来自嗅觉神经的细胞外多单元记录是一种敏感、健壮和可重复的方法,用于评估海洋鱼类的嗅觉敏感性。它记录主要的感官输入,独立于外部盐度。
最近的研究表明,海洋酸化会影响鱼类的嗅觉驱动行为。这可能是由于高P CO2/低pH水的嗅觉敏感性降低。为了评估海洋酸化或嗅觉敏感性对海洋鱼类的影响,我们建议从嗅觉神经进行细胞外多单元记录是首选方法。虽然具有侵入性,但它具有敏感、坚固、可重复性和独立于外部盐度(例如,与电-生物图 [EOG]不同)。此外,在进行任何集中处理之前,它记录了对 CNS 的主要感官输入。我们表明,这种方法可以显示嗅觉敏感性的降低,既是暂时的,又与气味相关,使用一系列氨基酸来构造浓度-反应曲线并计算检测阈值。
鱼类在生活的许多方面都严重依赖动物,包括寻找食物、避开食肉动物、评估潜在的配偶和迁徙,等1、2、3。213因此,评估鱼的嗅觉敏感性(它们的气味是什么?它们对于这些化合物有多敏感?)充分了解这些过程至关重要。此外,人为影响对环境的影响,如海洋酸化和污染,可能对嗅觉系统产生深远的影响,即使在亚致命水平,因为它必然与周围的水亲密接触4。体内电生理学是评估鱼类嗅觉敏感性的实验方法。有三种主要技术可用:电声像(EOG),脑电图(EEG),从嗅球记录,多单元记录从嗅觉神经5。
EOG是这三个6中应用最广泛的。它是一个直接电流(DC)场电位记录在嗅觉上皮之上,被认为是这些嗅觉受体神经元(ORN)对给定气味反应的总结发生器电位。然而,由于它记录在水中,而不是在鱼体内,反应的幅度不仅取决于鱼产生的信号,还取决于周围水的电导率;电导率越高(或电阻越低),振幅越低。这可能意味着EOG在海水中比淡水7更不敏感。
从嗅球记录下来的EEG也广泛用于调查鱼类的嗅觉。然而,嗅球是嗅觉感官输入的一阶处理中心8;它高度组织成球状,因此记录的响应在很大程度上取决于记录电极的位置。例如,从 ORN 检测氨基酸的输入由嗅球的侧部区域中的 glomeruli 处理,而来自特异性衍生的化学物质的输入则指向中语言区域 9、10、11、12。9,10,11,12信息素输入可定向到嗅球内高度本地化的球状。也取决于有关物种的解剖结构,给定气味剂的理想记录位置可能不容易到达。
来自嗅觉神经的多单元记录可以规避上述 EOG 和 EEG 的主要问题。因为它记录从上皮到灯泡的 ORN 轴下传递的操作电位,它是一个主要的感官信号。由于它记录在鱼体内,响应的幅度与外部盐度无关。然而,它当然有一些缺点。首先,根据物种的解剖结构,需要更广泛的手术来暴露嗅觉神经比EOG。其次,由于信号比EOG小,它需要稍微复杂一点的设备,因此成本高。约翰·卡普里奥5对其他实验方法进行了一般性描述。本文的目的是概述如何记录从体内海脑嗅神经(Sparus aurata)到氨基酸气味剂的细胞外多单元反应作为该技术的一个例子,以及如何识别和克服在此类实验中遇到的一些更常见的问题。
目前的研究描述了使用多单位(细胞外)记录从嗅觉神经的海布雷姆(S.aurata),在水产养殖中非常重要的海洋痉挛。然而,这种实验方法可以广泛地应用于其他鱼类;电极的手术和精确放置显然取决于嗅觉系统的解剖结构,麻醉剂的选择和浓度可能取决于所研究的物种。例如,金鱼的嗅觉神经(卡拉西乌斯光环) 是短的;在这种情况下,从嗅觉灯泡录制 EEG 会更容易。异味剂的选择也可能在某种程度上取决于该物种。目前的研究使用了氨基酸。据作者所知,迄今为止调查的所有鱼类物种对氨基酸1,18都有嗅觉敏感性。这种敏感性被牵连到不同的过程,如食物位置,化学通信和识别出生水19,20,21,22,23。19,20,21,22,23然而,从广义上讲,不同物种的敏感性相当相似,不依赖于生活方式或栖息地。它们也是定义良好的分子,价格低廉,易于获得。这些原因使得它们成为研究鱼类的奥夫行动的理想测试刺激因素,特别是那些研究人为干扰(如酸化或污染)影响的人为干扰影响,在24个物种中很容易比较结果。
根据有关物种的不同,多单元记录的准备可以保持稳定几个小时;对内部标准(当前研究中为 10-3 M L-serine)的响应幅度在连续测试之间不应超过 10%。任何重大偏离这一经验法则的原因可能是:(一) 鱼的移动,因此电极和/或鼻管的位移;(二) 鱼的运动,因此,电极和/或鼻管的位移;(三) 鱼的移动,因此,鱼的电位。(六) 鱼的移位。(六)鱼的移位。(六) 鱼的移位。(六)鱼的移位。(六)鱼的移位。(六)鱼的移率(二) 水污染,例如接触实验者的手(特别是如果给定气味的浓度较低,反应大于浓度高);或(三) 准备的健康状况恶化)。万一(一)应检查鱼是否移动;如果是这样,重新定位它,并添加更多的麻醉剂到水中和/或给另一剂胆胺三乙酰胺。请用 5 分钟重新测试标准。如果响应仍然较小,则重新定位电极和/或鼻管,直到记录到足够大的响应。万一(ii),只需使用干净的玻璃器皿和水,重拍一系列新的稀释剂。在万一的情况下(iii),检查鱼刺的水流是否充足,水是否流过鱼刺(即通过手术器,而不是嘴流出),水是否良好。不同的鱼种有广泛的温度偏好;确保实验室温度(以及与鱼接触的水的温度)尽可能接近鱼的温度。也确保鱼没有压力,并避免在记录前至少一周(甚至从一个水箱移动到另一个水箱)。当然,电噪声是电生理学家生命的一种小菜;然而,本文不是讨论如何克服/减少这一点的适当媒介。然而,《Axon 指南》(可免费作为 pdf 从制造商网站下载)是有关噪音最小化的实用建议来源。一旦标准刺激引起大而稳定的响应,浓度序列的振幅就具有浓度相关性,对空白的反应最小,就可以开始对测试刺激做出记录反应。一些作者给出相同的刺激三次,并计算算法均值,以便进行后续数据分析。但是,这些是技术复制,此方法将增加录制会话需要三倍的时间。当前作者喜欢测试给定的异味剂一次,但始终是浓度-响应曲线的一部分。这不仅允许计算检测阈值或EC50( 如所述),而且确保接近鱼类在其自然环境中体验的浓度得到测试(这并不总是已知的)。此外,任何异常值响应,例如,由于污染,更容易发现;然后,如有必要,可以使用新鲜制作的样品重复这些样品。
来自嗅觉神经的多单位记录可能是侵入性的,但它比在海水7中记录的EOG更敏感,因为它与外部盐度无关。因此,它可以用来评估嗅觉对气味剂,如钙和钠的敏感性,其浓度的变化也会影响电导率,因此电压记录为15。作为对给定气味反应的 ORN 数量的估计(即,从嗅觉上皮到灯泡沿 ORN 轴线传输的动作电位),它表示一个原始的、未处理的信号(嗅觉输入的初始处理从灯泡开始)。因此,与EOG或EEG24、25,评估污染物(如重金属)和环境变化(如pH值)对嗅觉系统的直接影响,是一个更好的参数。在具有高P CO2(因此低pH)的海水中从嗅球记录可能会受到pH对神经处理的中央效应的影响;海洋酸化的“GABA A受体理论”,即水pH值的降低导致CSF中Cl-和HCO3-–离子的再分配,以及随之而来的GABAergic活化从抑制(超极化)向兴奋性(去极化)的转变。此外,在这类研究中,必须使用与鱼类在其自然环境中可能遇到的类似气味浓度的酸化或污染物来评估其影响。对于氨基酸,这是在纳米到微摩尔范围27,28,29;,2927,接近在鱼1,18中检测这些化合物的阈值。估计给定气味的检测阈值可以给出嗅觉敏感性的重要性和/或生物作用。例如,海灯(Petromyzon Marinus)对幼虫释放的特定胆汁酸具有高嗅觉敏感性,最低阈值为10-13 M30;这种敏感性使成年人能够找到和识别合适的产卵地,因此在远距离上充当迁徙信息素。同样,成熟的雌性海灯对精氨酸(阈值10-14M)有很高的嗅觉敏感性,这是雄性在密耳中释放的多胺,然后吸引它们到精子雄性31的巢。其他鱼类对多胺32、33、34、35,34,35也有嗅觉敏感性,但检测阈值不够低,无法支持类似的信息素作用;32,相反,建议避免腐烂的鱼。然而,在嗅觉敏感度如此之高的情况下,可以设想,敏感度略有下降(即阈值增加),即使响应幅度没有显著降低,也可能给鱼类带来严重问题。
当绘制的半对数时,与气味剂的浓度-响应曲线可以是指数、线性或西莫体 18。就氨基酸而言,这种半对数浓度-响应曲线是线性的(即对数曲线)、西莫体曲线或功率函数7。反应没有饱和(即浓度-反应曲线没有高原,即使在超环境浓度下)可能是由于几个受体与单个氨基酸结合,取决于其浓度,而不是每个氨基酸与特定受体结合;随着给定氨基酸浓度的增加,更多的受体能够结合它,从而作出反应。然而,鱼可以区分氨基酸的混合物36,37,38,39;36,37,38,39这可能是由于在嗅球12,40,中唤起的组合活动模式;所有表示相同受体蛋白的 OR 的轴子在嗅球41、42中终止在同42一球蛋白处,一个氨基酸可以激活多个球状体。
然而,高度特异性的异味剂,如信息素,可能会引起西格莫德或准西格莫德浓度反应曲线43,44。43,推论,虽然没有经验测试,是这些嗅觉反应是由于高度特异性的受体结合信息素分子和很少其他。因此,在给定浓度之上,所有受体被占用,进一步增加将引发其他 ORN 的进一步反应。因此,这些数据可以安装在三参数希尔地块上,最大响应,EC50和希尔共同效率可以计算15,45,46。15,45,46这可以提供有价值的信息,如明显的亲和力和明显的受体数,线性或指数浓度反应曲线不能提供。
The authors have nothing to disclose.
作者实验室的工作由葡萄牙的Ciéncia e a To cicologia基金会(FCT)支持,项目 PTDC/BIA-BMA/30262/2017 和 UID/Multi/04326/2019 和合同计划 DL57/2016/CP1361/CT0041 至 ZV。
AC pre-amplifier | Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) | NL104 | Neurolog pre-amplifier specifically designed for this type of recording. |
Digidata | Molecular Devices, LLC. (San Jose, CA, USA) | 1440A | Analogue-digital converter. |
EMG Integrator | Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) | NL703 | Leaky' electrical integrator to integrate raw activity of the nerve. |
Faraday cage | Made in-house | To reduce electrical noise. | |
Filter | Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) | NL125/6 | Filter module for electrophysiological recording. |
Gallamine triethiodide | Sigma-Aldrich (Portugal) | G8134 | Neuromuscular blocker |
L-glutamine | Sigma-Aldrich (Portugal) | G3126 | Amino acid used as odorant |
L-leucine | Sigma-Aldrich (Portugal) | L80000 | Amino acid used as odorant |
L-serine | Sigma-Aldrich (Portugal) | S4500 | Amino acid used as odorant |
Metalic base-plate | Any | Provides base for micro-manipulators. | |
Micro-hematocrit tubes | Any | To position water supply to the olfactory epithelium | |
Micro-manipulators | Narishige International Ltd (London, UK) | M-152 | Position electrodes |
MS222 (ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma-Aldrich (Portugal) | E10505 | Anesthetic |
pH probe | Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) | HI12302 | Probe to measure pH of water. |
Refractometer | Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) | HI96822 | Refractometer to measure water salinity |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich (Portugal) | 746398 | For saline solution |
Solenoid valves | The Lee Co. (Essex, CT, USA) | LFAA1201618H | For switching between background water and stimuus solutions (no longer available) |
Stereo-microscope | Zeiss, Leica, Olympus | Any suitable model. | For dissection and placement of electrodes. |
Titrator | Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) | HI84531 | Titrator to measure water alkalinity, pH and temperature. |
Tungsten micro-electrodes 0.1 MΩ | World Precision Instruments (Hitchin, UK) | TM31A10 | Extracellular electrodes. |
Valve Driver | Made in-house | 12 V DC source for operating solenoid valves. | |
Water pump (submersible) | Any | To supply anesthetic-containing water to the gills of the fish. |