Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Cell Surface Reseptor identifikasjon ved hjelp av genom-skala CRISPR / Cas9 genetiske skjermer

Published: June 6, 2020 doi: 10.3791/60803
Automatic Translation
1,2, 1
1Cell Surface Signalling Laboratory, Wellcome Trust Sanger Institute, 2EMBL-EBI, Wellcome Genome Campus

Summary

Dette manuskriptet beskriver en genom-skala celle-basert screening tilnærming for å identifisere ekstracellulære reseptor-ligand interaksjoner.

Abstract

Intercellulær kommunikasjon mediert av direkte interaksjoner mellom membraninbygde celleoverflatereseptorer er avgjørende for normal utvikling og funksjon av flercellede organismer. Det er imidlertid fortsatt teknisk utfordrende å oppdage disse interaksjonene. Dette manuskriptet beskriver en systematisk genom-skala CRISPR / Cas9 knockout genetisk screening tilnærming som avslører cellulære veier som kreves for bestemte celleoverflategjenkjenning hendelser. Denne analysen benytter rekombinante proteiner produsert i et pattedyrproteinuttrykkssystem som ivrige bindingssonder for å identifisere interaksjonspartnere i en cellebasert genetisk skjerm. Denne metoden kan brukes til å identifisere genene som er nødvendige for celleoverflateinteraksjoner oppdaget av rekombinant bindingssonder som tilsvarer ectodomains av membraninerte reseptorer. Viktigere, gitt genom-skala natur denne tilnærmingen, det har også fordelen av ikke bare å identifisere direkte reseptoren, men også de cellulære komponenter som er nødvendige for presentasjon av reseptoren på celleoverflaten, og dermed gi verdifull innsikt i biologien til reseptoren.

Introduction

Ekstracellulære interaksjoner av celleoverflatereseptorproteiner styrer viktige biologiske prosesser som vevsorganisasjon, vertspatogengjenkjenning og immunregulering. Å undersøke disse interaksjonene er av interesse for det bredere biomedisinske samfunnet, fordi membranreseptorer er handlingsrettede mål for systematisk leverte terapeutiske midler som monoklonale antistoffer. Til tross for deres betydning, studere disse interaksjonene er fortsatt teknisk utfordrende. Dette skyldes hovedsakelig at membraninbygde reseptorer er amfipatiske, noe som gjør dem vanskelige å isolere fra biologiske membraner for biokjemisk manipulasjon, og deres interaksjoner er preget av de svake interaksjonsaffinitetene (KDs i μM-mM-området)1. Følgelig er mange vanlige metoder uegnet til å oppdage denne klassen av proteininteraksjoner1,2.

En rekke metoder er utviklet for å spesifikt undersøke ekstracellulære reseptor-ligand interaksjoner som tar sine unike biokjemiske egenskaper i betraktning3. En rekke av disse tilnærmingene innebærer å uttrykke hele ectodomain av en reseptor som et løselig rekombinant protein i pattedyr eller insektcellebaserte systemer for å sikre at disse proteinene inneholder posttranslational modifikasjoner som er strukturelt viktige, som glyker og disulfidbindinger. For å overvinne lavaffinitetsbindingen, er ekodomene ofte oligomerisert for å øke deres bindende ivrighet. Ivrige proteinectodomainer har blitt brukt som bindende sonder for å identifisere interaksjonspartnere i direkte rekombinant protein-protein interaksjon skjermer4,,5,6,7. Mens bredt vellykket, rekombinant protein-baserte metoder krever at ectodomain av en membranreseptor produseres som et oppløselig protein. Derfor gjelder det bare generelt for proteiner som inneholder en sammenhengende ekstracellulær region (f.eks. enkeltpasstype I, type II eller GPI-forankret) og er vanligvis ikke egnet for reseptorkomplekser og membranproteiner som strekker seg over membranen flere ganger.

Uttrykk kloning teknikker der et bibliotek av komplementære DNAer (cDNAs) er transfected inn i celler og testet for en gain-of-binding fenotype har også blitt brukt til å identifisere ekstracellulære protein-protein interaksjoner8. Tilgjengeligheten av store samlinger av klonet og sekvensert cDNA uttrykk plasmids de siste årene har tilrettelagt metoder der cellelinjer overexpressing cDNAs koding celleoverflate reseptorer er screenet for binding av rekombinant proteiner for å identifisere interaksjoner9,10. CDNA overuttrykksbaserte tilnærminger, i motsetning til rekombinante proteinbaserte metoder, gir mulighet til å identifisere interaksjoner i sammenheng med plasmamembranen. Imidlertid avhenger suksessen med å bruke cDNA-uttrykkskonstruksjoner av cellenes evne til å overuttrykke proteinet i riktig foldet form, men dette krever ofte cellulære tilbehørsfaktorer som transportører, chaperoner og riktig oligomerisk montering. Transfisere en enkelt cDNA kan derfor ikke være nok til å oppnå celleoverflateuttrykk.

Screeningteknikker ved hjelp av cDNA-konstruksjoner eller rekombinante proteinprober er ressurskrevende og krever store samlinger av cDNA eller rekombinante proteinbiblioteker. Spesielt utformede massespektrometribaserte metoder har blitt brukt nylig for å identifisere ekstracellulære interaksjoner som ikke krever montering av store biblioteker. Imidlertid krever disse teknikkene kjemisk manipulering av celleoverflaten, noe som kan endre molekylenes biokjemiske natur som er tilstede på overflaten av cellene og gjelder for tiden bare for interaksjoner mediert av glykosylert proteiner11,12. De fleste av de tilgjengelige metodene fokuserer også tungt på samspillet mellom proteiner, samtidig som de ignorerer bidraget fra membranmikrmiljøet, inkludert molekyler som glyner, lipider og kolesterol.

Den nylige utviklingen av svært effektiv bialleeisk målretting ved hjelp av CRISPR-baserte tilnærminger har gjort det mulig for genom-skala biblioteker av celler som mangler definerte gener i et enkelt basseng som kan screenes på en systematisk og objektiv måte å identifisere cellulære komponenter som er involvert i ulike sammenhenger, inkludert dissekere cellulære signalprosesser, identifisering av perturbations som gir motstand mot narkotika, giftstoffer og patogener, og bestemme spesifisitet av antistoffer13,14,15,16. Her beskriver vi en genom-skala CRISPR-basert knockout celle screening analyse som gir et alternativ til dagens biokjemiske tilnærminger for å identifisere ekstracellulære reseptor-ligand interaksjoner. Denne tilnærmingen til å identifisere interaksjoner mediert av membranreseptorer av genetiske skjermer er spesielt egnet for forskere som har en fokusert interesse på individuelle ligander fordi det unngår behovet for å kompilere store biblioteker av cDNAs eller rekombinant proteiner.

Denne analysen består av tre hovedtrinn: 1) Svært ivrige rekombinant proteinbindingssonder bestående av de ekstracellulære områdene av en reseptor av interesse produseres og brukes i fluorescensbaserte lufttidstoktmetymetribaserte bindingsanalyser; 2) Bindingsanalysene brukes til å identifisere en cellelinje som uttrykker interaksjonspartneren til den rekombinante proteinsonden; 3) En Cas9-uttrykksversjon av cellelinjen som samhandler med proteinet av interesse produseres og en genom-skala CRISPR / Cas9-basert knockout skjermen utføres (Figur 1). I denne genetiske skjermen brukes binding av et rekombinant protein til cellelinjer som en målbar fenotype der celler i knockout-biblioteket som har mistet evnen til å binde sonden, sorteres ved hjelp av fluorescensbasert aktivert cellesortering (FACS) og genene som forårsaket tapet av bindingsfenotypen identifisert ved sekvensering. I prinsippet identifiseres genene som koder reseptoren som er ansvarlig for binding av den ivrige sonden, og de som kreves for celleoverflaten, identifiseres.

Det første trinnet i denne protokollen innebærer produksjon av ivrige rekombinantproteinprober som representerer ektodomenet til de membranbundne reseptorene. Disse reseptorene er kjent for å ofte beholde sine ekstracellulære bindingsfunksjoner når deres ectodomainer uttrykkes som et rekombinant løselig protein1. For et protein av interesse, løselig rekombinant proteiner kan produseres i et egnet eukaryotisk protein uttrykk system i alle formater forutsatt at det kan oligomerized for økt binding aviditet, og den inneholder koder som kan brukes i fluorescens-basert strømning cytometri-baserte bindingsanalyser (f.eks, FLAG-tag, biotin-tag). Detaljerte protokoller for produksjon av løselige ectodomainer av membranreseptorer ved hjelp av HEK293 proteinuttrykkssystemet, samt ulike multimeriseringsteknikker og proteinuttrykket konstruerer for produksjon av både pentameriske proteiner og monomeriske proteiner har tidligere blitt beskrevet1,17. Protokollen her vil beskrive trinnene for å generere fluorescerende ivrige sonder fra monomeriske biotinylert proteiner ved å konjugere dem til streptavidin konjugert til en fluorokrom (f.eks. phycoerythrin, eller PE), som kan brukes direkte i cellebaserte bindingsanalyser og har fordelen av å ikke kreve et sekundært antistoff for deteksjon. Generelle protokoller for å utføre genom-skala skjermer har allerede blitt beskrevet20,21, dermed protokollen hovedsakelig fokusere på detaljene i å utføre flow cytometri-baserte rekombinant protein binding skjermer ved hjelp av CRISPR / Cas9 knockout screening system ved hjelp av Human V1 ("Yusa") bibliotek18.

Protocol

1. Produksjon og rensing av biotinylerte hans-merkede proteiner

  1. Bruk et pattedyr eller insektcellebasert proteinuttrykkssystem til å produsere løselige rekombinant Hans-merkede biotinylert proteiner (se plasmidkonstruksjoner i tabell 1).
    MERK: En detaljert protokoll for produksjon av monomeriske biotin og his-merkede proteiner ved hjelp av HEK293 celleuttrykkssystemet er beskrevet av Kerr et al.17. Proteinectodomainer uttrykt ved hjelp av HEK293-uttrykkssystemet utskilles i kulturmediet.
  2. Samle opp de løselige proteinene ved å pellet cellene ved sentrifugering ved 3000 x g i 20 min.
  3. Filtrer supernatanten gjennom et 0,22 μm filter og tilsett Ni2+-NTA agaroseperlene til det filtrerte proteinsupernatanten i et 1:1000-forhold (dvs. 50 μL av 50% agarose slurry i 50 ml supernatant). Inkuber over natten eller minst 4-5 timer ved 4 °C på en roterende plattform.
  4. Vask polypropylenkolonnen ved å legge til 5 ml vaskebuffer for rensing. Se tabell 2 for alle bufferkomposisjoner.
  5. Hell hele perle-protein supernatant blandingen i kolonnen. Perler vil akkumuleres ved basen.
  6. Vask perlene 2x med 15 ml vaskebuffer. For å unngå proteinfortynning må du forsiktig trekke restvaskebufferen fra kolonnen med en 5 ml sprøyte og kaste den.
  7. Tilsett forsiktig 300-500 μL av hansrensingsgraveringsbuffer direkte til perlene og inkuber i minst 1 h. Samle det eluterte proteinet ved igjen å tegne ut væsken forsiktig ved hjelp av en 1 ml sprøyte. Utveksle elutionbufferen til ønsket buffer (f.eks. vanligvis PBS eller HBS) ved hjelp av avsaltingskolonner. Oppbevar alle proteiner ved 4 °C til videre bruk.

2. Kvantifisering og oligomerisering av monomerisk biotinylert protein

MERK: For å øke bindingen aviditet, oligomerisere biotinylert monomeriske proteiner på tetrameric streptavidin-PE før du bruker dem i bindende analyser. Oppnå optimale konjugeringsforhold av monomeriske proteiner og tetrameric streptavidin-PE ved å teste en fortynningsserie av biotinylert monomer mot en fast konsentrasjon av streptavidin og ved empirisk å etablere minimum fortynning der ingen overflødige biotinylert monomerer kan oppdages.

  1. Lag minst åtte serielle fortynninger av biotinylert proteinprøver ved hjelp av en passende fortynningsbuffer (enten PBS eller HBS med 1 % storfe serumalbumin [BSA]) i en 96-brønnplate. Sørg for at det endelige volumet av hver fortynning er minst 200 μL.
  2. Lag en duplisert plate av prøvene ved å fjerne 100 μL fra hver brønn og overføre til en ny 96 brønnplate. Ha alltid en kontroll. I dette tilfellet kontroller er tag-bare proteiner (dvs. biotinylated Hans-merket Cd4 domene 3 +4 protein). Dette vil bli brukt som en kontrollsonde i alle bindingsanalyser.
  3. Fortynn streptavidin-PE til 0,1 μg/ml i fortynningsbufferen.
  4. På bare en av platene, tilsett 100 μL av den fortynnede streptavidin-PE. Duplikatplaten vil fungere som en kontroll. Tilsett 100 μL fortynningsbuffer i kontrollplaten for å utjevne volumer.
  5. Inkuber i 20 min ved romtemperatur (RT). I mellomtiden blokkerer du brønnene til en streptavidinbelagt plate med fortynningsbufferen i 15 min.
  6. Overfør det totale volumet av prøven fra begge platene til individuelle brønner av de streptavidinbelagte platene og inkuber i 1 timer ved RT.
  7. Vask platen 3x med 200 μL vaskebuffer (dvs. enten PBS eller HBS med 0,1% Tween-20, 2% BSA). Tilsett 100 μL av 2 μg/ml mus anti-rotte Cd4d3+4 IgG (OX68) og inkuber i 1 timer ved RT.
  8. Vask platen 3x med vaskebufferen. Tilsett 100 μL av en alkalisk fosfatasekonjugat med antimus alkalisk fosfatase ved 0,2 μg/ml i 1 timer ved RT.
  9. Vask platen 3x med vaskebuffer og 1x i fortynningsbuffer.
  10. Forbered p-nitrophenylfosfat ved 1 mg/ml i diethanolaminbuffer. Tilsett 100 μL i hver brønn og inkuber i 15 min.
  11. Ta absorbansemålinger på 405 nm. Bruk minimumsfortynning der det ikke er noe signal på platen som riktig fortynningsfaktor for å skape tetramers (figur 2).
  12. Lag en 10x tetramer fargingsløsning for alle prøver og kontroller ved å inkubere 4 μg/ml streptavidin-PE og riktig biotinylert proteindilusjon i 30 min ved RT. Oppbevar konjugerte proteiner i et lysbeskyttet rør ved 4 °C inntil videre bruk.

3. Flow cytometribaserte cellebindingsanalyser

  1. For tilhørende celler, fjern kulturmedier og vask 1x med PBS uten divalent kationer. Legg deretter til celleavløsningsløsninger (f.eks. EDTA). La cellene løsne i 5-10 min. Trykk forsiktig på kolben for å frigjøre cellene.
    MERK: Unngå å bruke trypsinbaserte produkter, da de kan holde celleoverflateproteiner.
  2. Samle frittliggende celler i et rør. For celler som vokser i suspensjon (f.eks HEK293 celler), samle cellene direkte fra kulturflasker inn i et rør.
  3. Pelletceller ved 200 x g i 5 min. Fjern den supernatant og resuspend pellet i vaskebuffer (dvs. PBS/1% BSA).
  4. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer og juster konsentrasjonen til 2,5 x 105-1 x 106 celler/ml. Aliquot 100 μL tilberedt celleblanding på en 96 brønn U- eller V-bunnplate. Spinn platen i 5 min ved 400 x g. Fjern supernatanten med en flerkanals pipette.
  5. Tilsett 100 μL normalisert fluorescerende merket svært ivrige proteinprober og kontroller i de tidligere tilberedte platene med celler og inkuber i 1 timer ved 4 °C. Etter binding i 1 time, spinn platen ved 400 x g i 5 min.
  6. Fjern supernatanten og tilsett 200 μL vaskebuffer (dvs. PBS/1% BSA). Bland godt ved å pipe opp og ned.
  7. Pellet cellene ved sentrifugering ved 400 x g i 5 min. Gjenta vasketrinn 1x. Etter to vasker, fjern helt supernatant og resuspend cellen pellet i 100 μL PBS.
  8. Analyser cellene etter strømningscytometri. Bruk den gulgrønne laseren (dvs. 561 nm) for å oppdage PE-fluorescens.
    1. Først analysere cellene som har blitt farget med kontrollsonden. Basert på fordelingen av PE fluorescens, tegn en port for bindende populasjon slik at ikke mer enn 1% av kontrollcellen faller i denne porten.
    2. Analyser prøven og bestem brøkdelen av celler som faller i bindingsporten.
      MERK: Cellelinjer som viser en høyere bindende populasjon, er ønsket for genetiske skjermer, da de har et høyere signal-til-støy-forhold. Ideelt sett bør over 80% av cellene falle innenfor denne porten.

4. Bestemme bindende bidrag fra varmelabile epitoper og heparansulfat sidechains

MERK: Aktiviteten til mange proteiner er varmelabile, så tap av bindende aktivitet etter varmebehandling er oppmuntrende. Det anbefales å bestemme bidraget fra negativt ladede glykosaminoglykaner, hovedsakelig heparansulfat (HS), i å mediere bindingen av de rekombinante proteinene. Dette er fordi bindingen av HS i cellebindingsanalysen beskrevet her kan være additiv i stedet for uforståelse på andrereseptorer 19. Dette betyr at den observerte bindingen kan være helt mediert av HS sidekjeder av celleoverflate proteoglykaner og ikke av en bestemt reseptor. Binding til HS på celleoverflaten er ikke nødvendigvis uspesifikk, men snarere en egenskap av et protein, noe som er nyttig å vite før du utfører en full genetisk skjerm.

  1. Forbered varmebehandlede proteinprøver som skal brukes i bindende analyser.
    1. Varm det normaliserte, men ukonjugerte monomeriske proteinet ved 80 °C i 10 min.
    2. Konjugere det varmebehandlede proteinet til streptavidin-PE forutsatt samme konjugeringsforhold som det ubehandlede motstykket som bestemt av ELISA (se avsnitt 2).
  2. Forbered heparin-blokkerte proteinprøver.
    1. Forbered åtte 1:3 fortynninger av løselig heparin i PBS med en startkonsentrasjon på 2 mg/ml og siste volum på 100 μL.
    2. Inkuber 100 μL av tilberedte bindingssonder i heparinfortynningene i minst 30 minutter.
  3. Bruk varmebehandlet protein og hele 200 μL heparin/proteinblandingen i bindingsanalysene beskrevet i avsnitt 3. Representative resultater vises i figur 3A,B.

5. Valg av cellelinjer som stikker uttrykk cas9

MERK: Før cellelinjen som binder sonden av interesse kan brukes i CRISPR screening, må den først konstrueres for å uttrykke Cas9-kjernen og en svært aktiv klone valgt19.

  1. Bruk følgende generelle lentivirus produksjonsprotokoll til å produsere lentivirus ved hjelp av lentiviral konstruksjon for Cas9 uttrykk (se tabell 1).
    1. Kultur HEK293-FT celler i DMEM/10% FBS media ved 37 °C og 5% CO2. Frø HEK293-FT celler 1 dag før transfeksjon slik at de er ~ 80% samløpet på dagen for transfeksjon.
      MERK: HEK293FT-celler er løst tilhenger; Derfor, når de brukes til produksjon av lentivirus, bør du vurdere å plating dem på kultur kolber belagt med 0,1% (w / v) gelatin for å øke etterlevelse.
    2. Utfør transfeksjoner om morgenen. Legg til overføringsvektor, emballasjeblanding og transfektreagens i prewarmed transfection-kompatible medier (f.eks. Opti-MEM). Bland ved å invertere røret 10-15x. Inkuber i 5 min ved RT. Se tabell 3 for nøyaktige volumer.
    3. Tilsett transfeksjonsreagensen som foreslått av produsenten. Bland ved rask vortexing. Inkuber i 30 min ved RT.
    4. Veldig nøye aspirere brukt medium. Legg til transfeksjonskompatibelt medium i plate.
    5. Tilsett transfeksjon reagens / DNA komplekser dråpevis på siden av platen og sakte spre seg gjennom platen ved å virvle veldig forsiktig.
    6. Inkuber ved 37 °C i 3-5 timer og skift ut mediet med D10 medium. Inkuber over natten.
    7. Neste dag om morgenen, erstatt mediet med frisk D10 medium. Inkuber over natten.
    8. Neste dag sent på ettermiddagen, samle viral supernatant. Filtrer med et 0,45 μm filter med lavt proteinbinding. Du kan eventuelt legge til frisk D10-medium, inkubere over natten og huske supernatanten neste dag.
    9. Virussupernatanter er stabile ved 4 °C i bare noen dager. Oppbevars ved -80 °C for langtidslagring.
      MERK: For å generere et svært konsentrert lentiviralpreparat, som kan være ønskelig for transduksjon av vanskelige å transduce celler, supernatants kan også konsentreres ved sentrifugering på 6000 x g over natten ved 4 °C. Merk den gjennomsiktige virale pelleten med en etanolbestandig penn og kast supernatanten. Resuspend pellet i 1/100th av det opprinnelige volumet for en 100x økning i konsentrasjonen.
  2. Transduser cellene med lentivirus.
    1. Plate 1 x 106 celler per brønn i en 6 brønnplate med 3 ml passende kulturmedier. Noen celler er lettere transdusert enn andre. For enkle å overføre celler (f.eks. HEK-celler), legg direkte til lentiviruset i cellene. For vanskelige å transduce celler, det kan være nødvendig å følge en spinoculation protokoll som beskrevet nedenfor.
      1. Aliquot 2 ml 2-5 x 106 celler/ml i et konisk rør på 15 ml.
      2. Tilsett lentivirus sammen med 8 μg/ml heksadimethrinebromid og inkuber ved RT i 30 min.
      3. Sentrifuge i 100 min ved 800 x g ved 32 °C. Deretter resuspeded cellene i samme media og legge til celle suspensjon i passende kultur kolber med passende medier.
    2. Tillat transduksjoner i minst 24 timer. Fjern deretter mediet som inneholder viruset og tilsett friskt medium.
    3. Etter en annen 24 h, endre media til en som er supplert med riktig antibiotika. Cas9-konstruksjonen inneholder en blasticidin motstandskassett for valg.
      MERK: Mengden blasticidin må optimaliseres for hver cellelinje ved å utføre en doserespons kill kurve. En blasticidinkonsentrasjon mellom 2,5-50 μg/ml bør drepe de fleste uoverførte cellelinjer innen 10 dager etter transduksjon.
  3. Utfør valg til alle celler i kontrollplaten (dvs. ikke-overførte celler som har blitt behandlet med samme konsentrasjon av utvalgsantibiotika) blir drept.

6. Velge høye Cas9-aktivitet kloner

MERK: Polyklonal Cas9 kan brukes til å utføre genetiske skjermer. Hvis du velger en klone med høy Cas9-aktivitet, forbedres imidlertid screeningresultatene18.

  1. Bruk begrensende fortynning eller encellede sorter individuelle blasticidinresistente celler til brønner på tre 96 brønnplater som inneholder kulturmedier supplert med blasticidin. Kloner vil begynne å dukke opp mellom 2-4 uker. Velg 10-20 kloner og utvid i 6 brønnplater.
  2. Analyser klonene for Cas9-aktivitet ved hjelp av det raske GFP-BFP-systemet (grønt fluorescerende proteinblå fluorescerende protein) som bruker et eksogent genutslagsystem der cellene overføres enten med en konstruksjon som uttrykker GFP med en gRNA-målretting GFP eller en tom gRNA som kontroll18.
    1. Bestill reporter plasmider: GFP-BFP plasmid, Control-BFP plasmid (Tabell 1).
    2. Produser lentivirus for både GFP-BFP plasmid og Control-BFP plasmid ved hjelp av lentivirusproduksjonsprotokollen beskrevet i pkt. 5.1.
    3. Transduce hver Cas9-uttrykkende cellelinje klone med lentivirus koding GFP-BFP system og Control-BFP separat. Følg protokollen i pkt. 5.2.
    4. Etter 3 dager med transduksjon, undersøk GFP-BFP fluorescens av hver klone ved hjelp av strømningscytometri. Bruk henholdsvis 488 nm laser og 405 nm laser for å oppdage henholdsvis GFP og BFP.
    5. Kvant Cas9-aktiviteten i hver klone ved å undersøke forholdet mellom BFP bare til GFP-BFP-doble positive celler. Høy aktivitet Cas9-celler bør ideelt sett ha > 95% GFP knockout effektivitet (Figur 4).

7. Generasjon av genom-wide CRISPR-Cas9 screening knockout bibliotek

  1. For genom-wide screening ved hjelp av Human V1 bibliotek18,bestille genom-wide biblioteket (se tabell 1)og forberede plasmid biblioteket fra bakteriell stab ved hjelp av protokollen gitt under "Protokoller for bibliotek replikering" i produsentens håndbok.
  2. Bruk genom-wide bibliotek plasmid forberedelse til å produsere en lentiviral bibliotek koding gRNAs for målrettet forstyrrelse av menneskelige gener ved hjelp av lentivirus produksjonsprotokoll beskrevet i pkt. 5.1.
    MERK: En god praksis er å produsere en enkelt batch av lentiviral forberedelse som er optimalisert for transduksjon for å forbedre eksperimentell konsistens.
  3. Bruk transduksjonsprotokollen i avsnitt 5.2 til å utføre småskala testtransduksjoner for å bestemme den nødvendige mengden virus for hver cellelinje for å oppnå 30% transduksjon. Bruk flow cytometri for å vurdere BFP fluorescens som en proxy for transduksjonseffektivitet.
  4. For å transduce HEK293 celler, bare legge til forhåndsbestemt lentiviral forberedelse til 30-50 x 106 celler dyrket i normal vekst media for ~ 4 h. Fjern deretter mediene med lentivirus og erstatt med friske vekstmedier.
  5. For andre cellelinjer bruker du spinokuleringsprotokollen i pkt. 5.2.1, men i større skala, slik at totalt 30-50 x 106 celler overføres. For dette, aliquot 2 ml 5 x 106 celler / ml i et 15 ml konisk rør og fortsett som angitt.
  6. For tilhengercellelinjer velger du transdukerte celler ved å legge til puromycin 24 timer etter transduksjon.
    MERK: Optimaliser puromycinkonsentrasjoner ved å utføre en doserespons kill kurve. Normalt bør konsentrasjoner mellom 1-10 μg/ml drepe ikke-transduserte celler innen 3-5 dager. Unngå å bruke høyere konsentrasjoner av puromycin fordi dette kan øke sjansene for å velge celler som har blitt transdusert av mer enn onesingle guide RNA (sgRNA).
  7. For suspensjonsceller, høste transdusert (dvs. BFP positiv) celler 3 dager ettertransduction ved hjelp av en cellesortering og generere biblioteker som inneholder minst 10 x 106 celler. Når valgt ved hjelp av BFP, vokse cellene i media supplert med passende mengde puromycin.
    MERK: Unngå valg bare med puromycin for suspensjon cellelinjer, fordi det er vanskelig å fjerne døde celler og rusk fra suspensjon celle kulturer som kan forstyrre cellesortering.
  8. Kultur mutant bibliotek for 9-16 dager ettertransduction med vanlig passasje hver 2-3 dager.

8. Genetisk screening for celleoverflatebinding

  1. Pellet mutert cellebiblioteket ved 200 x g i 5 min og resuspend cellene i PBS.
  2. Del cellene i to 15 ml koniske rør med minst 50 x 106 celler i hvert rør.
  3. Spinn ett konisk rør ved 200 x g i 5 min, fjern supernatanten og frys cellepelleten ved -20 °C. Dette er kontrollpopulasjonen og vil bli behandlet senere.
  4. Bruk pelleten i det andre røret i 10 ml PBS/1 % BSA. Sett til side 100 μL celler som en negativ kontroll på en 96 brønnplate.
  5. Tilsett riktig preconjugated rekombinant protein til cellesuspensjonen i det koniske røret og negative kontrollproteiner til 96 brønnplaten.
  6. Utfør cellefarging i minst 1 timer ved 4 °C på en benkeplaterotor med skånsom rotasjon (6 o/min).
  7. Pellet cellene på 200 x g i 5 min, fjern supernatant. Utfør to vasketrinn, og fyll deretter cellene i 5 ml PBS.
  8. Stamme cellene selv om en 30 μm celle sil for å fjerne celleklynger. Analysere ved hjelp av en flytsortering.
  9. Bruk den negative kontrollprøven til å gate for BFP+/PE-celler.
  10. Sorter prøven og samle inn BFP+/PE-cellene. Sorteringsportene vil avhenge av bindingen av cellene til proteinet, men er normalt 1-5% av PE negative prøver samles inn. Et eksempel på en sorteringsgate er gitt i tilleggstall 1.
  11. Samle 500.000-1.000.000 celler fra den valgte porten. Gitt det lave antall celler, bør du vurdere å samle prøvene i et 1,5 ml sentrifugasjonsrør for å minimere tap.
  12. Pellet de sorterte cellene ved sentrifuging på 500 x g i 5 min. Fjern forsiktig supernatanten og kast. Det er mulig å oppbevare pelleten ved -20 °C i opptil 6 måneder.

9. Genomisk DNA-ekstraksjon og første PCR for gRNA-berikelse

  1. Trekk ut genomisk DNA fra høy kompleksitetskontrollpopulasjon.
    1. Hvis kontrollpopulasjonen ble frosset ved -20 °C, ta ut det koniske røret og tilsett PBS. Hold på is for å tine pelleten.
    2. Bruk et kommersielt sett (se Tabell over materialer) ved hjelp av produsentens anbefalinger for å trekke ut genomisk DNA fra 50 x 106 celler. Juster DNA-konsentrasjonen til 1 mg/ml.
    3. For hver prøve, sett opp en hovedblanding for PCR tilsvarende 72 μg DNA. Aliquot 50 μL per brønn i 36 brønner av en 96 brønns PCR-plate. De nødvendige primersekvensene er oppført i tabell 4. Bruk veiledningen i tabell 5 og 6.
    4. Løs 5 μL av PCR fra 6-12 representative prøver på en 2% (w / v) agarose gel. Et enkelt klart bånd på ~ 250 bp bør observeres. Hvis båndene er svake, gjentar du PCR for ytterligere 2-3 sykluser.
    5. Bruk en flerkanals pipette til å samle 5 μL PCR-produkter fra hver brønn (180 μL totalt) og samle dem i et reservoar med 900 μL bindingsbuffer fra et kommersielt sett (se Tabell over materialer).
    6. Rens PCR-produktene ved hjelp av et kommersielt PCR-rensesett. Elute DNA i 50 μL elution buffer fra et kommersielt sett (se Tabell over materialer)og måle DNA-konsentrasjonen.
  2. Prøver som er sortert for tap av bindende fenotype er usannsynlig å være sammensatt av et stort antall uavhengige kloner. Derfor er det ikke nødvendig å utføre PCR med 72 μg DNA. Isoler DNA-et ved hjelp av et passende kommersielt sett (se Materialkommand). Sett opp 3-4 PCR-reaksjoner ved hjelp av protokollen som er beskrevet før (pkt. 9.1.3) med 100 ng/μL DNA. Hvis det sorterte cellenummeret er mindre enn 100 000, bruker cellelysater i stedet for genomiske DNA-preparater.
    1. Aliquot ca 10.000 celler / godt i en 96 brønn PCR plate.
    2. Pellet cellene i platen og forsiktig fjerne det meste av supernatant. Pelleten vil ikke være synlig.
    3. Tilsett 25 μL vann i hver brønn og varm prøvene ved 95 °C i 10 min.
    4. Tilsett 5 μL av 2 mg/ml nyfortynnet proteinase K til hver brønn i 1 time og inkuber ved 56 °C. Varm deretter prøven i 10 min ved 95 °C for å inaktivere proteinase K.
    5. Bruk 10 μL cellelysatblanding per PCR-reaksjon. Lysater skal brukes innen 24 timer.

10. Andre runde med PCR for indeksbarkoding og sekvensering

  1. Fortynn produktene fra første runde PCR til 40 pg/μL.
  2. Konfigurer én PCR per prøve (bruk veiledningen i tabell 7 og 8). Bruken av en high-fidelity polymerase er viktig for å minimere feil introdusert av polymerase under sgRNA forsterkning.
  3. Løs 5 μL PCR-produkter på en 2 % (w/v) agarosegel. Et enkelt klart bånd på ~ 330 bps bør observeres.
  4. Rens PCR-produkter ved hjelp av paramagnetiske perler ved å tilsette 31,5 μL (0,7x totalt volum) av resuspended perler til PCR-produktene, blande godt og inkubere i 5 min ved RT.
  5. Plasser røret på et magnetisk stativ i 3 min. Perlene skal fanges på siden av platen og løsningen skal være klar. Fjern forsiktig og kast supernatanten.
  6. Tilsett 150 μl av 80% nylaget etanol til røret. Inkuber i 30 s, og fjern deretter forsiktig og kast supernatanten.
  7. Gjenta trinn 13.6, denne gangen med 180 μL. Luft deretter perlene i 5 min.
  8. Fjern røret fra magneten. Elute DNA mål fra perler i 35 μL av steril EB buffer. Inkuber i 3 min, og sett deretter røret tilbake i det magnetiske stativet i 3 min.
  9. Overfør ca. 30 μL av supernatanten som inneholder de eluterte PCR-produktene til et rent rør.
  10. Sekvenser prøvene på en neste generasjons sekvenseringsplattform. For HumanV1 gRNA-biblioteket bruker du den egendefinerte primeren som er oppført i tabell 4, til å sekvensere 19 bp.

11. Bioinformatikkanalyse for å identifisere reseptoren og relaterte veier

  1. Tilordne sekvenser fra sortert og usortert populasjon til referansebiblioteket ved hjelp av tellefunksjonen til MAGeCK. Funksjonen vil gi en råtellingsfil (Tilleggstabell 1).
    MERK: Detaljerte instruksjoner om installasjon av MAGeCK og bruk av ulike funksjoner i MAGeCK er beskrevet i en tidligere publisert protokoll av Wang et al.20.
  2. Kontroller den tekniske standarden for kontrollbiblioteket som brukes på skjermen.
    1. Median normalisere råtellingene og bruk ggplot2-pakken i R21 eller tilsvarende programvare for å plotte en empirisk kumulativ tetthetsfunksjonsplott av tellingene i plasmid og kontroll usorterte prøver (Figur 5A).
    2. Kjør testfunksjonen til MAGeCK ved hjelp av tellinger fra plasmidpopulasjon som "kontroll" og tellingene fra usorterte kontrollprøver som "test"-prøven. Funksjonen er vil gi en gensammendragsfil (Supplerende tabell 1).
    3. Åpne gensammendragsfilen og tegn fordelingen av log-fold-endringer (neg|lfc kolonne) for tidligere kategorisert essensielle og ikke-essensielle gener22 (Figur 5B).
    4. Velg betydelig utarmede gener (neg|fdr < 0,05) og utfør stiberikelsesanalyse ved hjelp av enrichr23-pakken eller tilsvarende veiberikelsespakker i R (figur 5C).
  3. Kjør -test-funksjonen til MAGeCK med standardinnstilling. Bruk råtellinger fra usortert kontrollprøve som "kontroll"og teller fra sortert prøve som "behandling" når du utfører analysen.
  4. Åpne gensammendragsfilen som genereres av MAGeCK, og rangerte pos|rangkolonnen i stigende rekkefølge. Bruk FDR (pos|fdr kolonne) < 0,05 som en cutoff for identifisering av treff. Reseptoren er vanligvis rangert høyt, ofte i første posisjon.
  5. Plott robust-rangering-algoritme (RRA) score for positivt utvalg(pos|score)i R eller en tilsvarende programvare (Figur 5D).
  6. Velg gentreff og utfør stiberikelsesanalyse ved hjelp av berikerpakken eller tilsvarende veiberikelsespakker i R for å identifisere de berikede banene.

Representative Results

Sekvensering av data fra to representative genom-skala knockout skjermer for identifisering av bindende partner av menneskelige TNFSF9 og P. falciparum RH5 utført i NCI-SNU-1 og HEK293 celler henholdsvis er gitt (Supplerende tabell 1). Den bindende oppførselen til RH5 ble påvirket av både heparansulfat og den kjente reseptoren BSG24 (Figur 3C), mens TNFRSF9 spesifikt bundet til den kjente reseptoren TNFSF9 og ikke mistet binding ved forutgående med løselig heparin. Protein 3 i figur 3B representerer TNFRSF9.

For begge cellelinjene er fordelingen av gRNAer i kontrollmutert bibliotek etter 3 dager (9, 14 og 16 dager ettertransduction) også gitt (Supplerende tabell 1). GRNA-fordelingen viste at bibliotekkompleksiteten ble opprettholdt i løpet av forsøket (figur 5A). Den genetiske skjermen for identifisering av ligand for TNFSF9 ble utført på dag 14 ettertransduction, mens det for RH5 ble utført dag 9 ettertransduction. Den tekniske kvaliteten på skjermene ble vurdert ved å undersøke fordelingen av observerte fold-endringer av gRNAs rettet mot et referansesett av ikke-essensielle gener sammenlignet med fordelingen for referansesett av essensielle gener22 (Figur 5B). I tillegg viste pathway-level berikelse også at forventede essensielle veier ble identifisert og betydelig beriket i "drop-out" befolkningen når du sammenligner kontrollprøven med det opprinnelige plasmidbiblioteket. Et eksempel med dag 14 NCI-SNU-1-prøve er avbildet i figur 5C.

Fordelingen av gRNAene i kontroll versus sortert populasjon ved hjelp av testfunksjonen til MAGeCK (se supplerende tabell 1 for gensammendragsutdataene fra MAGeCK) ble brukt til å identifisere reseptoren fra fenotypiske skjermer. Den modifiserte RRA-poengsummen rapportert av MAGeCK i gennivåanalysen plottes mot genene rangert etter p-verdier. RRA-poengsummen i MAGeCK gir et mål der gRNA-er rangeres konsekvent høyere enn forventet. I skjermen for TNFRSF9 var topphiten TNFSF9, som er en kjent bindende partner av TNFRSF9 (Figur 5D). I tillegg ble det også identifisert en rekke gener relatert til TP53-banen. Ved RH5, i tillegg til den kjente reseptoren (BSG) og genet som kreves for produksjon av sulfaterte GAGs (SLC35B2), ble et ekstra gen (SLC16A1) også identifisert (figur 5E). SLC16A1 er en chaperone som kreves for smugling BSG til overflaten av celler25. Sammen viser disse resultatene skjermens evne til å identifisere direkte interagerende reseptorer og de cellulære komponentene som kreves for at reseptoren skal uttrykkes på overflaten av cellene i funksjonell form.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over den genetiske screeningtilnærmingen for å identifisere celleoverflatereseptorer. Denne analysen består av tre hovedtrinn: Først uttrykkes rekombinante proteiner som representerer ektodomenet av celleoverflatereseptorer i en cellelinje som kan legge til strukturelt kritiske posttranslational modifikasjoner som HEK293-celler. Monomeriske protein ectodomainer er oligomerisert ved å konjugere til streptavidin-PE for å øke deres bindende aviditet. For det andre brukes disse ivrige sondene i cellulære bindingsanalyser der lys farging på cellelinjene indikert av et fremtredende skifte i PE fluorescens (i grønt) sammenlignet med et negativt kontrollprotein (i svart) viser tilstedeværelsen av en celleoverflatebindende partner. For det tredje velges reseptorpositive Cas9-uttrykkende cellelinjer, og genom-skala screening ved hjelp av gRNAs rettet mot det store flertallet av proteinkoding gener utføres. Mens du genererer mutantbiblioteker, er det vanlig å bruke 30% transduksjonseffektivitet, som er basert på Poisson-distribusjonssannsynligheten som sikrer at hver celle mottar en enkelt gRNA slik at den resulterende fenotypen tilskrives en bestemt knockout. BFP-markøren uttrykt av de transdukerte cellene brukes til å velge celler som inneholder gRNAer ved hjelp av FACS. Fenotypiske skjermer utføres mellom 9-16 dager ettertransduksjon. På dagen for skjermen er den totale mutantcellepopulasjonen delt inn i to. Den ene halvdelen holdes som kontrollpopulasjonen og den andre halvparten er valgt for rekombinant proteinbinding. Cellene fra det muterte biblioteket som ikke lenger er i stand til å binde det rekombinante proteinet, sorteres ved hjelp av FACS, og berikelsen av gRNAer i den sorterte versus kontrollpopulasjonen brukes til å identifisere gener som kreves for celleoverflatebinding av den merkede ivrige sonden. Trinn i protokollen som krever betydelig tid, angis. Dette tallet er endret fra Sharma et al.19. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Etablere forhold mellom biotinylert protein til streptavidin-PE ved hjelp av en ELISA-basert metode. Et eksempel på streptavidin-PE bøyning strategi brukes til å generere en ivrig sonde fra en biotinylert monomerisk protein. En fortynningsserie av biotinylerte monomerer ble inkubert mot en fast konsentrasjon av streptavidin. Minimumsfortynning der ingen overflødige biotinylert monomerer kan påvises, ble bestemt av ELISA. ELISA ble utført med eller uten å preincubating en rekke protein fortynninger med 10 ng av streptavidin-PE. I nærvær av streptavidin-PE ble minimumsfortynning der ingen signal ble identifisert (sirklet svart) og mengden protein som kreves for metningen, beregnet for å generere en 10x lagerløsning med 4 μg/ml streptavidin-PE. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Representativ binding av proteiner til cellelinjer. (A) Proteinbinding til cellelinjer hadde en klar økning i cellerelatert fluorescens sammenlignet med kontrollprøven. Varmebehandling (80 °C i 10 min) rekombinant protein abrogated all binding tilbake til en negativ kontroll, viser at bindingsvirkemåten var avhengig av riktig foldet protein. (B) Ulike klasser av proteinbindende atferd til celleoverflater; avhengighet av GAGs. Fra venstre til høyre kan proteinene klassifiseres i tre typer: Protein type 1 adsorberer bare til HS. Disse proteinene mister bindingen etter preincubation med heparinkonsentrasjoner over 0,2 mg/ml. Protein type 2 binder seg til HS i tillegg til en bestemt reseptor. Disse proteinene mister delvis binding i preblocking eksperimenter. Protein type 3 binder ikke HS. Disse proteinene mister ikke bindingen sammenlignet med foreldrelinjer. (C)Et eksempel på et protein (dvs. RH5) som binder seg til HS og en bestemt reseptor på additiv måte. Målretting enten reseptoren (dvs. BSG) eller enzymer som kreves for HS syntese (f.eks SLC35B2, EXTL3) reduserer bare delvis bindingen av RH5 til celler i forhold til kontroller. Transduced polyklonale linjer kan brukes i slike eksperimenter for å etablere bindende atferd. Dette tallet er endret fra Sharma et al.19. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Velge kloncellelinjer med høy Cas9-aktivitet. Genomredigeringseffektiviteten til både polyklonale og klonet linjer av NCI-SNU-1-cellelinjer ble vurdert ved hjelp av GFP-BFP-reportersystemet, der cellelinjer ble transdusert med virus med en gRNA-målretting plasmid kodet GFP eller uten (dvs. "tom"). En skjematisk er avbildet. Flow cytometri ble brukt til å teste både BFP og GFP uttrykk etter transduksjon og sammenlignet med uinfisert kontroll. GFP-uttrykk ble brukt som proxy for Cas9-aktivitet, mens BFP-uttrykk merket transdusert celler. Profilen for uinfiserte og tomme infiserte celler så like ut for alle kloner. Representative profiler er avbildet i venstre panel. Alle de fem klonene i NCI-SNU-1-cellelinjen viste et høyere tap av GFP sammenlignet med polyklonale linjen (høyre panel), med klone 4 som viser den høyeste effektiviteten med den laveste ildfaste populasjonen. Dette tallet er endret fra Sharma et al.19. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Representative resultater fra genetiske skjermer for identifisering av celleoverflaten bindende partnere. (A) Kumulativ distribusjonsfunksjon plott som sammenligner gRNA overflod i plasmid biblioteket til mutant bibliotekene i HEK-293-E og NCI-SNU-1 celler på dag 9, 14 og 16 dager ettertransduction. For et gitt tall rapporterer kumulativ tetthetsfunksjon prosentandelen av datapunkter som var under denne terskelen. Det lille skiftet av den muterte cellepopulasjonen sammenlignet med den opprinnelige plasmidpopulasjonen representerer uttømmingen i et undersett av gRNAer sammenlignet med plasmidbiblioteket. (B) Distribusjon av log-fold endringer i gener som tidligere har blitt kategorisert som essensielle (røde) eller ikke-essensielle (svart) i HEK293 og NCI-SNU-1 cellelinjer. Fordelingen av foldeendringer for ikke-essensielle gener sentrert på ~ 0, mens det for essensielle gener flyttet til venstre mot negative foldendringer. (C) Betydelig berikede veier i gener utarmet i NCI-SNU-1 mutant kontrollpopulasjon 14 dager ettertransduction. Forventede kjente celleneriområder ble identifisert. (D)Robust rang algoritme (RRA) -score for gener som ble beriket i de sorterte cellene som hadde mistet evnen til å binde TNFRSF9-sonden. Gener ble rangert i henhold til RRA-poengsummen. Den kjente interaksjonspartneren TNFSF9 og gener relatert til TP53-banen (merket med rødt) ble identifisert på skjermen. (E)Rangeringsbestilte RRA-skår for gener identifisert fra gRNA berikelseanalyse som kreves for RH5-binding til HEK293-celler (venstre panel). SLC35B2 og SLC16A1 ble identifisert innenfor en terskel for falsk oppdagelsesfrekvens (FDR) på 5 %. To ekstra gener i HS biosyntesebanen (dvs. EXTL3 og NDST1)ble identifisert i FDR på 25 %. Skjematisk skildrer den generelle GAG biosyntese banen med de relevante genene kartlagt til tilsvarende trinn (panel 2). Gener som kreves for forpliktelsen til kondroitin sulfatbiogenese (dvs. CSGALNACT1/2)ble ikke identifisert på skjermen. Dette tallet er endret fra Sharma et al.19. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Plasmid navn Plasmid (andre) # Bruke
Protein uttrykk konstruere: CD200RCD4d3 +4-bio-linker-hans Addgene: 36153 Produksjon av rekombinant protein med CD4d3 +4, biotin og 6-hans koder.
PMD2.G (Andre) Addgene: 12259 VSV-G konvolutt uttrykker plasmid; produksjon av lentivirus
pspax2 (andre) Addgene: 12260 Lentiviral emballasje plasmid, produksjon av lentivirus
Cas9-konstruer: pKLV2-EF1a-Cas9Bsd-W Addgene: 68343 Produksjon av konstitutivt uttrykke Cas9 linje
gRNA uttrykk konstruere: pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W Addgene: 67974 CRISPR gRNA-uttrykksvektor med forbedret stillas- og puro/BFP-markører
Menneskelig forbedret genom-wide Knockout CRISPR-bibliotek Addgene: 67989 Et gRNA-bibliotek mot 18 010 menneskelige gener, designet for bruk i lentivirus.
GFP-BFP konstruksjon: pKLV2-U6gRNA5(gGFP)-PGKBFP2AGFP-W Addgene: 67980 Cas9 aktivitet reporter med BFP og GFP.
Tom konstruksjon: pKLV2-U6gRNA5(tom)-PGKBFP2AGFP-W Addgene: 67979 Cas9 aktivitetsreporter (kontroll) med BFP og GFP.

Tabell 1: Plasmids brukt i denne tilnærmingen.

Buffernavn Komponenter
Hbs (10X) 1,5 M NaCl og 200 mM HEPES i MiliQ vann, avpass til pH 7.4
PBS (10X) 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4 og 2,4 g KH2PO4 i MiliQ vann, juster til pH 7,4
Natriumfosfatbuffer (80mM lager) 7,1 g Na2HPO4.2H2O, 5,55 g NaH2PO4, juster til pH 7.4
Hans rensing binding buffer 20 mM natriumfosfatbuffer, 0,5 M NaCl og 20 mM Imidazole, juster til pH 7.4
Hans rensing elution buffer 20 mM natriumfosfatbuffer, 0,5 M NaCl og 400 mM Imidazole, tilpasses pH 7.4
Diethanolamine buffer 10 % dietanolamin og 0,5 m MM MgCl2 i MiliQ vann, tilpasses pH 9.2:
D10 (andre) DMEM, 1 % penicillin-streptomycin (100 enheter/ml) og 10 % varmeaktivert FBS

Tabell 2: Buffere som kreves for denne studien.

Komponenter 10 cm fat 6-brønns plate
293FT celler 70–80 % samløpet 70–80 % samløpet
Transfection-kompatible medier (Opti-MEM) (trinn 5.1.2) 3 ml 500 μL
Transfection-kompatible medier (Opti-MEM) (trinn 5.1.4) 5 ml 2 ml
Lentiviral overføring vektor 3 μg 0,5 μg
psPax2 (se tabell 1) 7,4 μg 1,2 μg
pMD2.G (se tabell 1) 1,6 μg 0,25 μg
PLUSS reagens 12 μL 2 μL
Leppeaveksamin LTX 36 μL 6 μL
D10 (Trinn 7.1.7) 5 ml 1,5 ml
D10 (trinn 7.1.8 og 7.1.10) 8 ml 2 ml

Tabell 3: Mengder og mengder reagenser for lentivirusemballasjeblanding.

Tabell 4: Primersekvenser for forsterkning av gRNA og NGS. Klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).

Reagens Volum per reaksjon Hovedmix (x38)
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x 25 μL 950 μL
Primer (L1/U1) mix (10 μM hver) 1 μL 38 μL
Genomisk DNA (1 mg/ml) 2 μL 72 μL
H 2 O(andre) 22 μL 1100 μL
Totalt 50 μL 1900 μL

Tabell 5: PCR for forsterkning av gRNAer fra prøver med høy kompleksitet.

Syklus nummer Denature (andre) Annealing Forlengelsen
1 98 °C, 30s
2-24 98 °C, 10s 61 °C, 15s 72 °C, 20s
25 72 °C, 2 min

Tabell 6: PCR-betingelser for den første PCR.

Reagens Volum per reaksjon
KAPA HiFi HotStart ReadyMix 25 μL
Primer (PE1.0/index primer) mix (5 μM hver) 2μl (2μL)
Første PCR-produkt (40 pg/μL) 5 μL
H 2 O(andre) 18 μL
Totalt 50 μL

Tabell 7: PCR for indeksmerking av sgRNAs fra genetiske skjermer.

Syklus nummer Denature (andre) Annealing Forlengelsen
1 98 °C, 30s
2-15 98 °C, 10s 66 °C, 15s 72 °C, 20s
16 72 °C, 5 min

Tabell 8: PCR-betingelser for andre PCR.

Supplementary Figure 1
Supplerende figur S1: En veiledning til tegning porter for sortering av den uforpliktende befolkningen. (A) En ideell proteinkandidat for screening bør ha et klart skifte av bindende populasjon sammenlignet med kontrollpopulasjonen, og bindingen bør beholdes på celler som mangler maskiner for HS biosyntese. Et heparinblokkeringseksperiment kan brukes i stedet for testing på SLC35B2 målrettede cellelinjer. (B) Celler som mangler overflatefarging fra proteinektodomenet, men uttrykker BFP fluorescens fra lentiviral transduction ble samlet inn. Cellene som vises er fra en skjerm for identifisering av reseptor for GABBR222. Dette tallet er endret fra Sharma et al.19. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 2
Supplerende figur S2: Celleoverflate glykoproteintranskripsjonomikkbasert PCA-plott ved hjelp av RNA-seq-data fra over 1000 kreftcellelinjer. Cellelinjer fra Cell Model Passport27 ble gruppert ved hjelp av K-betyr klynger i henhold til FPKM-verdiene på ~ 1500 celleoverflate glykoproteiner. Representative cellelinjer fra hver klynge er merket. Klyngen 5 var helt sammensatt av cellelinjer av hematopoietisk opprinnelse (også se supplerende tabell 2). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 3
Supplerende figur S3: Essentiality score for KEGG-merknad protein eksport og N-koblet glykosylering gener fra prosjektscore. Justerte Bayes-essentiality score for ~ 330 cellelinjer (kolonner, ikke merket) er plottet for gener av proteineksport og N-koblet glykosyleringsvei (X-akse). Skårer høyere enn 0 representerer betydelig uttømming i mutantpopulasjonen sammenlignet med det opprinnelige plasmidbiblioteket. Genene kan deles inn i tre forskjellige klynger som representerer ulike nivåer av essensielt i cellelinjene. Denne klyngen kan brukes til å bestemme sorteringsdagen. Hvis skjermen utføres på et sent tidspunkt (dag 16), er det mulig at gener som er kjent for å være avgjørende for celler (klynger 1 og 3) ikke vil bli identifisert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende tabell 1: Raw teller filer for og MAGeCK programvare generert gene_summary filer relatert til de representative genetiske skjermer. Klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).

Supplerende tabell 2: Klynger av cellelinjer i henhold til uttrykket av celleoverflatereseptorer. Klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).

Discussion

En CRISPR-basert screeningstrategi for å identifisere gener som koder cellulære komponenter som er involvert i cellulær gjenkjenning, er beskrevet. En lignende tilnærming ved hjelp av CRISPR-aktivering gir også et genetisk alternativ for å identifisere direkte interagerende reseptorer av rekombinante proteiner uten å måtte generere store proteinbiblioteker26. Imidlertid er en stor fordel med denne tilnærmingen at det gjelder interaksjoner mediert av overflatemolekyler som opprinnelig vises på cellen, og er ikke avhengig av overuttrykk av reseptorer, noe som kan påvirke reseptorens bindingsavsigelse. I motsetning til andre metoder, Derfor gjør denne teknikken ingen antagelser om den biokjemiske naturen eller cellebiologien til reseptorene og gir en mulighet til å studere interaksjoner mediert av proteiner som normalt er vanskelige å studere ved hjelp av biokjemiske tilnærminger, for eksempel svært store proteiner, eller de som krysser membranen flere ganger eller danner komplekser med andre proteiner, og andre molekyler enn proteiner som glynoer, glykotoler og fosfolipider. Gitt metodens genom-skala natur, denne tilnærmingen har også fordelen av ikke bare å identifisere reseptoren, men også flere cellulære komponenter som kreves for binding hendelsen, og dermed gi innsikt i cellebiologien til reseptoren.

En av de store begrensningene i denne metoden når du bruker den til å identifisere reseptoren til et foreldreløst protein, er det første kravet om først å identifisere en cellelinje som binder seg til proteinet. Dette er ikke alltid lett, og å identifisere en cellelinje som viser en bindende fenotype som også er tillatt for genetiske skjermer, kan være det tidsbegrensende trinnet for distribusjon av denne analysen. Noen cellelinjer har en tendens til å binde seg til flere proteiner enn andre. Dette er spesielt relevant for proteiner som binder HS, fordi disse proteinene har en tendens til å binde seg til en hvilken som helst cellelinje som viser HS-sidekjeder, uavhengig av den opprinnelige bindingskonteksten. I tillegg har vi observert at oppregulering av syndekaner (dvs. proteoglykaner som inneholder HS) i cellelinjer fører til økt binding av HS-bindende proteiner26. Dette kan være en faktor å ta hensyn til når du velger cellelinjen for screening. Det er imidlertid også viktig å merke seg at tilsetningsstoffbindingen av HS ikke forstyrrer bindingen til en bestemt reseptor. Dette betyr at hvis bindingen observeres, er det mulig at det medieres utelukkende av HS fordi bindingen mediert av HS i denne analysen er additiv snarere enn codependent19. I et slikt scenario kan heparinblokkeringstilnærmingen som er beskrevet, identifisere slik atferd uten å måtte utføre en full genetisk skjerm.

En nyttig ressurs for å velge cellelinjer er Cell Model Passport, som inneholder genomikk, transkripsjonsmessig og kultur tilstandsinformasjon for ~ 1000 kreftcellelinjer27. Avhengig av den biologiske konteksten kan celler velges basert på uttrykksprofilene deres. For å hjelpe valg av cellelinjer, vi gruppert ~ 1000 cellelinjer i Cell Model Passport i henhold til uttrykket av ~ 1500 forhåndsanordnede humane celleoverflaten glykoproteiner28 (Supplerende figur 2; klyngeinformasjon for hver cellelinje sammen med vekstforhold er gitt i supplerende tabell 2). Når du tester bindingen av et protein med ukjent funksjon, er det nyttig å velge et panel av representative cellelinjer fra hver klynge for å øke sjansen for å dekke et bredt spekter av reseptorer. Gitt et valg, anbefales det å velge cellelinjer som er enkle å kultur og lett å transduce. Siden disse cellelinjene vil bli brukt i genom-skala screening, er det å foretrekke at de kan dyrkes lett i store mengder og er tillatt for lentiviral transduksjon, fordi det er den mest tilgjengelige metoden for levering av sgRNA for CRISPR-basert genetisk screening i de senere trinnene.

Vanligvis utføres fenotypevalgene i en enkelt type. Dette bestemmes imidlertid av lysstyrken til den fargede cellepopulasjonen sammenlignet med kontrollen. Iterative runder med valg kan vedtas for scenarier der signal-til-støy-forholdet til ønsket fenotype er lav, eller når målet med skjermen er å identifisere mutanter som har sterke fenotyper. Når du bruker en iterativ utvalgstilnærming for FACS-baserte skjermer, er det viktig å vurdere at sorteringsprosessen kan forårsake celledød, hovedsakelig på grunn av den rene kraften til sorteringen. Dermed vil ikke alle innsamlede celler bli representert i neste runde av sortering.

Bibliotekkompleksitet er en svært viktig faktor i å utføre vellykkede genetiske skjermer, spesielt for negative utvalgsskjermer fordi omfanget av uttømming i disse bare kan bestemmes ved å sammenligne resultater med det som var tilstede i startbiblioteket. For negative utvalgsskjermer er det vanlig å opprettholde biblioteker med 500-1000 x kompleksitet. Positive utvalgsskjermer er imidlertid mer robuste for bibliotekstørrelser, fordi i slike skjermer forventes det bare at et lite antall mutanter velges for en bestemt fenotype. Derfor, i det positive utvalgsskjermen som er beskrevet her, kan bibliotekstørrelsen reduseres til 50-100x kompleksitet uten at det går på bekostning av kvaliteten på skjermen. I tillegg er det i disse skjermene også mulig å bruke et kontrollbibliotek for en gitt cellelinje på en gitt dag som en "generell kontroll" for alle eksempler sortert på dagen for den gitte cellelinjen. Dette vil redusere antall kontrollbiblioteker som må produseres og sekvenseres.

En annen viktig faktor for å bruke denne tilnærmingen er begrensningene for funksjonstapsskjermer i å identifisere gener som er avgjørende for in vitro cellevekst. Tidspunktet for skjermene er avgjørende i denne forbindelse, da jo lenger mutantcellene holdes i kultur, jo høyere er sannsynligheten for at celler med mutasjoner i essensielle gener blir ikke levedyktige og ikke lenger er representert i det muterte biblioteket. De siste genetiske skjermene utført som en del av Project Score-initiativet i over 300 cellelinjer viser at flere gener i KEGG-annotert proteinsekresjon og N-glykosyleringsvei ofte er identifisert som avgjørende for en rekke cellelinjer (Supplerende figur 3)29. Dette kan tas i betraktning når du utformer skjermer hvis effekten av gener som kreves for spredning og levedyktighet skal undersøkes i sammenheng med cellulær gjenkjenningsprosess. I dette tilfellet, utføre skjermer på et tidlig tidspunkt (f.eks dag 9 ettertransduction) ville være generelt hensiktsmessig. Men hvis tilnærmingen brukes til å identifisere noen mål med sterke størrelseseffekter i stedet for generelle cellulære veier, kan det være hensiktsmessig å utføre skjermer på et senere tidspunkt (f.eks. dag 15-16 ettertransduction).

Resultatene fra screeningen er svært robuste; i åtte rekombinant protein binding skjermer utført i det siste, celleoverflaten reseptoren var toppen hit i alletilfeller 19. Når man bruker denne tilnærmingen til å identifisere interaksjonspartneren, bør man derfor forvente at reseptoren og faktorene som bidrar til presentasjonen på overflaten, skal identifiseres med høy statistisk tillit. Når skjermen er utført og en hit er validert ved hjelp av en enkelt gRNA knockout, kan ytterligere oppfølging utføres ved hjelp av eksisterende biokjemiske metoder som AVEXIS4 og direkte saturable binding av rensede proteiner ved hjelp av overflateplasmon resonans. Tilnærmingen som er beskrevet her gjelder for alle proteiner som det er mulig å generere en oppløselig rekombinant bindingssonde.

Oppsummert er dette en genom-skala CRISPR knockout tilnærming for å identifisere interaksjoner mediert av celleoverflateproteiner. Denne metoden gjelder vanligvis for å identifisere cellulære veier som kreves for celleoverflategjenkjenning i et bredt spekter av forskjellige biologiske sammenhenger, inkludert mellom kroppens egne celler (f.eks. nevrale og immunologiske gjenkjenning), samt mellom vertsceller og patogenproteiner. Denne metoden gir et genetisk alternativ til biokjemiske tilnærminger designet for reseptoridentifikasjon, og fordi det ikke krever noen tidligere antagelser om den biokjemiske naturen eller cellebiologien til reseptorene, har den stort potensial til å gjøre helt uventede funn.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Wellcome Trust-tilskuddsnummeret 206194 tildelt GJW. Vi takker Cytometry Core-anlegget: Bee Ling Ng, Jennifer Graham, Sam Thompson og Christopher Hall for å få hjelp med FACS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse alkaline phosphatase Sigma A4656
Blasticidin Chem-Cruz SC-204655
Blood & Cell Culture DNA Maxi Kit Qiagen 13362
BSA Sigma A9647-100G
Diethanolamine Sigma 398179
DMEM Gibco 31966-021
Dneasy Blood and Tissue kit Qiagen 69504
DynaMag-96 Side Magnet Invitrogen 12331D
HEK293T packaging cells ATCC CRL-3216
Heparin Sigma H4784-1G
KAPA HiFi HotStart ReadyMix Kapa KK2602
Lipofectamine LTX with PLUS reagent Invitrogen 15338100
MoFlo XDP cell sorter BD
Ni2+-NTA agarose beads Jena Bioscience AC-501-25
OPTI-MEM Life Technologies 31985-070
OX-68 antibody AbD Serotec MCA1022R
p-nitrophenyl phosphate Sigma 1040-506
PD-10 desalting columns GE healthcare 17085101
Polybrene Millipore TR-1003-G
Polypropylene tubes with 5 mL bed volume Qiagen 34964
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Roche 3115879001
Puromycin Gibco A11138-03
Q5 Hot Start High-Fidelity 2× Master Mix NEB M0494L
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
SCFA filter Nalgene 190-2545
Sony Cell sorter Sony
SPRI beads (Agencourt AMPure XP beads) Beckman A63881
Streptavidin-coated microtitre plates Nalgene 734-1284
Streptavidin-PE Biolegend 405204

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wright, G. J. Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions. Molecular bioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).
  2. van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Transient intercellular adhesion: the importance of weak protein-protein interactions. Trends in Biochemical Sciences. 19 (9), 354-358 (1994).
  3. Wood, L., Wright, G. J. Approaches to identify extracellular receptor-ligand interactions. Current Opinion in Structural Biology. 56, 28-36 (2019).
  4. Bushell, K. M., Söllner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions. Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).
  5. Visser, J. J., et al. An extracellular biochemical screen reveals that FLRTs and Unc5s mediate neuronal subtype recognition in the retina. eLife. 4, e08149 (2015).
  6. Özkan, E., et al. An extracellular interactome of immunoglobulin and LRR proteins reveals receptor-ligand networks. Cell. 154 (1), 228-239 (2013).
  7. Martinez-Martin, N., et al. An Unbiased Screen for Human Cytomegalovirus Identifies Neuropilin-2 as a Central Viral Receptor. Cell. 174 (5), 1158-1171 (2018).
  8. Bianchi, E., Doe, B., Goulding, D., Wright, G. J. Juno is the egg Izumo receptor and is essential for mammalian fertilization. Nature. 508 (7497), 483-487 (2014).
  9. Mullican, S. E., et al. GFRAL is the receptor for GDF15 and the ligand promotes weight loss in mice and nonhuman primates. Nature Medicine. 23 (10), 1150-1157 (2017).
  10. Turner, L., et al. Severe malaria is associated with parasite binding to endothelial protein C receptor. Nature. 498 (7455), 502-505 (2013).
  11. Frei, A. P., et al. Direct identification of ligand-receptor interactions on living cells and tissues. Nature Biotechnology. 30 (10), 997-1001 (2012).
  12. Sobotzki, N., et al. HATRIC-based identification of receptors for orphan ligands. Nature Communications. 9 (1), 1519 (2018).
  13. Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
  14. Gebre, M., Nomburg, J. L., Gewurz, B. E. CRISPR-Cas9 Genetic Analysis of Virus-Host Interactions. Viruses. 10 (2), (2018).
  15. Zotova, A., Zotov, I., Filatov, A., Mazurov, D. Determining antigen specificity of a monoclonal antibody using genome-scale CRISPR-Cas9 knockout library. Journal of Immunological Methods. 439, 8-14 (2016).
  16. Puschnik, A. S., Majzoub, K., Ooi, Y. S., Carette, J. E. A CRISPR toolbox to study virus-host interactions. Nature Reviews. Microbiology. 15 (6), 351-364 (2017).
  17. Kerr, J. S., Wright, G. J. Avidity-based extracellular interaction screening (AVEXIS) for the scalable detection of low-affinity extracellular receptor-ligand interactions. Journal of Visualized Experiments. (61), e3881 (2012).
  18. Tzelepis, K., et al. A CRISPR Dropout Screen Identifies Genetic Vulnerabilities and Therapeutic Targets in Acute Myeloid Leukemia. Cell Reports. 17 (4), 1193-1205 (2016).
  19. Sharma, S., Bartholdson, S. J., Couch, A. C. M., Yusa, K., Wright, G. J. Genome-scale identification of cellular pathways required for cell surface recognition. Genome Research. 28 (9), 1372-1382 (2018).
  20. Wang, B., et al. Integrative analysis of pooled CRISPR genetic screens using MAGeCKFlute. Nature Protocols. 14 (3), 756-780 (2019).
  21. R Core team. A language and environment for statistical computing. , http://www.R-project.org (2013).
  22. Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens. G3. 7 (8), 2719-2727 (2017).
  23. Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W90-W97 (2016).
  24. Crosnier, C., et al. Basigin is a receptor essential for erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum. Nature. 480 (7378), 534-537 (2011).
  25. Kirk, P., et al. CD147 is tightly associated with lactate transporters MCT1 and MCT4 and facilitates their cell surface expression. The EMBO Journal. 19 (15), 3896-3904 (2000).
  26. Chong, Z. S., Ohnishi, S., Yusa, K., Wright, G. J. Pooled extracellular receptor-ligand interaction screening using CRISPR activation. Genome Biology. 19 (1), 205 (2018).
  27. van der Meer, D., et al. Cell Model Passports-a hub for clinical, genetic and functional datasets of preclinical cancer models. Nucleic Acids Research. 47 (D1), D923-D929 (2019).
  28. Bausch-Fluck, D., et al. A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas. PloS One. 10 (3), e0121314 (2015).
  29. Behan, F. M., et al. Prioritization of cancer therapeutic targets using CRISPR-Cas9 screens. Nature. 568 (7753), 511-516 (2019).

Tags

Genetikk utgave 160 CRISPR/Cas9 rekombinantproteiner celleheft celleoverflatereseptor genomskalascreening ekstracellulære proteininteraksjoner
Cell Surface Reseptor identifikasjon ved hjelp av genom-skala CRISPR / Cas9 genetiske skjermer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharma, S., Wright, G. J. Cell… More

Sharma, S., Wright, G. J. Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens. J. Vis. Exp. (160), e60803, doi:10.3791/60803 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter