本手稿描述了一种基于基因组规模的细胞筛选方法,用于识别细胞外受体-配体相互作用。
膜嵌入细胞表面受体之间的直接相互作用促进的细胞间通信对多细胞生物的正常发育和功能至关重要。然而,检测这些交互在技术上仍然具有挑战性。本手稿描述了一种系统基因组级CRISPR/Cas9敲除基因筛选方法,揭示了特定细胞表面识别事件所需的细胞通路。该测定利用哺乳动物蛋白表达系统中产生的重组蛋白作为狂热的结合探针,在基于细胞的基因筛选中识别相互作用伙伴。该方法可用于识别与膜嵌入受体的分面相对应的重组结合探针检测到的细胞表面相互作用所需的基因。重要的是,鉴于这种方法的基因组规模性质,它不仅具有识别直接受体的优点,而且还可以识别在细胞表面呈现受体所需的细胞成分,从而为受体生物学提供有价值的见解。
细胞表面受体蛋白的细胞外相互作用直接重要的生物过程,如组织组织、宿主病原体识别和免疫调节。研究这些相互作用是更广泛的生物医学界感兴趣的,因为膜受体是系统传递的治疗,如单克隆抗体的可操作的目标。尽管这些互动很重要,但研究这些互动在技术上仍然具有挑战性。这主要是因为膜嵌入受体是两栖的,使它们难以从生物膜分离进行生化操作,并且它们的相互作用被弱相互作用的亲和力(μM-mM范围内的KDs)1典型化。1因此,许多常用的方法不适合检测这种类蛋白质相互作用11,2。2
已经开发出一系列方法,专门研究细胞外受体-配体相互作用,考虑其独特的生化特性3。其中一些方法包括将受体的整个异域作为哺乳动物或昆虫细胞基系统中的可溶性重组蛋白表达,以确保这些蛋白质含有在结构上很重要的翻译后修饰,如甘油和二硫化物键。为了克服低亲和力绑定,异域经常被寡头化,以增加其绑定狂热。Avid蛋白异域已成功地用作结合探针,以识别直接重组蛋白-蛋白质相互作用屏幕44、5、6、75,6,7中的相互作用伙伴。虽然广泛成功,但重组蛋白基方法要求将膜受体的异域作为可溶性蛋白质产生。因此,它仅适用于包含连续细胞外区域(例如单通道 I 型、II 型或 GPI 锚定)的蛋白质,通常不适用于多次跨越膜的受体复合物和膜蛋白。
表达克隆技术,其中补充DNA(cDNAs)库被转染成细胞,并测试结合型获得,也用于识别细胞外蛋白质-蛋白质相互作用8。近年来,大量克隆和测序的cDNA表达质粒的提供,为细胞系过度表达cDNA编码细胞表面受体的方法提供了便利,以筛选重组蛋白的结合,以识别相互作用9,9,10。与基于重组蛋白的方法不同,基于cDNA的过度表达方法提供了识别等离子膜中相互作用的可能性。然而,使用 cDNA 表达结构的成功取决于细胞以正确折叠的形式过度表达蛋白质的能力,但这通常需要细胞辅助因子,如运输机、护工和正确的寡聚物组装。因此,排泄单个cDNA可能不足以实现细胞表面表达。
使用cDNA结构或重组蛋白探针的筛选技术是资源密集型的,需要大量的cDNA或重组蛋白库。最近采用了专门设计的基于质谱的方法来识别不需要组装大型库的细胞外相互作用。然而,这些技术需要对细胞表面进行化学操作,这可以改变细胞表面分子的生化性质,目前仅适用于由糖基化蛋白11、12,12介导的相互作用。目前可用的大多数方法也严重关注蛋白质之间的相互作用,而在很大程度上忽略了膜微环境的贡献,包括糖甘、脂质和胆固醇等分子。
最近使用CRISPR方法开发高效双乙醚靶向,使缺乏定义基因的细胞的基因组库能够以系统和公正的方式筛选出涉及不同背景的细胞成分,包括解剖细胞信号过程、识别对药物、毒素和病原体产生抗药性的扰动,并确定抗体的特异性13、14、15、16。13,14,15,16在这里,我们描述了一种基于基因组规模的CRISPR敲除细胞筛选测定方法,它提供了替代当前生物化学方法,以识别细胞外受体-配体相互作用。这种通过遗传屏幕识别膜受体介导的相互作用的方法特别适用于对单个配体有关注力的研究人员,因为它避免了编译大量cDNA或重组蛋白库的需要。
该测定包括三个主要步骤:1) 高度狂热的重组蛋白结合探针,由感兴趣的受体的细胞外区域组成,产生并用于基于荧光的流细胞测量结合测定;2) 结合测定用于识别表示重组蛋白探针相互作用伙伴的细胞系;3) 生成与感兴趣的蛋白质相互作用的Cas9表达型细胞系,并执行基于基因组规模的CRISPR/Cas9的敲除屏幕(图1)。在这个遗传屏幕中,将重组蛋白与细胞系结合用作可测量的表型,其中,在挖空库中失去结合探针能力的细胞使用基于荧光的活性细胞分拣(FACS)和导致通过测序识别的结合表型丢失的基因进行排序。原则上,识别编码负责结合狂热探针的受体的基因及其细胞表面显示所需的基因。
该协议的第一步是生产代表膜结合受体的异域的avid重组蛋白探针。众所周知,当这些受体的异体被表达为重组可溶性蛋白1时,它们经常保持其细胞外结合功能。对于感兴趣的蛋白质,可溶性重组蛋白可以在任何合适的真核蛋白表达系统中以任何格式产生,前提是它可以进行寡聚,以增强结合性,并且它包含可用于荧光流细胞测定(例如,FLAG-tag,生物素标签)的标签。使用HEK293蛋白表达系统生产膜受体可溶性异域的详细协议,以及不同的多美化技术和用于生产五角蛋白和单体蛋白的蛋白质表达结构,此前已描述过,1,17。此处的协议将描述从单体生物微化蛋白中产生荧光avid探针的步骤,将它们结合到氟铬(例如,植物素或PE)中,这些链球菌结合在一起,可以直接用于基于细胞的结合测定,其优点是不需要二次抗体进行检测。执行基因组尺度屏幕的一般协议已经描述了20,21,因此该协议主要侧重于使用CRISPR/Cas9敲除筛选系统使用CRISPR/Cas9敲除筛选系统使用人类V1(”Yusa”)库18执行流细胞学重组蛋白结合屏幕的细节。20,
介绍了基于CRISPR的筛选策略,用于识别编码细胞识别中涉及的细胞成分的基因。使用CRISPR活化的类似方法也提供了一种基因替代品,可以识别重组蛋白的直接相互作用受体,而无需生成大型蛋白质库26。然而,这种方法的一个主要优点是,它适用于由细胞上本地显示的表面分子介导的相互作用,并且不依赖于受体的过度表达,从而影响受体的结合性。因此,与其他方法不同,该技术对受体的生化性质或细胞生物学没有作任何假设,并且提供了一个机会来研究通常难以使用生化方法(如非常大的蛋白质)或多次穿过膜或与其他蛋白质形成复合物的蛋白质(如甘油、糖脂和磷脂等蛋白质)等分子介导的相互作用。鉴于该方法的基因组规模性质,这种方法不仅具有识别受体的优点,而且具有结合事件所需的额外细胞成分的优点,从而提供对受体细胞生物学的见解。
当使用这种方法来识别孤立蛋白的受体时,这种方法的主要局限性之一是首先确定与蛋白质结合的细胞系的初始要求。这并不总是容易的,识别显示结合表型的细胞行,该表型也允许遗传屏幕,这可能是部署此测定的时间限制步骤。有些细胞系往往与其他细胞系的蛋白质结合更多。这与结合 HS 的蛋白质特别相关,因为这些蛋白质倾向于与显示 HS 侧链的任何细胞系结合,而不考虑本机结合上下文。此外,我们观察到,在细胞系中提高合成酶(即含有HS的蛋白细胞)的调节,导致HS结合蛋白26的结合增加。在选择用于筛查的细胞系时,这可能是需要考虑的一个因素。然而,需要注意的还有,HS的添加剂结合不会干扰对特定受体的结合。这意味着,如果观察到绑定,则可能完全由 HS 进行中介,因为 HS 在此测定中介导的绑定是累加的,而不是共依赖19。在这种情况下,描述的肝素阻断方法可以识别此类行为,而无需执行完整的遗传筛查。
选择细胞系的有用资源是细胞模型Passport,它包含基因组学、转录组学和培养条件信息,用于+1,000个癌细胞系27。根据生物背景,可以根据细胞的表达特征选择细胞。为了帮助选择细胞系,我们根据1,500个预先批注的人类细胞表面糖蛋白28的表达,在细胞模型Passport中聚集了1,000个细胞系(补充图2;每个细胞系的簇信息以及生长条件在补充表2中提供)。测试具有未知功能的蛋白质的结合时,从每个簇中选择一组具有代表性的细胞系以增加覆盖各种受体的机会非常有用。如果可以选择一种选择,建议选择易于培养且易于转导的细胞系。由于这些细胞系将用于基因组规模筛选,因此最好能大量轻松生长,并放任扁病毒转导,因为它是在后续步骤中为CRISPR基因筛查提供sgRNA的最常用方法。
通常,表型选择以单一排序进行。但是,这是由染色细胞群与对照的亮度决定的。对于所需表型的信噪比低或屏幕的目的是识别具有强表型的突变体的情况,可以采用迭代轮选择。当对基于 FACS 的屏幕使用迭代选择方法时,必须考虑分拣过程可能导致细胞死亡,这主要是由于分拣机的纯力。因此,并非所有收集的单元格都将在下一轮排序中表示。
库的复杂性是执行成功的遗传屏幕的一个非常重要的因素,尤其是对于负选择屏幕,因为这些屏幕的耗竭程度只能通过将结果与起始库中的结果进行比较来确定。对于负选择屏幕,通常维护 500-1,000 x 复杂性的库。但是,正选择屏幕对库大小更强,因为在这样的屏幕中,预计只有少量突变体被选定为特定的表型。因此,在此描述的正选择屏幕中,库大小可以减小到 50-100 倍的复杂性,而不会影响屏幕的质量。此外,在这些屏幕中,还可以对给定的单元格行在给定的一天使用控制库,作为当天为给定单元格行排序的所有样本的”常规控制”。这将减少需要生成和排序的控制库的数量。
使用这种方法的另一个重要考虑因素是功能丧失屏幕在确定对体外细胞生长至关重要的基因方面的局限性。屏幕的时机在这方面至关重要,因为突变细胞在培养中保存的时间越长,基本基因突变的细胞变得不可行且不再在突变库中表示的可能性就越大。最近作为项目评分倡议的一部分在300多个细胞系中执行的基因筛选显示,KEGG批注蛋白分泌和N-糖基化途径中的多个基因通常被确定为对一些细胞系至关重要(补充图3)29。29如果要在细胞识别过程中研究增殖和生存能力所需的基因的影响,则可以在设计屏幕时考虑到这一点。在这种情况下,在早期时间点(例如,转染后第 9 天)进行屏幕通常适用。但是,如果该方法用于识别具有强尺寸效应而非一般细胞通路的几个目标,则在以后的时间点(例如,转染后的第 15-16 天)执行屏幕可能比较合适。
筛查结果非常强劲;在过去进行的8个重组蛋白结合屏幕中,细胞表面受体在每种情况下都是19次点击。因此,当使用这种方法识别相互作用伙伴时,人们应该期望在表面上发现导致其呈现的受体和因素,从而具有很高的统计可信度。一旦屏幕执行,并使用单个 gRNA 敲除验证命中,可以使用现有的生化方法(如 AVEXIS4)进行进一步的后续操作,并使用表面质质子共振直接对纯化蛋白进行饱和结合。此处描述的方法适用于所有可能生成可溶性重组结合探针的蛋白质。
总之,这是一种基因组级CRISPR敲除方法,用于识别由细胞表面蛋白质介导的相互作用。这种方法通常适用于识别细胞表面识别所需的细胞通路,在广泛的不同生物背景下,包括生物体自己的细胞(如神经和免疫学识别)之间,以及宿主细胞和病原体蛋白之间。这种方法为为受体识别设计的生化方法提供了一种基因替代,因为它不需要事先对受体的生化性质或细胞生物学进行任何假设,因此它有很大的潜力做出完全意想不到的发现。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了授予GJW的威康信托赠款号206194的支持。我们感谢细胞学核心设施:蜂玲Ng,詹妮弗格雷厄姆,山姆汤普森和克里斯托弗霍尔帮助FACS。
Anti-mouse alkaline phosphatase | Sigma | A4656 | |
Blasticidin | Chem-Cruz | SC-204655 | |
Blood & Cell Culture DNA Maxi Kit | Qiagen | 13362 | |
BSA | Sigma | A9647-100G | |
Diethanolamine | Sigma | 398179 | |
DMEM | Gibco | 31966-021 | |
Dneasy Blood and Tissue kit | Qiagen | 69504 | |
DynaMag-96 Side Magnet | Invitrogen | 12331D | |
HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | |
Heparin | Sigma | H4784-1G | |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa | KK2602 | |
Lipofectamine LTX with PLUS reagent | Invitrogen | 15338100 | |
MoFlo XDP cell sorter | BD | ||
Ni2+-NTA agarose beads | Jena Bioscience | AC-501-25 | |
OPTI-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
OX-68 antibody | AbD Serotec | MCA1022R | |
p-nitrophenyl phosphate | Sigma | 1040-506 | |
PD-10 desalting columns | GE healthcare | 17085101 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
Polypropylene tubes with 5 mL bed volume | Qiagen | 34964 | |
Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 3115879001 | |
Puromycin | Gibco | A11138-03 | |
Q5 Hot Start High-Fidelity 2× Master Mix | NEB | M0494L | |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
SCFA filter | Nalgene | 190-2545 | |
Sony Cell sorter | Sony | ||
SPRI beads (Agencourt AMPure XP beads) | Beckman | A63881 | |
Streptavidin-coated microtitre plates | Nalgene | 734-1284 | |
Streptavidin-PE | Biolegend | 405204 |