Summary
후각 신경에서 세포 외 다단위 기록은 해양 물고기의 후각 감도를 평가하기위한 민감하고 견고하며 재현 가능한 방법입니다. 그것은 기본 감각 입력을 기록하고 외부 염도의 독립적이다.
Abstract
최근 연구에 따르면 해양 산성화는 물고기의 후각 중심 행동에 영향을 미칩니다. 이는 부분적으로 높은 PCO2/낮은pH 물에서 후각 감도의 감소때문일 수 있다. 해양 산성화또는 해양어류의 후각 민감도의 효과를 평가하기 위해 후각 신경으로부터 세포외 다단위 기록이 선택방법임을 제안합니다. 침습적이지만 민감하고 견고하며 재현 가능하며 외부 염도와 무관합니다(예를 들어 전기 올리티그램[EOG]과는 달리). 또한 중앙 처리 전에 CNS에 대한 1차 감각 입력을 기록합니다. 우리는 이 방법이 농도 반응 곡선을 구성하고 검출의 임계값을 계산하기 위하여 아미노산의 범위를 사용하여, 임시 및 냄새에 의존하는 후각 감도의 감소를 보여줄 수 있다는 것을 보여줍니다.
Introduction
물고기는 음식을 찾고, 육식 동물을 피하고, 잠재적 인 동료와 이주를 평가하고, 다른 사람의 사이에서1,,2,,3을포함하여 삶의 많은 측면에 대한 olfaction에 크게 의존합니다. 따라서, 물고기의 후각 감도 평가 (그들은 어떤 냄새가 나는가? 그들은 이 화합물에 얼마나 민감합니까?) 이러한 프로세스를 완전히 이해하는 데 필수적입니다. 더욱이, 해양 산성화 및 오염과 같은 환경에 대한 인위적영향은 주변물과 반드시 밀접한 접촉이기 때문에, 심지어 아묘한 수준에서도 후각 시스템에 지대한 영향을 미칠 수 있다4. 생체 내 전기 생리학은 물고기의 후각 민감성을 평가하기 위한 실험적인 접근법입니다. 세 가지 주요 기술을 사용할 수 있습니다: 전기-olfactogram (EOG), 후각 전구에서 기록 된 전기 뇌전 (EEG), 후각 신경에서 다중 단위 기록5.
EOG는 이 세 가지 6 중 가장 널리 사용되는것입니다. 그것은 직접 전류 (DC) 후각 상피 위에 기록 된 필드 잠재력 및 주어진 된 냄새에 응답 하는 그 후각 수용 체 뉴런의 합계 된 발생 기 잠재력 것으로 추정 된다. 그러나, 물고기 내부가 아닌 물에 기록되기 때문에, 반응의 진폭은 물고기에 의해 생성된 신호뿐만 아니라 주변 물의 전도도에 의존한다. 전도도가 높을수록(또는 저항이 낮음), 하부진이 된다. 이는 EOG가 담수7보다바닷물에서 덜 민감한 방법임을 의미할 수 있다.
후각 전구에서 기록된 EEG는 또한 물고기의 olfaction를 조사하는 데 널리 사용됩니다. 그러나 후각 전구는 후각 감각 입력8을위한 1차 처리 센터입니다. 그것은 매우 구체로 조직되고, 결과적으로 기록 된 응답은 기록 전극의 위치에 크게 의존한다. 예를 들어, 아미노산을 검출하는 ORNs로부터의 입력은 후각 전구의 측면 영역에서 사구에 의해 처리되는 반면, 콘특이성 유래 화학물질로부터 내측 영역99,10,,11,,12로향한다. 페로몬 입력은 후각 전구 내에서 고도로 국소화된 구체로 향할 수 있다. 또한 문제의 종의 해부학에 따라, 주어진 냄새에 대한 이상적인 기록 위치는 쉽게 접근 할 수 없습니다.
후각 신경에서 다중 단위 기록은 위에서 설명한 EOG 및 EEG의 주요 문제를 우회합니다. 그것은 전구에 상피에서 ORN의 축삭을 전달하는 작업 잠재력을 기록으로, 그것은 기본 감각 신호입니다. 그리고 물고기 내부에 기록되기 때문에 반응의 진폭은 외부 염도와 독립적입니다. 그럼에도 불구하고, 물론 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, 종의 해부학에 따라, 더 광범위한 수술은 EOG에 대한 것보다 후각 신경을 노출하는 데 필요합니다. 둘째, 신호가 EOG보다 작기 때문에 약간 더 정교하고 비용이 많이 드는 장비가 필요합니다. 다른 실험적 접근법에 대한 일반적인 설명은 존 카프리오5에의해 제공됩니다. 이 문서의 목적은 이 기술의 예로 아미노산 냄새물질을 생체내에서선천적(Sparus aurata)의후각 신경으로부터 세포외 다단위 반응을 기록하는 방법과 이러한 실험에서 발생하는 일반적인 문제 중 일부를 식별하고 극복하는 방법을 설명하는 것이다.
Protocol
동물 유지 및 실험은 인증된 실험 시설에서 수행되었으며 포르투갈 농림수산부, 농촌개발수산부에서 '그룹-1' 허가를 받아 포르투갈 국가법률(DL 113/2013)을 따랐다. 이 프로토콜은 동물 취급을 관련시키기 때문에, 과학 실험에 사용된 동물의 복지를 통제하는 지역 및/또는 국가 기관에 의해 승인되어야 합니다, 또한 연구원은 그 같은 절차를 실행하기 위하여 적당한 훈련 및 면허를 있어야 합니다.
1. 자극 준비
참고: 대부분의 물고기는 매우 민감한 후각 시스템을 가지고 있으므로 실험에 사용할 후각 자극을 준비할 때 세심한 주의를 기울여야 합니다. 자극을 구성하는 데 사용되는 유리 제품은 5 % 표백제 (하이포클로리트 나트륨)로 씻어야하며 수돗물로 철저히 헹구고 건조해야합니다. 사용 직전에 바닷물로 유리제품을 완전히 헹구십시오 (자극 희석을 만드는 데 사용되는 것과 동일한 물). 이 물 중 어느 것도 맨살과 접촉하지 않도록주의하십시오.
- 10-2 M L-글루타민, L-류신 및 L-세린의 100mL을 확인하십시오. 사용할 때까지 -20 °C에 각각 1 mL 알리쿼트저장하십시오.
- 실험 당일, 이러한 알리쿼트,10-3M ~10-7M 용액(x10 희석 단계)에서 제어 및 높은CO2 바닷물을 모두 사용하여 준비한다.
참고: L-세린(10-3M)은 양수 제어 또는 표준으로 사용됩니다.-3 자극의 희석을 구성하는 데 사용되는 물은 자극과 정확히 동일한 방식으로 처리되지만 악취를 추가하지 않고 부정적인 제어 또는 빈으로 사용됩니다.
2. 제어 및 높은 CO2 물 의 준비
- 숯여과 해수 1L을 수거하여 제어수를 준비합니다.
- pH 프로브를 사용하여, pH를 확인; 그것은 약 8.2해야합니다. 그렇지 않은 경우 이 pH에 도달할 때까지 대기 공기로 거품을 내립니다.
- 알칼리성 티타터를 사용하여 물의 알칼리성을 측정합니다.
- 수온과 명분을 측정합니다.
- 원하는 pH에 도달할 때까지 1L의 해수를 걸과한 다음 CO2를 거품으로써 높은 CO2 물을 준비하십시오.
- pH 프로브를 사용하여, pH를 확인; 그것은 약 7.7이어야한다.
- 알칼리성 티타터를 사용하여 물의 알칼리성을 측정합니다.
- 수온과 명분을 측정합니다.
- 물에서 CO2 파라미터를 계산하도록 설계된 소프트웨어(예: CO2Calc 소프트웨어13)를계산하도록 설계된 소프트웨어를 사용하여 제어 및 고CO2 물 모두에서 CO2 압력을 결정합니다.
- 입력 창에서 물 pH, 온도, 염도 및 총 알칼리도의 값을 추가합니다(도1).
- 상수, 단위 및 축척을 선택합니다(그림 2에서권장값 참조).
- 버튼 프로세스를 눌러 CO2 압력을 결정합니다.
참고: 그림 3은 결과 시트의 예를 보여 주습니다.
3. 물고기의 준비
참고 : 200-400 g의 세모암이 프로토콜에 사용됩니다.
- MS222(에틸-3-아미노벤조이트 메탄술포네이트 염)가 함유된 이화 천연 해수에서 물고기를 마취시합니다. 꼬리 핀치에 대한 반응이 멈췄을 때, 신경 근육 차단제 갈라민 트리티오디드 (10 mg·kg-1생리식염수)를 측면 근육에 주입하십시오.-1
참고: 사용되는 마취제의 농도는 종마다 다릅니다. 200-400 g의 세월을 위해 200 mg을 사용하시면 L-1 400 mg으로 버퍼링· L-1 NaHCO3. - 마취된 생선을 쿠션지지에 놓습니다. 정확한 모양과 크기는 모델 종에 따라 달라집니다. 세모람(200-400g)의 경우, 집에서 만든 패딩 V자형 지지장치를 사용하세요.
- 실리콘 튜브(직경 = 10mm)를 입에 놓고, 마취함유, 해수의 저수지에 있는 잠수정 펌프에 튜브를 연결하고, 아가미 위에 물을 ~100mL/min·1kg-1로한다.-1
참고 : 사용되는 실리콘 튜브의 크기는 물고기의 크기에 따라 달라집니다. - 접지 핀을 측면 근육에 삽입하고 증폭기의 헤드 스테이지에 연결합니다.
- 젖은 천 (또는 종이 타월)으로 물고기를 덮어 머리만 노출시켜 덮개가 아가미에서 물 출구를 방해하지 않도록합니다.
참고: 눈은 젖은 종이/천 또는 검은 색 플라스틱 조각으로 덮여 있을 수 있습니다. - 자극 전달 시스템의 튜브, 즉 배경 해수 공급에 연결된 유리 튜브를 콧구멍에 배치합니다.
참고: 마이크로 헤마토크릿 튜브를 사용할 수 있습니다(길이 = 75mm, ID = 1.15mm, OD = 1.55 mm); 이들은 작은 물고기와 함께 사용하기 위해 전극 풀러에 미세 한 지점으로 당길 수 있습니다. 후각 상피가 수술 중에 젖은 상태로 유지되도록하는 것이 중요합니다 (아래에 설명된). - 눈 사이의 두개골의 피부와 뼈를 제거하여 후각 신경을 노출 (후각 신경은 일반적으로 눈 사이에 함께 실행) 치과 (이상적으로) 또는 취미 (예를 들어, 드레멜) 드릴 또는 보석의 연마기 (치과 드릴 비트) 해부 현미경 (Faraday 케이지 내부)에서.
- 세모암에서 두개골의 일부를 눈 바로 위에 제거하고 원형 톱으로 앞쪽에서 눈까지, 단지 뒤쪽으로 그(것)들을 위해. 그런 다음 드릴 비트를 사용하여 눈 사이의 뼈를 제거합니다. 후각 신경은 눈 사이에 놓여 있습니다.
- 충분한 뼈가 지워지면 미세 한 집게를 사용하여 신경을 덮어 지방과 결합 조직을 제거하십시오. 신경을 손상시키거나 혈관을 펑크하지 않도록주의하십시오.
참고: 경험은 해부를 구체화하는 데 도움이 될 것입니다. 해부가 작을수록 준비가 안정적입니다. 그러나 충분한 조직을 지워야 합니다. 미숙한 경우 후각 전구가 보일 때 전구에 결합하여 전극의 올바른 위치를 허용하면서 신경 의 일부를 노출시키기 위해 약간 더 앞쪽으로 선명하게 선명하게 합니다. - 사용하기 전에 전극을 3V DC 소스의 음극에 연결하고 (예 : 2 개의 AA 배터리 시리즈)에 연결하고 20-30 s에 대한 생리식염수 (또는 담수에서 1:3 희석 된 바닷물)에 팁을 배치하여 사용하기 전에 전극을 청소하십시오. 작은 거품의 꾸준한 스트림은 끝에서 오는 볼 수 있어야합니다.
- 후각 신경이 노출되면, 표준(예:10-3 M L-세린)에 대한 최대 응답을 제공하는 위치에 기록 전극(마이크로 조작기에서 보유)을 삽입하고 빈에 대한 최소한의 반응을 제공합니다. 번갈아 가는 전류(AC) 프리앰프의 헤드 스테이지에 연결된 parylene 코팅 텅스텐 전극(재료표)을사용하십시오.
참고: 세브리암에서 아미노산에 대한 가장 강력한 반응은 일반적으로 신경의 측면 측면에 배치된 전극과 함께 후각 전구에 결합하는 위치에 가깝게 보입니다. 이것은 전구의 구체 조직이 종 사이에서 광범위하게 유사하기 때문에 다른 종에 대해 참을 수 있습니다. 그러나 경험은 항상 최고의 교사입니다.
4. 전기 생리학 기록
참고: 대부분의 전기 생리학과 마찬가지로 다중 유닛 레코딩은 패라데이 케이지 내에서 수행되어야 합니다. 그러나 세포외 기록은 일반적으로 진동 방지 테이블이 필요하지 않습니다. 대부분의 움직임은 물고기에서 올 것이다. 그럼에도 불구하고, 마이크로 조작기 스탠드의 자기 기지를 확보하기 위해 금속 표면으로 강력하고 안정적인 테이블이 필요합니다.
- 자극 전달 시스템을 설정하여 깨끗한 백그라운드 워터에서 자극 함유 물로 빠르게 전환할 수 있도록 합니다(예: 솔레노이드 작동식 3방향 밸브를 사용하). 일반적인 콘센트를 후각 로제트에 물을 운반하는 튜브에 연결하고 한 줄을 해수 저수지에 놓고 다른 한 줄을 시험 용액에 배치합니다.
참고: 밸브가 전환되면(DC 전류를 통과하여) 물 흐름이 배경 물에서 악취를 포함하는 것으로 전환합니다. 자극은 통합 된 응답에서 명확한 피크를 볼 수있을만큼 오랫동안 주어져야하며 숙박 기간이 뒤따릅니다. 현재 프로토콜에서 사용되는 시간은 4s이지만 종에 따라 더 긴 시간이 필요할 수 있습니다. - 밸브 드라이버를 아날로그 디지털 컨버터(예: Digidata)의 트리거에 연결합니다. 밸브가 백그라운드에서 자극 포함 라인으로 전환되면 데이터 기록이 시작됩니다. 트리거 이벤트에서 레코딩을 시작하고 미리 정해진 기간(예: 10s)을 계속하도록 소프트웨어를 구성합니다.
참고: 10초는 충분해야 하지만 실험적인 질문에 따라 단축되거나 길어질 수 있습니다. - 이 경우 표준,10-3 M L-세린을 반복적으로 테스트(통합 응답의 진폭을 기록하고 측정)하여 준비의 안정성을 확인하고 연속 자극 사이에 1분이 경과할 수 있도록 합니다.
참고: 종과 냄새에 어느 정도 따라, 응답은 서로의 10% 이내진폭을 가져야 하며(엄지손가락의 규칙) 신속한 발병이 있어야 하며, 최대 활성으로 상승하고, 자극이 없는 후 기준선으로 돌아와야한다(그림 4). - 제어 해수 (가장 낮은에서 가장 높은 농도)에서 아미노산에 후각 신경 반응을 기록하고 연속 자극 사이에 1 분 경과할 수 있습니다.
참고: 일부 종 및/또는 일부 냄새의 경우 더 많은 시간이 필요할 수 있습니다. 그러나 아미노산과 세브리암의 경우 1 분으로 충분합니다. - 10-3 M 세린과 컨트롤 워터 블랭크 용액에 대한 응답을 기록합니다.
- 배경물을 제어 해수에서 높은 CO2 바닷물로 변경하고, 높은 CO2 바닷물과 병으로 배경 선을 배치하여.
참고: 다른 헤마토크튜브(또는 이에 상응하는)를 자극및 배경선의 끝에 삽입하여 물에 닿지 않도록 하고 튜브의 끝이 물에 남아 있는지 확인하는 것이 좋습니다. - 높은CO2 바닷물에서 아미노산에 후각 신경의 반응을 테스트하기 전에, 후각 상피를 몇 분 동안 후각 상피 위에 높은 CO2 물을 따라 높은 CO2 물로 후각 상피를 조절한다.
참고: 경험에 따르면, 세모탐의 경우 5분이 면 충분합니다. - 높은 CO2 바닷물 (가장 낮은에서 가장 높은 농도까지)에서 아미노산에 대한 후각 신경 반응을 기록합니다.
- 높은 CO2 워터 블랭크 솔루션에 대한 응답을 기록합니다.
- 10-3 M 세린과 컨트롤 워터 블랭크 용액에 대한 응답을 기록합니다.
참고: 원시 신호(신경 활동)는 필터링되어야 합니다(약 2,000-5,000Hz, 하이 패스 50-300Hz) 아날로그 디지털 컨버터(재료표)로전달되어야 합니다. 신경 활성의 용이한 정량화를 위해, 원시 신호는 또한 새는통합자(재료의 표)를사용하여 통합될 수 있고, 거기에서, 원시 및 통합 신호를 적절한 소프트웨어(예를 들어, 악소스코프)를 실행하는 컴퓨터로 전달될 수 있다.
5. 데이터 분석
- 모든 자극에 대한 통합 된 응답의 진폭에서 빈 (mV)에 대한 통합 된 응답의 진폭을 뺍니다.
- 표준(10-3M 세린)에 대한 이전 응답의 진폭을 나누어 자극에 대한 응답을 정상화; 이렇게 하면 생선 간 및 내 가변성을 줄입니다.
- 수식,14로그(N + 1.5) =로그 C + B에따라 농도 응답 곡선의N 선형 회귀에 의해 검출임계값을 계산하여 검출의 임계값을 N 계산합니다. b
참고: 검색 임계값은 y = 0.1761(즉, 로그 1.5)이 있는 x값입니다. N = 0); 응답이 보이는 위의 농도 (즉, 물고기는 냄새를 맡을 수 있습니다). 일부 악취는 반 logarithmically 플롯 할 때 sigmoidal 농도 반응 곡선을 불러 일으킨다 (예를 들어, 칼슘15,,16;이 경우, 정규화된 데이터는 최대 응답 진폭과 EC50 (즉, [악취]을 줄 것이다 3 매개 변수 힐 플롯에 장착 될 수 있습니다 절반 최대 응답을 제공; 또한 감도의 측정). - 검출 및/또는 제어수에서 테스트된 자극의 EC50 및 높은CO2 물에서 테스트된 자극의 최대 응답 진폭의 임계값을 비교합니다.
Representative Results
양수 제어에 대한 전형적인반응(10-3 M L-세린; 그림 4A)및 음수 제어(공백; 도 4B)해골의 후각 신경으로부터 기록된 도 4가 도 4로나타났다. 자극(블랙 수평 막대; 후각 구멍 에, 후각 상피와 접촉)의 존재에서, 활동의 급속한 증가 (통합 된 신호의 상향 편향에 반영) 자극 개시의 약 1 초 이내에 피크로, 숙박 기간 (자극이 여전히 존재하는 동안), 및 자극이 끝나면 기준 활성에 반환. 응답의 절대 진폭은 전극 위치에 크게 의존한다; 낮은 진폭 응답이 기록되면 전극 위치를 변경해 보십시오. 피크 활성으로의 느린 상승은 후각 상피로 자극 함유 물을 운반하는 튜브가 상피로부터 너무 멀리 떨어져 배치되기 때문일 수 있다. 코 튜브를 상피에 가깝게 이동하십시오 (만지지 는 않지만) 상피. 반대로 공백은 응답을 거의 또는 전혀 불러 일으킵니다. 빈에 대한 유의한 긍정적 반응(즉, 활동 증가)은 자극의 희석을 만드는 데 사용되는 물의 오염을 나타낼 수 있다. 깨끗한 물 (및 유리 제품)으로 신선한 희석을 만드는 것은이 문제를 해결해야합니다. 그렇지 않은 경우, 물 시스템 (활성 탄 필터 포함)의 보다 철저한 세척이 필요할 수 있습니다. 음의 반응(즉, 활동 감소)은 밸브가 밸브의 막힘으로 인해 전환될 때 유량의 약간의 변화를 나타낼 수 있다.
L-류신(10-7 M ~10-3M)에 대한 전형적인 농도 응답-7 곡선(플롯 반-logarithmically)은 도 5A에도시된다. 악취의 농도가 증가하면 활동이 점점 더 크게 증가하므로 통합 된 응답의 진폭이 발생합니다. 정규화된 데이터의 플롯과 해당 선형 회귀는 도 5 Figure 5B에표시됩니다. 예상 검출 임계값은 y = 0.1761(즉, log1.5; N = 0)일 때 x 값에서 계산할 수 있습니다. 이 경우 이 값은 -7.48입니다. 즉,이 물고기에서 L-류신에 대한 계산 된 임계 값은 10-7.48 M입니다. 지수 α는 로그 플롯에서 정규화된 데이터의 선형 회귀로부터 유사하게 추정될 수 있다. 로그N = αlog[냄새] + 상수. 인자 γ는 다음 하나의 로그 단위에 의해 반응 진폭을 증가시키는 데 필요한 악취 농도의 증가를 제공합니다; 즉, 농도 응답곡선(17)의가파르도의 추정치이다. 이 예에서, α = 0.277 및 γ = 3.61; 따라서 반응 진폭을 10배 증가시키기 위해(즉, 1개의 로그 유닛; log10 = 1), 자극 농도가 10 3.61-접기(4,074배)까지 증가되어야 한다.3.61
대표적인 시그로이드 농도 반응곡선(도 6A)은반로가리타민을 플롯할 때, 이 경우 L-글루타민에, 도 6B로도시된다. 반응 진폭에서 유사한 농도 의존성 증가가 보입니다. 그러나, 더 높은 농도에서, 이 증가는 응답 진폭이 최대(Nmax)에도달할 수 있도록 덜 된다. 이렇게 하면 데이터를 세 가지 매개 변수 Hill 방정식에 장착할 수 있습니다.
이러한 방식으로 EC50(최대 응답이 50%인 악취 농도)과 힐의 공동 효율(시그모이드 곡선의 선형 부분의 경사의 가파른 측정)을 계산할 수 있다.
그림 1: 프로그램 CO2Calc의 입력 창을 보여주는 소프트웨어 스크린샷입니다. 강조 표시된(빨간색 상자)는 탄산 매개 변수 계산에 필요한 필드입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 적절한 상수, 단위 및 저울에 대한 입력 창을 보여주는 소프트웨어 스크린샷입니다. 표시된 값은 설명된 실험이 수행된 조건에 권장됩니다. 변경될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 결과 창을 보여주는 소프트웨어 스크린샷입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4:10-3 M L-세린(A) 및 빈(B)에 대한 응답으로 생체내 의 후각 신경으로부터 세포외로 기록된 전형적인 다중 단위 응답. 상부 추적은 통합된 응답을 나타내고 낮은 트레이스는 원시(신경) 신호를 표시합니다. 자극은 후각 상피(수평 막대)에 적용되었다. 노출 1s 동안 활동의 급속한 증가, 활동의 피크, 숙박 기간 (악취가 여전히 상피로 전달된 동안) 및 악취 전달이 중단되면 기준선 수준으로의 복귀에 유의하십시오. 오취제(blank)를 추가하는 것을 제외하고는, 악취 희석제와 같은 방식으로 처리된 물로 자극을 받은 후 활동이 거의 또는 전혀 증가하지 않는 것으로 볼 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: L-류신에 대한 전형적인 농도 반응 곡선은 생체 내 후각 신경으로부터 세포외로 기록되었다. (A)후각 상피(수평막대)에 적용된 L-류신의 농도가 10~7M에서10~3M로 증가함에 따라, 신경에서 수반되는 활동이 증가하는 것을 볼 수 있다.-3 상부 추적은 통합된 응답을 나타내고 낮은 트레이스는 원시(신경) 신호를 표시합니다. (B)정규화된 데이터의 선형 회귀(R2 = 0.97)는 로그(N + 1.5) = 0.1761(즉,N N=0)에 대한 값으로 검출 임계값을 계산하기 위해 N 반logarithmically 플롯하였다. 이 예제에서는 이 값이 -7.48입니다. 따라서 이 물고기에서 L-류신에 대한 검출의 추정 임계 값은 따라서 10-7.48 M. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: L-글루타민에 대한 일반적인 농도 반응 곡선은 생체 내 후각 신경으로부터 세포외로 기록되었다. (a)후각 상피(수평막대)에 적용된 L-글루타민의 농도가 10-7M에서10-3M로 증가함에 따라, 신경에서 수반되는 활동이 증가하는 것을 볼 수 있다.-7 상부 추적은 통합된 응답을 나타내고 낮은 트레이스는 원시(신경) 신호를 표시합니다. (B)3파라미터 힐 방정식(R2 = 0.99)에 장착된 정규화된 데이터의 반로개반면 플롯. 이 예제에서는 계산된 EC50 = 3.11 μM 및 힐 의 공동 효율 = 0.565). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
현재 연구는 해양에서 매우 중요한 해양 스페이드 인 seabream(S. aurata)의후각 신경에서 다중 단위 (세포 외) 기록의 사용을 설명합니다. 그러나, 이 실험적인 접근은 광범위하게 그밖 물고기에 적용될 수 있습니다; 전극의 수술 및 정확한 배치는 명확하게 후각 시스템의 해부학에 따라 달라집니다, 마취의 선택과 농도는 연구 하에 종에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어,금붕어(카라시우스 오라투스)의후각 신경은 짧다. 이 경우 후각 전구에서 EEG를 기록하는 것이 더 쉬울 것입니다. 냄새의 선택은 또한 어느 정도, 종에 따라 달라질 수 있습니다. 현재 연구는 아미노산을 사용. 저자가 알고있는 한, 현재까지 조사 된 모든 물고기 종은 아미노산1,18에후각 감도가 있습니다.1 이러한 민감도는 식품 위치, 화학통신,,산하19,20,,19,21,22,23등의 다양한 공정을 내포하고있다. 그러나, 다른 종의 감도는, 광범위하게 말하기, 오히려 유사하고 라이프 스타일이나 서식지에 의존하지 않습니다. 그들은 또한 잘 정의 된 분자이며 저렴하고 쉽게 사용할 수 있습니다. 이러한 이유로 물고기의 olfaction에 대 한 연구에 대 한 이상적인 테스트 자극, 특히 그 인위적 장애의 효과 조사 (예를 들어, 산성 화 또는 오염), 어디 결과 종에 걸쳐 쉽게 비교할 수 있습니다24.
문제의 종에 따라 다중 단위 기록 에 대한 준비는 몇 시간 동안 안정적으로 유지 될 수 있습니다. 내부 표준(현재 연구에서10-3 M L-세린)에 대한 응답진폭은 연속적인 시험 간에 10% 이상 차이가 없어야 합니다. 엄지 손가락의이 규칙에서 어떤 중요한 편차는 때문일 수 있습니다: (i) 물고기의 움직임, 따라서 전극 및 /또는 코 튜브의 변위; (ii) 물의 오염, 예를 들어, 실험자의 손과 접촉하여 (특히 주어진 악취의 낮은 농도가 더 높은 농도보다 더 큰 반응을 주는 경우); 또는 (iii) 준비의 건강의 악화). 경우에 (i), 물고기는 이동 한 경우 확인되어야한다; 그렇다면, 그것을 재배치하고, 물에 더 많은 마취제를 추가하고 / 또는 갈라민 트리에티오디드의 또 다른 복용량을 제공합니다. 5분 동안 허용하고 표준을 다시 테스트합니다. 응답이 여전히 작으면 충분히 큰 응답이 기록될 때까지 전극 및/또는 코 튜브를 재배치합니다. 경우에 (ii), 단순히 깨끗한 유리 제품과 물을 사용하여, 냄새의 신선한 희석 시리즈를 리메이크합니다. 경우에 (iii), 물고기의 아가미 를 통해 물의 흐름이 적절한 지 확인, 물이 아가미 (즉, 입보다는 오퍼큘라를 통해 종료) 통해 흐르는 것을 확인하고, 물은 잘 방출된다. 다른 어종은 온도 선호도가 크게 다르다. 실험실) 온도 (그리고 물고기와 접촉하는 물의)가 물고기가 가능한 한 유지되는 온도에 가깝습니다. 물고기가 스트레스를 받지 않도록 하고 녹음하기 최소 1주일 전에 (한 탱크에서 다른 탱크로도) 움직이지 않도록 하십시오. 전기 소음은 물론 전기 생리학자의 삶의 베인입니다. 그러나 현재 문서는 이를 극복/줄이는 방법을 논의하기에 적합한 매체가 아닙니다. 그럼에도 불구하고 , '축슨 가이드'(제조업체의 웹 사이트에서 다운로드할 수 있는 PDF로 자유롭게 사용할 수 있음)는 소음 최소화에 대한 실용적인 조언의 원천입니다. 일단 크고 안정적인 반응이 표준 자극에 의해 발생되고, 농도 계열은 빈에 대한 최소한의 반응으로 진폭의 농도 의존적 증가를 제공하며, 시험 자극에 대한 응답을 기록할 수 있다. 일부 저자는 동일한 자극을 세 번 주고 후속 데이터 분석을 위한 산술 평균을 계산합니다. 그러나 이러한 복제는 기술 복제이며 이 방법은 레코딩 세션이 세 배씩 걸리는 시간을 증가시게 됩니다. 현재 저자는 주어진 냄새를 한 번 테스트하는 것을 선호하지만 항상 농도 반응 곡선의 일부입니다. 이것은 검출 임계값 또는 EC50(설명된 대로)의 계산을 허용할 뿐만 아니라 물고기가 자연 환경에서 경험할 농도가 테스트되도록 합니다(항상 알려진 것은 아닙니다). 또한, 예를 들어 오염으로 인한 이상치 응답은 쉽게 발견할 수 있습니다. 이러한 샘플은 필요한 경우 갓 만든 샘플을 사용하여 반복할 수 있습니다.
후각 신경으로부터의 다중 단위 기록은 침습적일 수 있지만, 외부 염도와 무관하기 때문에 해수7에기록될 때 EOG보다 더 민감하다. 따라서 칼슘과 나트륨과 같은 악취에 대한 후각 민감도를 평가하는 데 사용할 수 있으며, 농도의 변화는 전도도에 영향을 미치고 결과적으로15도기록된 전압을 기록하였다. 주어진 냄새에 반응하는 ORN의 수(즉, 후각 상피에서 전구로 ORN 축축을 따라 이동하는 작업 잠재력)의 추정치로서, 그것은 원시, 처리되지 않은 신호(후각 입력의 초기 처리가 전구에서 시작됨)를 나타낸다. 따라서, EOG 또는EEG(24)및25보다후각 시스템에 중금속, pH 와 같은 오염물질의 직접적인 영향 및 pH와 같은 환경적 변화를 평가하는 것이 더 나은 파라미터이다. 높은 PCO2 (따라서 낮은 pH)와 바닷물에서 후각 전구에서 기록 신경 처리에 pH의 중앙 효과에 의해 영향을 받을 수 있습니다; 해양산성화의 'GABAA 수용체이론'(26)은수분 pH의 감소로 인해Cl-및 HCO3-이온의 재분배를 유발하고, CSF에서 이온과 억제(hyperpolarizing)에서 흥분(탈극화)으로 GABAergic 활성화의 결과적 변화.3 더욱이, 이러한 연구에서는, 물고기가 자연 환경에서 발생할 가능성이 있는 것과 유사한 냄새 농도를 사용하여 산성화 또는 오염물질의 효과를 평가하는 것이 중요하다. 아미노산의 경우, 이것은 나노에서 마이크로몰라 범위27,,28,,29; 물고기1,18에서이러한 화합물의 검출 임계값에가깝습니다. 주어진 냄새에 대한 검출 임계값의 추정은 후각 감도의 중요성 및 / 또는 생물학적 역할에 대한 몇 가지 아이디어를 줄 수 있습니다. 예를 들어, 바다램프레이(Petromyzon marinus)는애벌레에 의해 방출된 특정 담즙산에 대해10-13 M30의임계값까지 높은 후각 민감성을 갖는다. 이 감도는 성인이 적절한 산란 장을 찾고 식별 할 수 있으므로 장거리에서 철새 페로몬 역할을합니다. 유사하게, 잘 익은 암컷 바다 램프레이는 스퍼민 (임계값 10-14 M)에 높은 후각 감도를 가지고, 다음 정자 남성의 둥지에 그들을 유치 남성에 의해 milt에서 방출 폴리 아민(31). 다른 물고기는 또한 폴리 아민32,33,,,34,,35에후각 감도가 있지만, 유사한 페로몬 역할을 지원하기에 검출의 충분히 낮은 임계 값을 가지고; 대신, 부패 물고기의 회피를 제안한다. 그럼에도 불구하고, 이러한 높은 후각 민감성으로, 반응 진폭이 극적으로 감소되지 않더라도 감도의 약간의 감소(즉, 임계값 증가)가 물고기24에심각한 문제를 일으킬 수 있다고 상상할 수 있다.
반로가리타로 플롯될 때, 악취에 대한 농도 반응 곡선은 지수, 선형 또는시그모이드(18)일수 있다. 아미노산의 경우, 이러한 반로개심 농도 반응 곡선은 선형(즉, 로개반스믹), 시그모이드 또는 전력 기능7이다. 응답의 포화도가 보이지 않는다는 것은 (즉, 농도 반응 곡선의 고원이 없고, 심지어 수프라-환경 농도에서도) 아마도 특정 수용체에 결합되는 각 아미노산이 아닌 개별 아미노산에 결합하는 여러 수용체 때문일 수 있습니다. 주어진 아미노산의 농도 증가, 더 많은 수용 체 그것을 바인딩 하 고 따라서 응답할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 물고기는 아미노산의 혼합물을 구별할 수 있습니다36,,37,,38,,39; 이는 후각전구(12,,40)에서발생하는 조합적 활동 패턴 때문일 가능성이 있다. 동일한 수용체 단백질을 발현하는 모든 ORN의 축축은 후각전구(41,,42)에서동일한 구체로 메몰리로 종료되며, 하나의 아미노산은 하나 이상의 글로메룰러스를 활성화할 수 있다.
그러나 페로몬과 같은 매우 특이적인 악취는 시그모이드 또는 준시-시그모이드 농도 응답곡선(43,,44)을불러일으킬 수 있다. 추론, 비록 경험적으로 테스트, 이러한 후각 응답페로몬 분자와 거의 다른 바인딩 하는 매우 구체적인 수용 체 때문. 따라서, 주어진 농도 위의, 모든 수용체가 점유되고, 추가 증가는 다른 ORN에 있는 더 이상 반응을 불러 일으키지 않을 것입니다. 따라서 이러한 데이터는 3파라미터 힐 플롯에 장착할 수 있으며 최대 응답, EC50 및 Hill 의 공동 효율은15,,45,,46을계산할 수 있다. 이것은 명백한 친화성 및 명백한 수용체 수와 같은 귀중한 정보를 줄 수 있습니다, 그 선형 또는 기하급수체 농도 반응 곡선은 줄 수 없습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자의 실험실에서 작업은 Fundação 파라 Ciência e 테크놀로지아 (FCT), 포르투갈, 프로젝트 PTDC / BIA-BMA / 30262/2017 및 UID / Multi/04326/2019 및 계약 프로그램 DL57/2016/CP1361/CT004V에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AC pre-amplifier | Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) | NL104 | Neurolog pre-amplifier specifically designed for this type of recording. |
| Digidata | Molecular Devices, LLC. (San Jose, CA, USA) | 1440A | Analogue-digital converter. |
| EMG Integrator | Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) | NL703 | Leaky' electrical integrator to integrate raw activity of the nerve. |
| Faraday cage | Made in-house | To reduce electrical noise. | |
| Filter | Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) | NL125/6 | Filter module for electrophysiological recording. |
| Gallamine triethiodide | Sigma-Aldrich (Portugal) | G8134 | Neuromuscular blocker |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich (Portugal) | G3126 | Amino acid used as odorant |
| L-leucine | Sigma-Aldrich (Portugal) | L80000 | Amino acid used as odorant |
| L-serine | Sigma-Aldrich (Portugal) | S4500 | Amino acid used as odorant |
| Metalic base-plate | Any | Provides base for micro-manipulators. | |
| Micro-hematocrit tubes | Any | To position water supply to the olfactory epithelium | |
| Micro-manipulators | Narishige International Ltd (London, UK) | M-152 | Position electrodes |
| MS222 (ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma-Aldrich (Portugal) | E10505 | Anesthetic |
| pH probe | Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) | HI12302 | Probe to measure pH of water. |
| Refractometer | Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) | HI96822 | Refractometer to measure water salinity |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich (Portugal) | 746398 | For saline solution |
| Solenoid valves | The Lee Co. (Essex, CT, USA) | LFAA1201618H | For switching between background water and stimuus solutions (no longer available) |
| Stereo-microscope | Zeiss, Leica, Olympus | Any suitable model. | For dissection and placement of electrodes. |
| Titrator | Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) | HI84531 | Titrator to measure water alkalinity, pH and temperature. |
| Tungsten micro-electrodes 0.1 MΩ | World Precision Instruments (Hitchin, UK) | TM31A10 | Extracellular electrodes. |
| Valve Driver | Made in-house | 12 V DC source for operating solenoid valves. | |
| Water pump (submersible) | Any | To supply anesthetic-containing water to the gills of the fish. |
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