойчивости настойчивость, которая имеет большое значение для последующей устойчивости с течением времени, особенно в условиях без присутствия антибиотиков.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Благодарим Гора Маргаряна за творческую поддержку и техническую помощь. Эта работа была поддержана Грантом молодых ученых в 2017/2018 (награжден TW) и фокус-программой DFG 1819 (Грант No. DA1202/2-1 присужденt tD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-deep-well plates Starlab
96-deep-well plates Roth EN07.1 2 ml, square
96-deep-well plates (cryo) Starlab E1702-8400 Micro-Dilution Tube System
Colony counter Stuart SC6+
Cotton velvet drapery shop 100 % cotton required
Electrophoresis chamber BioRad Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis power supply BioRad 1645070 Agarose gel electrophoresis
Electroporation cuvettes BioRad 1652089 0.1 cm
Electroporator BioRad 1652660
GeneJet Gel Extraction kit Thermo Fisher Scientific K0832 PCR fragment clean-up
GeneJet Plasmid Miniprep kit Thermo Fisher Scientific K0503 Plasmid extraction kit
Gibson Assembly New England Biolabs E2611S
Incubator Thermo Fisher Scientific 50125852
Incubator (plate shaker) Heidolph 1000
Incubator (shaker) New Brunswick Scientific Innova 44
Inoculating loops Sigma-Aldrich
Multi-channel pippetes Eppendorf 3125000052, 3125000028
Multi-channel pippetes Capp ME8-1250R
NanoDrop 2000/2000c Thermo Fisher Scientific ND2000
Oligonucleotides Eurofines
Petri dishes Sigma-Aldrich
Phusion Polymerase Thermo Fisher Scientific F533S
Pipettes Eppendorf 3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063,
PlasmidSafe enzyme Epicentre 10059400
Reaction tubes Eppendorf 30125150
Replica block & metal ring VWR 601-3401 PVC cylinder 69 mm; ring 102cm
Resctriction enzymes New England Biolabs
Thermocycler BioRad T100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. San Millan, A. Evolution of plasmid-mediated antibiotic resistance in the clinical context. Trends in Microbiology. 26, (12), 978-985 (2018).
  2. Bruto, M., James, A., et al. Vibrio crassostreae, a benign oyster colonizer turned into a pathogen after plasmid acquisition. The ISME Journal. 11, (4), 1043-1052 (2017).
  3. von Wintersdorff, C. J. H., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, (110), 305-310 (2016).
  4. Lenski, R. E. Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations. ISME Journal. 11, (10), 2181-2194 (2017).
  5. De Gelder, L., Williams, J. J., Ponciano, J. E. M., Sota, M., Top, E. M. Adaptive plasmid evolution results in host-range expansion of a broad-host-range plasmid. Genetics. 178, (4), 2179-2190 (2008).
  6. Harrison, E., Guymer, D., Spiers, A. J., Paterson, S., Brockhurst, M. A. Parallel compensatory evolution stabilizes plasmids across the parasitism-mutualism continuum. Current Biology. 25, (15), 2034-2039 (2015).
  7. Bouma, J. E., Lenski, R. E. Evolution of a bacteria/plasmid association. Nature. 335, (6188), 351-352 (1988).
  8. Wein, T., Hülter, N. F., Mizrahi, I., Dagan, T. Emergence of plasmid stability under nonselective conditions maintains antibiotic resistance. Nature Communications. 10, (1), 2595 (2019).
  9. Loftie-Eaton, W., et al. Compensatory mutations improve general permissiveness to antibiotic resistance plasmids. Nature Ecology & Evolution. 1, (9), 1354-1363 (2017).
  10. Millan, A. S., et al. Positive selection and compensatory adaptation interact to stabilize non-transmissible plasmids. Nature Communications. 5, (1), 1-11 (2014).
  11. Loftie-Eaton, W., Tucker, A., Norton, A., Top, E. M. Flow cytometry and real-time quantitative PCR as tools for assessing plasmid persistence. Applied and Environmental Microbiology. 80, (17), 5439-5446 (2014).
  12. Münch, K. M., et al. Polar fixation of plasmids during recombinant protein production in Bacillus megaterium results in population heterogeneity. Applied and Environmental Microbiology. 81, (17), 5976-5986 (2015).
  13. Jahn, M., Vorpahl, C., Hübschmann, T., Harms, H., Müller, S. Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR. Microbial Cell Factories. 15, (1), 211 (2016).
  14. Lederberg, J., Lederberg, M. E. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. Journal of Bacteriology. 63, 399-406 (1952).
  15. Summers, D. K., Sherratt, D. J. Multimerization of high copy number plasmids causes instability: ColE1 encodes a determinant essential for plasmid monomerization and stability. Cell. 36, (4), 1097-1103 (1984).
  16. Summers, D. K., Beton, C. W., Withers, H. L. Multicopy plasmid instability: the dimer catastrophe hypothesis. Molecular Microbiology. 8, (6), 1031-1038 (1993).
  17. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166, (4), 557-580 (1983).
  18. Ilhan, J., et al. Segregational drift and the interplay between plasmid copy number and evolvability. Molecular Biology and Evolution. 36, (3), 472-486 (2019).
  19. Beck, E., Ludwig, G., Auerswald, E. A., Reiss, B., Schaller, H. Nucleotide sequence and exact localization of the neomycin phosphotransferase gene from transposon Tn5. Gene. 19, (3), 327-336 (1982).
  20. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, (5), 343-345 (2009).
Количественная оценка плазмидно-опосредованного устойчивости к антибиотикам в экспериментальном подходе к эволюции
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wein, T., Stücker, F. T., Hülter, N. F., Dagan, T. Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach. J. Vis. Exp. (154), e60749, doi:10.3791/60749 (2019).More

Wein, T., Stücker, F. T., Hülter, N. F., Dagan, T. Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach. J. Vis. Exp. (154), e60749, doi:10.3791/60749 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter