Extracellulär multi-enhetsregistrering från luktnerven är en känslig, robust och reproducerbar metod för bedömning av luktkänslighet hos marina fiskar. Den registrerar primär sensorisk ingång och är oberoende av extern salthalt.
Nyligen genomförda studier har visat att havsförsurning påverkar luktdrivet beteende hos fisk. Detta kan delvis bero på en minskning av luktkänsligheten i högt PCO2/lågt pH-vatten. För att bedöma effekterna av havet försurning, eller lukt känslighet i marina fiskar i allmänhet, föreslår vi att extracellulära flera enheter inspelning från luktnerven är metoden för val. Även om invasiva, det är känslig, robust, reproducerbara och oberoende av yttre salthalt (till skillnad från elektro-olfactogram [EOG], till exempel). Vidare registrerar den en primär sensorisk ingång i CNS, före all centralbearbetning. Vi visar att denna metod kan visa en minskning av lukt känslighet som är både tillfälliga och luktberoende- beroende, med hjälp av en rad aminosyror att konstruera koncentration-respons kurvor och beräkna tröskelvärdena för detektion.
Fisk är starkt beroende av olfaction för många aspekter av deras liv, inklusive att hitta mat, undvika rovdjur, bedöma potentiella kompisar och migration, bland annat1,2,3. Därför bedöma luktkänslighet i fisk (Vad luktar de? Hur känsliga är de för dessa föreningar?) är livsviktigt för att till fullo förstå dessa processer. Vidare kan antropogena effekter på miljön, såsom havsförsurning och föroreningar, ha djupgående effekter på luktsystemet, även vid subletala nivåer, eftersom det nödvändigtvis är i intim kontakt med det omgivande vattnet4. In vivo elektrofysiologi är den experimentella metoden i valet att bedöma luktkänslighet i fisk. Tre huvudtekniker finns: elektro-olfactogram (EOG), elektro-encefalogrammet (EEG) som registrerats från luktbulben, och multienhetsregistrering från luktnerven5.
EOG är den mest använda av dessa tre6. Det är en likström (DC) fält potential registreras ovanför lukt epitel och tros vara den summerade generator potentialer av dessa luktreceptor nervceller (ORNs) svarar på en given lukt. Men eftersom det registreras i vattnet, snarare än inuti fisken, är amplituden av svar inte bara beroende av den signal som fisken genererar, men också på ledningsförmågan hos det omgivande vattnet; ju högre ledningsförmåga (eller ju lägre motståndet är), desto lägre blir amplituden. Detta kan innebära att EOG är en mindre känslig metod i havsvatten än sötvatten7.
EEG registreras från luktbulben är också allmänt används i undersökningen av olfaction i fisk. Luktbulben är dock första ordningens bearbetningscenter för luktsensorisk ingång8; det är mycket organiserad i glomeruli, och följaktligen svaret registreras beror starkt på positionen för inspelningen elektroder. Till exempel, den input från ORNs upptäcka aminosyror bearbetas av glomeruli i den laterala regionen av luktlökar, medan att från conspecific-derived kemikalier riktas till den mediala regionen9,10,11,12. Feromonal ingång kan riktas till mycket lokaliserade glomeruli inom luktbulben. Beroende också på anatomin hos arten i fråga, kan den idealiska inspelningspositionen för en given luktdyr inte vara lättillgänglig.
Flera enheter inspelning från lukt nerv kringgår de viktigaste problemen med EOG och EEG beskrivs ovan. Eftersom det registrerar åtgärder potentialer passerar ner axoner av ORNs från epitel till glödlampan, det är en primär sensorisk signal. Och eftersom det registreras inuti fisken, amplituden av svar är oberoende av yttre salthalt. Ändå har det naturligtvis vissa nackdelar. För det första, beroende på anatomin av arten, mer omfattande kirurgi krävs för att exponera luktnerven än för EOG. För det andra, eftersom signalen är mindre än EOG, kräver det något mer sofistikerad, och därför dyr, utrustning. En allmän beskrivning av andra experimentella metoder ges av John Caprio5. Syftet med denna artikel är att beskriva hur man registrerar extracellulära flera enheter svar från luktnerven i havsbrädet (Sparus aurata) in vivo till aminosyra luktämnen som ett exempel på denna teknik, och hur man kan identifiera, och övervinna, några av de mer vanliga problem som uppstått i ett sådant experiment.
Den aktuella studien beskriver användningen av flerenhets (extracellulär) inspelning från luktnerven i havsbjälkar (S. aurata), en marin sparid av stor betydelse inom vattenbruket. Denna experimentella metod kan dock i stort sett tillämpas på andra fiskar; kommer kirurgi och exakt placering av elektroder klart beroende av luktsystemets anatomi, och valet och koncentrationen av bedövningsmedel kan bero på de arter som studeras. Till exempel är luktnerven av guldfisken (Carassius auratus) kort; i detta fall, inspelning av EEG från luktbulben skulle vara lättare. Valet av luktrant kan också i viss mån bero på arten. Den aktuella studien använde aminosyror. Såvitt författarna känner till, alla fiskarter undersökts hittills har luktkänslighet för aminosyror1,18. Denna känslighet har varit inblandad är olika processer såsom mat plats, kemisk kommunikation och erkännande av natala vatten19,20,21,22,23. Olika arters känslighet är dock i stort sett ganska lika och beror inte på livsstil eller livsmiljö. De är också väldefinierade molekyler och är billigt och lätt tillgängliga. Dessa skäl gör dem till ideala teststimuli för studier på olfaction i fisk, särskilt de som undersöker effekterna av antropogena störningar (t.ex., försurning eller föroreningar), där resultaten lätt kan jämföras över art24.
Beroende på arten i fråga kan förberedelserna för flerenhetsregistrering förbli stabila i flera timmar; amplituden för respons på den interna standarden (10-3 M L-serin i den aktuella studien) inte bör variera med mer än 10% mellan successiva tester. Varje betydande avvikelse från denna tumregel skulle kunna bero på: (i) förflyttning av fisken, och därför förskjutning av elektroderna och / eller nos-röret; ii) Förorening av vattnet, till exempel genom att komma i kontakt med försöksörens händer (särskilt om lägre koncentrationer av en given luktämne ger större svar än högre koncentrationer). eller (iii) försämring av preparatens hälsa). I fall i bör fisken kontrolleras för att ha flyttat; om så är, placera om den, och tillsätt mer bedövningsmedel till vattnet och / eller ge en annan dos av gallamin trietiodide. Låt 5 min och testa standarden igen. Om svaret fortfarande är mindre, flytta sedan om elektroderna och/eller nosröret tills ett tillräckligt stort svar registreras. I fall (ii), helt enkelt remake en färsk utspädning serie av lukt, med hjälp av rena glas och vatten. I fall iii, kontrollera att vattenflödet över fiskens gälar är tillräckligt, att vattnet rinner över gälarna (dvs. utträde via opercula, snarare än munnen), och vattnet är väl luftat. Olika fiskarter har vitt skilda temperaturpreferenser; se till att laboratoriets) temperatur (och det vatten som kommer i kontakt med fisken) ligger så nära temperaturen att fisken hålls vid som möjligt. Se också till att fisken inte är stressad och undvik att flytta dem (även från en tank till en annan) i minst en vecka före inspelningen. Elektriskt brus är naturligtvis bane av en elektrofysiolog liv; dock, den nuvarande artikeln är inte lämpligt medium för att diskutera hur man kan övervinna / minska detta. Ändå är ‘The Axon Guide’ (finns fritt som en pdf för nedladdning från tillverkarens hemsida) en källa till praktiska råd om bullerminimering. När en stor, stabil respons framkallas av standard stimulans, och en koncentrationsserie ger en koncentrationsberoende ökning av amplitud, med minimal respons på det tomma, kan inspelningssvar för att testa stimuli börja. Vissa författare ger samma stimulans tre gånger, och beräknar det aritmetiska medelvärdet för efterföljande dataanalys. Dessa är dock tekniska replikat, och detta tillvägagångssätt kommer att öka den tid en inspelningssession tar med trefaldigt. De nuvarande författarna föredrar att testa en given lukt en gång, men alltid en del av en koncentration-responskurva. Detta tillåter inte bara beräkning av tröskelvärdet för detektion eller EC50 (enligt beskrivningen), utan säkerställer också att koncentrationer nära dem som fisken skulle uppleva i sin naturliga miljö testas (detta är inte alltid känt). Dessutom är eventuella extremreaktioner, på grund av kontaminering till exempel, lättare att upptäcka; dessa kan sedan upprepas med hjälp av ett nygrigt prov om så behövs.
Multi-enhet inspelning från luktnerven kan vara invasiva, men det är mer känslig än EOG när registreras i havsvatten7, eftersom det är oberoende av yttre salthalt. Det kan därför användas för att bedöma luktkänslighet för luktämnen, såsom kalcium och natrium, förändringar i koncentrationerna av vilka också skulle påverka ledningsförmågan och följaktligen spänningar som registrerats15. Som en uppskattning av antalet ORNs som svarar på en given lukt (dvs. aktionspotentialer som färdas längs ORN-axoner från luktepitel till glödlampan) representerar den en rå, obearbetad signal (initial bearbetning av luktinmatning börjar i glödlamporna). Därför är det en bättre parameter att bedöma de direkta effekterna av föroreningar, såsom tungmetaller, och miljöförändringar, såsom pH, på luktsystemet än EOG eller EEG24,25. Inspelning från luktbulben i havsvatten med hög PCO2 (och därför lågt pH) kan påverkas av centrala effekter av pH på neural bearbetning; den ‘GABAEn receptor teori’ av havet försurning26, varvid minskning av vatten pH orsakar en omfördelning av Cl– och HCO3– jon i CSF och en därav följande förskjutning av GABAergic aktivering från hämmande (hyperpolariserande) till excitatoriska (depolariserande). I sådana studier är det dessutom viktigt att bedöma effekterna av försurning eller föroreningar som använder luktkoncentrationer liknande dem som fisken sannolikt kommer att stöta på i sin naturliga miljö. För aminosyror, Detta är i nano till mikromolar intervall27,28,29; nära tröskelvärdet för detektion av dessa föreningar i fisk1,18. Skattning av tröskeln för detektion för en given lukt kan ge en uppfattning om olfaktorkänslighetens betydelse och/eller biologiska roll. Till exempel har havets nejonögat (Petromyzon marinus) hög luktkänslighet för specifika gallsyror som frigörs av larver ner till en tröskel på 10-13 M30; denna känslighet gör det möjligt för vuxna att lokalisera och identifiera lämpliga lekområden, och fungerar därför som en flyttande feromon över långa avstånd. På samma sätt har mogen kvinnlig havsneony hög luktkänslighet för spermin (tröskel 10-14 M), en polyamin som frigörs i milten av hanar, som sedan lockar dem till bon av spermiating hanar31. Annan fisk har också luktkänslighet för polyaminer32,33,34,35, men inte med tillräckligt låga tröskelvärden för detektion för att stödja en liknande feromonalitet roll; istället föreslås undvikande av förfallna fiskar. Trots detta med så höga luktkänsligheter, är det möjligt att föreställa sig att en liten minskning av känsligheten (dvs. höjning av tröskelvärdet), även när svarsamplituden inte minskas dramatiskt, skulle kunna orsaka svåra problem för fisk24.
När plottas semi-logaritmically, koncentration-respons kurvor till luktämnen kan vara exponentiell, linjär eller sigmoidal18. När det gäller aminosyror är sådana halvdologeritmiska koncentration-responskurvor antingen linjära (dvs. logaritmiska), sigmooidala eller effektfunktioner7. Att ingen mättnad av svaret ses (dvs. ingen platå i koncentration-responskurvan, även vid supra-miljökoncentrationer) beror förmodligen på flera receptorer som binds till enskilda aminosyror, beroende på deras koncentration, snarare än varje aminosyrabindning till en specifik receptor; som koncentrationen av en given aminosyra ökar, fler receptorer kan binda den och därför svara. Trots det kan fisk skilja mellan blandningar av aminosyror36,37,38,39; detta är sannolikt på grund av kombinatoriska mönster av aktivitet framkallas i luktlökar12,40; axoner av alla ORNs som uttrycker den samma receptorproteinet avslutar på samma glomeruli i luktglödorna41,42, och en amino syra kan aktivera mer än en glomerulus.
Mycket specifika luktämnen, såsom feromoner, kan dock framkalla sigmooidala eller kvasi-sigmoidala koncentration-responskurvor43,44. Slutsatsen, även om inte empiriskt testas, är att dessa luktsvar beror på mycket specifika receptorer som binder feromonmolekylen och lite annat. Därför, över en given koncentration, alla receptorer är upptagna, och ytterligare ökningar kommer att framkalla några ytterligare svar i andra ORNs. Därför kan dessa uppgifter monteras på en tre-parameter Hill tomt, och maximal respons, EG50 och Hill co-effektiv kan beräknas15,45,46. Detta kan ge värdefull information, såsom skenbar affinitet och skenbart receptortal, som linjära eller exponentiella koncentration-responskurvor inte kan ge.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet i författarnas labb stöds av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal, projekten PTDC/BIA-BMA/30262/2017 och UID/Multi/04326/2019 och kontraktsprogrammet DL57/2016/CP1361/CT0041 till ZV.
AC pre-amplifier | Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) | NL104 | Neurolog pre-amplifier specifically designed for this type of recording. |
Digidata | Molecular Devices, LLC. (San Jose, CA, USA) | 1440A | Analogue-digital converter. |
EMG Integrator | Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) | NL703 | Leaky' electrical integrator to integrate raw activity of the nerve. |
Faraday cage | Made in-house | To reduce electrical noise. | |
Filter | Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) | NL125/6 | Filter module for electrophysiological recording. |
Gallamine triethiodide | Sigma-Aldrich (Portugal) | G8134 | Neuromuscular blocker |
L-glutamine | Sigma-Aldrich (Portugal) | G3126 | Amino acid used as odorant |
L-leucine | Sigma-Aldrich (Portugal) | L80000 | Amino acid used as odorant |
L-serine | Sigma-Aldrich (Portugal) | S4500 | Amino acid used as odorant |
Metalic base-plate | Any | Provides base for micro-manipulators. | |
Micro-hematocrit tubes | Any | To position water supply to the olfactory epithelium | |
Micro-manipulators | Narishige International Ltd (London, UK) | M-152 | Position electrodes |
MS222 (ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma-Aldrich (Portugal) | E10505 | Anesthetic |
pH probe | Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) | HI12302 | Probe to measure pH of water. |
Refractometer | Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) | HI96822 | Refractometer to measure water salinity |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich (Portugal) | 746398 | For saline solution |
Solenoid valves | The Lee Co. (Essex, CT, USA) | LFAA1201618H | For switching between background water and stimuus solutions (no longer available) |
Stereo-microscope | Zeiss, Leica, Olympus | Any suitable model. | For dissection and placement of electrodes. |
Titrator | Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) | HI84531 | Titrator to measure water alkalinity, pH and temperature. |
Tungsten micro-electrodes 0.1 MΩ | World Precision Instruments (Hitchin, UK) | TM31A10 | Extracellular electrodes. |
Valve Driver | Made in-house | 12 V DC source for operating solenoid valves. | |
Water pump (submersible) | Any | To supply anesthetic-containing water to the gills of the fish. |