इस काम का लक्ष्य वयस्क हृदय से कार्डियोमायोसाइट्स को पुन: उत्पन्न करने और डीएनए सामग्री और नाभिक को मापने के लिए एक विधि विकसित करना है।
वयस्क स्तनधारी दिल कार्डियोमायोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट सहित विभिन्न कोशिका प्रकारों से बना है। चूंकि हिस्टोलॉजिकल वर्गों पर कार्डियोमायोसाइट्स के नाभिक की मज़बूती से पहचान करना मुश्किल है, इसलिए कई समूह इम्यूनोदाता करने के लिए निर्धारण से पहले व्यवहार्य कार्डियोमायोसाइट्स को अलग-थलग करने पर भरोसा करते हैं। हालांकि, इन लाइव कार्डियोमायोसाइट आइसोलेशन तकनीकों को अधिकतम अनुकूलन के बावजूद नमूने से नमूने में अंतर्निहित उतार-चढ़ाव के साथ नमूनों की उपज, व्यवहार्यता और गुणवत्ता को अधिकतम करने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होती है। यहां, हम एक प्रजनन योग्य प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं, जिसमें हृदय के एंजाइमेटिक पाचन से पहले निर्धारण शामिल है, जो व्यक्तिगत कार्डियोमायोसाइट्स के वीवो आकृति विज्ञान को संरक्षित करते हुए अधिकतम उपज की ओर जाता है। हमने व्यक्तिगत कार्डियोमायोसाइट्स के लिए नाभिक प्रति नाभिक और डीएनए सामग्री की संख्या निर्धारित करने के लिए एक स्वचालित विश्लेषण मंच विकसित किया है। छाती गुहा को उजागर करने के बाद, दिल को पीबीएस में 60 एमएमएम केसीएल के साथ परफ्यूजन द्वारा डायस्टोल में गिरफ्तार किया गया था। इसके बाद, दिल को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) समाधान में तय किया गया था, और फिर 60 मिलीग्राम/ पाचन के बाद, कोशिकाओं को त्रिचुरेशन द्वारा विलक्षण किया गया था, और कार्डियोमायोसाइट अंश को अंतर अपकेंद्रित्र के माध्यम से समृद्ध किया गया था। प्राप्त आबादी की शुद्धता का आकलन करने के लिए ट्रोपोनिन टी और α-ऐक्टिनिन के लिए अलग कार्डियोमायोसाइट्स दाग दिए गए थे। इसके अलावा, हमने DAPI धुंधला होने के बाद कार्डियोमायोसाइट न्यूक्लियेशन और प्लॉयडी स्थिति निर्धारित करने के लिए एक छवि विश्लेषण मंच विकसित किया। छवि आधारित प्लॉयड आकलन के कारण लगातार और प्रजनन योग्य परिणाम सामने आए। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल के साथ, अधिकतम उपज प्राप्त करते समय इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और डीएनए सामग्री विश्लेषण की अनुमति देने के लिए व्यक्तिगत कार्डियोमायोसाइट्स की देशी आकृति विज्ञान को संरक्षित करना संभव है।
1 ,1,2दशकों से अधिकांश पश्चिमी देशों में हृदय रोग मृत्यु का प्रमुख कारण रहा है . हालांकि हृदय रोगों के उपचार में कई सुधारों से अस्तित्व में सुधार हुआ है, वर्तमान में कोई उपचार नहीं है जो खोए हुए कार्डियोमायोसाइट्स की जगह ले सकता है। इसलिए, कार्डियोमायोसाइट फ़ंक्शन, प्रसार, एपोप्टोसिस और हाइपरट्रॉफी से संबंधित अध्ययन वैज्ञानिक समुदाय का एक प्रमुख केंद्र रहे हैं और जारी हैं। चूंकि वयस्क स्तनधारी दिल में एक बहुत ही सीमित पुनर्योजी क्षमता है, जिसमें प्रति वर्ष 1% से कम की अनुमानित कार्डियोमायोसाइट नवीकरण दर है, इसलिए कार्डियोमायोसाइट प्रोलिफेरेटिव घटनाओं3,,4की विश्वसनीय रूप से पहचान करना महत्वपूर्ण है। अधिकांश रणनीतियां जो प्रसारीय घटनाओं को मापती हैं, वे पिछले या वर्तमान प्रसार का आकलन करने के लिए शामिल डीएनए न्यूक्लियोटाइड एनालॉग के लिए धुंधला करने पर निर्भर करती हैं, या सक्रिय प्रसार के परमाणु मार्कर के लिए दाग5। कार्डियोमायोसाइट प्रोलिफेरेटिव घटनाओं की विश्वसनीय रूप से पहचान करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि प्रोलिफेरेटिव कार्डियोमायोसाइट्स की कुल संख्या इतनी कम है3,6. उदाहरण के लिए, प्रति वर्ष अंतर्जात कार्डियोमायोसाइट्स की 1% नवीकरण दर के आधार पर, वयस्क माउस हार्ट7,,8में किसी भी समय 25 और 50 कार्डियोमायोसाइट्स के बीच प्रोलिफेरेटिव होने की उम्मीद कर सकते हैं। कार्डियोमायोसाइट नाभिक की पहचान में कोई भी अशुद्धियों झूठी सकारात्मक परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसलिए, कार्डियोमायोसाइट नाभिक की विश्वसनीय रूप से पहचान करना महत्वपूर्ण है, जो हिस्टोलॉजिकल सेक्शन9से कठिन और अविश्वसनीय साबित हुआ है। कार्डियोमायोसाइट्स की पहचान ऊतक वर्गों की तुलना में एकल कोशिकाओं से बहुत अधिक सटीक है क्योंकि α-ऐक्टिनिन जैसे मार्कर का उपयोग करते समय भी कार्डियोमायोसाइट्स को अन्य सेल प्रकारों से अलग करना मुश्किल हो सकता है, हालांकि पीसीएम1 हिस्टोलॉजिकल सेक्शन10में कार्डियोमायोसाइट न्यूक्लियी का एक विश्वसनीय मार्कर हो सकता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल निर्धारण से पहले लाइव कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने पर भरोसा करते हैं, जो कार्डियोमायोसाइट्स के कम से कम 30% की मौत का कारण माना जाता है, और कार्डियोमायोसाइट्स11की विशिष्ट आबादी का अनजाने चयन हो सकता है। इसके अलावा, इन प्रोटोकॉल को प्रजनन योग्य परिणाम प्रदान करने के लिए अनुकूलित करना बेहद मुश्किल है। यहां तक कि अनुकूलित अलगाव तकनीक आम तौर पर अलग पैदावार12के साथ 65% से अधिक लाइव, रॉड के आकार के कार्डियोमायोसाइट्स का उत्पादन कर सकती हैं।
इन मुद्दों को दूर करने के लिए, हमने एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जो शोधकर्ताओं को फिक्स्ड कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने की अनुमति देता है। चूंकि नमूने अलगाव से पहले तय किए जाते हैं, इसलिए उपज को अधिकतम किया जाता है, और वीवो आकृति विज्ञान में अच्छी तरह से संरक्षित किया जाता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल के साथ कार्डियोमायोसाइट्स को नैदानिक नमूनों से अलग करना संभव है, जो आमतौर पर खरीद के तुरंत बाद तय होते हैं। इसके अलावा, नए जनित कार्डियोमायोसाइट्स की पहचान करने के लिए, व्यक्तिगत कार्डियोमायोसाइट्स की नाभिक और प्लॉयडी स्थिति को मापना महत्वपूर्ण है, क्योंकि केवल डिप्लॉयड कार्डियोमायोसाइट्स को आमतौर पर नवगठित माना जाता है। फ्लो साइटोमेट्री बहुनीयता को पॉलीप्लॉयी से अलग नहीं कर सकता और यह अपेक्षाकृत समय और संसाधन-प्रधान प्रोटोकॉल है । छवियों के भीतर नाभिक की मैन्युअल रूपरेखा और माप बहुत कम थ्रूपुट है और मानव पूर्वाग्रह से ग्रस्त है। फिक्स्ड, अलग दापी-दाग कार्डियोमायोसाइट्स की छवियों का स्वचालित मात्राीकरण इन दोनों समस्याओं को हल करता है। नाभिक और प्लॉयडी वितरण के इमेजिंग आधारित निर्धारण को बुनियादी उपकरणों का उपयोग करके न्यूनतम समय और अभिकर् ता के साथ प्राप्त किया जा सकता है।
चूंकि कार्डियोमायोसाइट्स को संस्कृति में नहीं रखा जा सकता है, इसलिए प्राथमिक कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करना महत्वपूर्ण है ताकि वे अपनी वास्तुकला और कार्य11का अध्ययन कर सकें। इसलिए, हृदय क्षेत्र में कार्डियोमायोसाइट आइसोलेशन तकनीकों का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। यदि लक्ष्य कार्डियोमायोसाइट्स के कार्यात्मक पहलुओं को निर्धारित करना है, तो व्यवहार्य कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करना महत्वपूर्ण है। इन लाइव कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग अलग कार्डियोमायोसाइट्स पर इम्यूनोदाता करने के लिए भी किया जा सकता है। हालांकि, लाइव कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने की तकनीक को अनुकूलित करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, और यहां तक कि सबसे अच्छी तकनीक आमतौर पर केवल 60-65% लाइव रॉड के आकार के कार्डियोमायोसाइट्स की उपज होती है, और शेष कार्डियोमायोसाइट्स सभी को मार रहे हैं और मर रहे हैं या मृत11,,12हैं। यहां, हमने एक तकनीक विकसित की है जो शोधकर्ताओं को पहले दिल को ठीक करने की अनुमति देगी, और फिर कार्डियोमायोसाइट्स को कुशलता से अलग कर देगी। यह नया प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल की तुलना में रॉड के आकार के कार्डियोमायोसाइट्स की बहुत अधिक पैदावार के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, हमने नाभिक और प्लॉयडी के आधार पर कार्डियोमायोसाइट्स को स्वचालित रूप से वर्गीकृत करने के लिए एक इमेजिंग विश्लेषण मंच विकसित किया। इन नए तरीकों के साथ, समूह विभिन्न प्रोटीन के लिए कार्डियोमायोसाइट्स को दाग सकते हैं, और हृदय की पुनर्योजी क्षमता के लिए किराए के रूप में कार्डियोमायोसाइट प्लॉयडी और नाभिक की स्थिति का अध्ययन कर सकते हैं।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सीधा है, और बिना किसी उन्नत उपकरण के किया जा सकता है। कोलेजनेज़ की मात्रा और पाचन के लिए इनक्यूबेशन समय कोलेजनेज़ लॉट के आधार पर भिन्न हो सकता है, और कंपनी इसे प्रदान करती है। हमने कोलेजन प्रकार 2 का उपयोग किया, क्योंकि इसका उपयोग लाइव कार्डियोमायोसाइट्स प्राप्त करने के लिए दिल को पचाने के लिए सबसे व्यापक रूप से किया जाता है। हमारी टिप्पणियों के आधार पर, हमने निर्धारित किया है कि इनक्यूबेशन रातोंरात 60 मिलीग्राम/ हमारे पास कभी भी अतिचुनाव का मुद्दा नहीं रहा है क्योंकि इंट्रासेलुलर प्रोटीन तय किए जाते हैं और बाह्राश कोलेजन के रूप में सुलभ नहीं होते हैं। हालांकि, अगर दिल ठीक से पचा नहीं है, और अधिक जोरदार त्रिभुज की जरूरत हो सकती है, जो कतरनी तनाव के कारण सेल विखंडन का कारण बनता है । इस प्रकार, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि त्रिकोण पर जाने से पहले दिल ठीक से पचा जाए। पाचन की डिग्री का आकलन करने के लिए संदंश के साथ निचोड़कर दिल की कठोरता का परीक्षण किया जा सकता है। कोलेजनेज़ के साथ इनक्यूबेशन के बाद, दिल कम कठोर और अलग आंसू करने के लिए आसान होना चाहिए। अन्य प्रकार के कोलेजनेस का भी उपयोग किया जा सकता है। पिछली रिपोर्ट में कोलेजनेस बी और डी14के संयोजन का इस्तेमाल किया गया था ।
इसके अलावा, हमारा मानना है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग हृदय15में कार्डियोमायोसाइट्स की कुल संख्या का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, यदि लक्ष्य दिल से सभी कार्डियोमायोसाइट्स को प्राप्त करना और निर्धारित करना है, तो कोलेजन समाधान (जैसे, 3-7 दिन) में समय की विस्तारित अवधि के लिए दिलों को पैदा करना महत्वपूर्ण है, जहां कोलेजनेस समाधान को दिन में एक बार मंगाया जाना चाहिए। यह कार्डियोमायोसाइट उपज पर ट्रिट्यूशन की डिग्री के प्रभाव को नष्ट करके अलगाव दक्षता में विसंगतियों को कम करेगा।
प्लॉयडी को मापने के लिए डीएनए सामग्री का उपयोग नया नहीं है, और दशकों से प्रवाह साइटोमेट्री में इसका उपयोग किया जाता रहा है। हाल ही में, यह दिखाया गया था कि माइक्रोस्कोपी इसी तरह नाभिक16प्रति डीएनए सामग्री का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यहां, हमने इस रणनीति को नवगठित कार्डियोमायोसाइट्स के लिए किराए के रूप में कार्डियोमायोसाइट नाभिक की प्लॉयडी को मापने के लिए लागू किया। कार्डियक रीजनरेशन के क्षेत्र में हठधर्मिता यह है कि केवल मोनोन्यूक्लिड, डिप्लॉयड कार्डियोमायोसाइट्स ही साइटोकिनेसिस से गुजर सकते हैं और नए कार्डियोमायोसाइट्स को जन्म दे सकते हैं। चूंकि वीवो में नए कार्डियोमायोसाइट गठन को मापना बहुत चुनौतीपूर्ण है, इसलिए डीएनए न्यूक्लियोटाइड एनालॉग के प्रशासन के बाद पीछा किए गए कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करना और मोनोन्यूक्लिड के स्तर का निर्धारण करना, डिप्लॉयड कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग हृदय की क्षमता के सन्निकटन के रूप में किया गया है ताकि नए कार्डियोमायोसाइट्स17उत्पन्न हो सकें। यहां, हम इमेजजे के लिए एक मैक्रो प्रदान करते हैं जो कार्डियोमायोसाइट प्लॉयडी के आसान मात्राकरण की अनुमति देता है। जी 1 शिखर के स्थान का सटीक अनुमान प्राप्त करने के लिए कम से कम, 500 नाभिक को मापा जाना चाहिए। यदि यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानी बरती जाती है कि चित्रित प्लेट के हर कुएं में धुंधला और इमेजिंग की स्थिति सुसंगत हो, तो पूरे नमूने में केवल 500 नाभिक को चित्रित करने की आवश्यकता है, अन्यथा, प्रति छवि समूह18, 19 में,19500 नाभिक होने की आवश्यकता है। दो-आयामी छवियों का उपयोग करते समय, वास्तविक कार्डियोमायोसाइट नाभिक से अनुवर्ती कोशिकाओं से नाभिक को अलग करने में कठिनाई होती है। इस तरह की अनुयायी कोशिकाओं के परिणामस्वरूप बहुनीय कोशिकाओं की मात्रा का अधिक अनुमान लगाया जा सकता है और टेट्राप्लाइड कार्डियोमायोसाइट नाभिक आबादी के माप की सटीकता में कमी आ सकती है। इस समस्या को हल करने के लिए एक संभावित रणनीति कार्डियोमायोसाइट न्यूक्लियर मार्कर पीसीएम16,20का उपयोग करना होगा । हालांकि, हमें ठीक से तय कोशिकाओं या ऊतकों पर विश्वसनीय PCM1 धुंधला प्राप्त करने में कठिनाइयों का पड़ा है।
एक और संभावित सीमा यह है कि कुछ परमाणु दाग छवियों में महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि साइटोप्लाज्मिक धुंधला हो सकता है, जो व्यापक प्रीप्रोसेसिंग के बिना फिजी के तरीकों में निर्मित का उपयोग करके उचित थ्रेसहोल्डिंग को रोकता है। इसके अलावा, प्लॉयडी अनुमानों में इस पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस का अनियमित योगदान उनकी सटीकता को कम करता है। इसके अलावा, यदि कोशिकाओं को पर्याप्त समय के लिए डीएनए-धुंधला समाधान में नहीं छोड़ा जाता है, तो फ्लोरोसेंट डाई नाभिक के भीतर संतृप्ति के लिए बाध्य नहीं होगा और परमाणु एकीकृत तीव्रता और डीएनए सामग्री के बीच एक रैखिक संबंध की धारणा अब सटीक नहीं होगी।
यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सॉफ्टवेयर कार्डियोमायोसाइट क्लस्टर को सेगमेंट नहीं कर सकता है और इसके बजाय उन्हें विश्लेषण से हटा देता है। इसलिए, अपेक्षाकृत कम घनत्व (जैसे, 1000 कोशिकाओं/सेमी2)पर कार्डियोमायोसाइट्स को बीज करना गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, सॉफ्टवेयर दो कार्डियोमायोसाइट्स के बीच अंतर नहीं कर सकता है जो अंत से अंत तक लाइन में खड़ा है और लंबे समय तक, एकवचन कार्डियोमायोसाइट्स। इस प्रकार के समूह गलती से बहुनीय अनुमानों को बढ़ा सकते हैं ।
यद्यपि वर्णित विधि व्यवहार्य कार्डियोमायोसाइट्स प्राप्त करने की अनुमति नहीं देती है और इस प्रकार गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं को मापने के लिए उपयोग नहीं किया जा सकता है, यदि लक्ष्य इम्यूनोस्टेपिंग करना है, तो हमारा मानना है कि वर्णित विधि कार्डियोमायोसाइट्स की अधिक पैदावार और आकृति विज्ञान और प्रोटीन स्थानीयकरण के मामले में बेहतर गुणवत्ता के साथ मौजूदा प्रोटोकॉल से बेहतर है। अंत में, वर्णित विधि का उपयोग कार्डियोमायोसाइट्स को नैदानिक नमूनों से अलग करने के लिए किया जा सकता है14,21. हमारा मानना है कि वर्णित पद्धति विभिन्न शोधकर्ताओं को उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स प्राप्त करने और नए कार्डियोमायोसाइट गठन के लिए किराए के रूप में नाभिक और प्लॉयडी को मापने में मदद कर सकती है।
The authors have nothing to disclose.
जेएचवीबी को एनआईएच, पुनर्योजी चिकित्सा मिनेसोटा और हार्टवेल फाउंडेशन से एक व्यक्तिगत बायोमेडिकल रिसर्च अवार्ड से अनुदान द्वारा समर्थित किया जाता है।
96 wells plate for imaging | Corning | 3340 | We use these plates as they are suitable for imaging, although glass bottom plates would be better for confocal imaging |
Alpha actinin | Novus Biologicals | NBP1-32462 | This antibody is used as a marker of cardiomyocyte sarcomeres |
Blunt scissors | Fine Scissor Tools | 14072-10 | We prefer blunt scissors as the possibility of tearing heart tissue is lower when exposing the heart |
C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
CD-1 mice | Charles river | 22 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
Collagenase 2 | Worthington | LS004177 | For the purpose of this protocol, the batch to batch differences are minimal and don't affect overall yield and quality of the isolation |
Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165-10G | For edu staining |
Cy5 Picolyl Azide | Click Chemistry Tools | 1177-25 | Azide used for edu staining |
Cytation3 | BioTek | – | Used for automated imaging for DNA analysis |
DAPI | Life Technologies | D3571 | DAPI used for DNA staining. Stocks were dissolved in distilled water. |
donkey anti-mouse IgG-Alexa568 | Life Technologies | A10037 | Secondary antibody used to detect alpha actinin staining within cardiomyocytes |
Forceps | ROBOZ | RS-5137 | We use these curved, blunt forceps, although straight forceps could also be used |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144212 | To set pH of Tris-HCl buffer to pH 8.5 |
ImageJ | imagej.net/Fiji/Downloads | – | Used for analyzing images |
L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 255564-100G | For edu staining |
Needle for infusion | TERUMO | SV*23BLK | We use winged infusion sets throughout the protocol as it is easy to manipulate the position of the needle with these sets during injection |
Nikon A1R HD25 | Nikon | – | Used to take confocal images of alpha actinin staining |
Nylon mesh 200 micron | Elko filtering | 03-200/54 | Mesh used for filtering regular cardiomyocytes (not hypertrophied) |
Nylon mesh 400 micron | Elko filtering | 06-400/38 | Mesh used for filtering hypertrophied adult cardiomyocytes |
Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21-040-CV | This can also be prepared in the lab. Although sterility is important in this experiment, we think it is sufficient to prepare PBS and filtering it |
Potassium chloride, Granular | Mallinckrodt | 6858 | Granular potassium chloride was preffered by us as it forms less aggregates when stored in room temperature |
R | r-project.org | – | Used for data analysis of the measurements obtained from images |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | Used to buffer EdU staining reaction |