Ekstracellulær multienhedsregistrering fra olfaktoriske nerve er en følsom, robust og reproducerbar metode til vurdering af olfaktoriske følsomhed i marine fisk. Det registrerer primære sensoriske input og er uafhængig af ekstern saltholdighed.
Nylige undersøgelser har vist, at havet forsuring påvirker olfaktoriske-drevet adfærd hos fisk. Dette kan til dels skyldes en reduktion i olfaktoriske følsomhed i højt PCO2/lavt pH-vand. For at vurdere virkningerne af forsuring af havet eller olfaktoriske følsomhed i havfisk generelt foreslår vi, at ekstracellulær multienhedsregistrering fra olfaktoriske nerve er den foretrukne metode. Selvom den er invasiv, er den følsom, robust, reproducerbar og uafhængig af ekstern saltholdighed (i modsætning til f.eks. elektro-olfactogrammet [EOG]). Desuden registrerer den en primær sensorisk indgang til CNS, før enhver central behandling. Vi viser, at denne metode kan vise en reduktion i olfaktoriske følsomhed, der er både midlertidig og odorant-afhængige, ved hjælp af en række aminosyrer til at konstruere koncentration-respons kurver og beregne tærsklerne for detektion.
Fisk er stærkt afhængige af olfaction for mange aspekter af deres liv, herunder at finde mad, undgå rovdyr, vurdering af potentielle hjælpere og migration, blandt andre1,2,3. Derfor vurdere olfaktoriske følsomhed i fisk (Hvad lugter de? Hvor følsomme er de for disse forbindelser?) er afgørende for fuldt ud at forstå disse processer. Desuden kan menneskeskabte virkninger på miljøet, såsom forsuring af havene og forurening, have dybtgående virkninger på olfaktoriske system, selv på fremlejeniveau, fordi det nødvendigvis er i tæt kontakt med det omgivende vand4. In vivo elektrofysiologi er den eksperimentelle tilgang valg til at vurdere olfaktoriske følsomhed i fisk. Der findes tre hovedteknikker: elektro-olfactogrammet (EOG), elektroencephalogrammet (EEG), der er registreret fra olfaktoriske pære, og optagelse af flere enheder fra olfaktoriske nerve5.
EOG er den mest udbredte af disse tre6. Det er en jævnstrøm (DC) felt potentiale registreres over olfaktoriske epitel og menes at være den opsummerede generator potentialer af disse olfaktoriske receptor neuroner (ORNs) reagerer på en given odorant. Men som det er registreret i vandet, snarere end inde i fisken, amplitude af respons er ikke kun afhængig af signalet genereret af fisken, men også af ledningsevne af det omgivende vand; jo højere ledningsevne (eller jo lavere modstand), jo lavere vil være amplituden. Dette kan betyde , at EOG er en mindre følsom metode i havvand end ferskvand7.
EEG registreret fra olfaktoriske pære er også meget udbredt i undersøgelsen af olfaction i fisk. Olfaktoriske pære er dog den første ordre behandling center for olfaktoriske sensoriske input8; det er meget organiseret i glomeruli, og derfor den registrerede reaktion afhænger i høj grad af placeringen af optagelsen elektroder. For eksempel, input fra ORNs afsløre aminosyrer behandles af glomeruli i den laterale region af olfaktoriske pærer, mens der fra konspecific-afledte kemikalier er rettet til den mediale region9,10,11,12. Feromonnal input kan rettes til stærkt lokaliseret glomeruli inden for olfaktoriske pære. Afhængigt af de pågældende arters anatomi er den ideelle registreringsposition for et givet lugtmiddel muligvis ikke let tilgængelig.
Multi-enhed optagelse fra olfaktoriske nerve omgår de vigtigste problemer med EOG og EEG skitseret ovenfor. Da det registrerer handlinger potentialer passerer ned axoner af ORNs fra epitel til pæren, det er en primær sensorisk signal. Og som det er registreret inde i fisken, amplitude af respons er uafhængig af ydre saltholdighed. Ikke desto mindre har det naturligvis nogle ulemper. For det første, afhængigt af arternes anatomi, er der behov for en mere omfattende operation for at afsløre olfaktoriske nerve end for EOG. For det andet, fordi signalet er mindre end EOG, kræver det lidt mere sofistikeret og derfor dyrt udstyr. En generel beskrivelse af andre eksperimentelle tilgange er givet ved John Caprio5. Formålet med denne artikel er at skitsere, hvordan du registrerer ekstracellulære multi-enhed svar fra olfaktoriske nerve af guldbarre (Sparus aurata) in vivo til aminosyre lugtstoffer som et eksempel på denne teknik, og hvordan man kan identificere, og overvinde, nogle af de mere almindelige problemer i et sådant eksperiment.
Den nuværende undersøgelse beskriver brugen af multi-enhed (ekstracellulær) optagelse fra olfaktoriske nerve af guldbrasen (S. aurata), en marine sparid af stor betydning i akvakultur. Denne eksperimentelle fremgangsmåde kan dog anvendes bredt på andre fisk. kirurgi og nøjagtige placering af elektroder vil klart afhænge af anatomi olfaktoriske system, og valg og koncentration af bedøvelsesmiddel kan afhænge af de arter, der undersøges. For eksempel er guldfiskens olfaktoriske nerve (Carassius auratus) kort; i dette tilfælde ville det være lettere at registrere EEG fra olfaktoriske pære. Valget af lugt kan også til en vis grad afhænge af arten. Den nuværende undersøgelse brugte aminosyrer. Så vidt forfatterne ved, alle fiskearter undersøgt til dato har olfaktoriske følsomhed over for aminosyrer1,18. Denne følsomhed har været impliceret er forskellige processer såsom fødevarer placering, kemisk kommunikation og anerkendelse af natal farvande19,20,21,22,23. De forskellige arters følsomhed er imidlertid stort set ret ens og afhænger ikke af livsstil eller levesteder. De er også veldefinerede molekyler og er billigt og let tilgængelige. Disse årsager gør dem ideelle teststimuli til undersøgelser af olfaction hos fisk, især dem, der undersøger virkningerne af menneskeskabte forstyrrelser (f.eks. forsuring eller forurening), hvor resultaterne let kan sammenlignes på tværs afart 24.
Afhængigt af de pågældende arter kan forberedelserne til optagelse af flere enheder forblive stabile i flere timer. amplituden af respons på den interne standard (10-3 M L-serin i den aktuelle undersøgelse) bør ikke variere med mere end 10% mellem successive test. Enhver væsentlig afvigelse fra denne tommelfingerregel kan skyldes: i) flytning af fisken, og derfor forskydning af elektroder og / eller næse-rør; ii) forurening af vandet, f.eks. eller iii) forringelse af præparatets sundhed). I tilfælde i) skal fisken kontrolleres for at være flyttet. hvis ja, flytte det, og tilsæt mere bedøvelsesmiddel til vandet og / eller give en anden dosis af gallamin triethiodid. Tillad 5 min og test standarden igen. Hvis responsen er endnu mindre, skal elektroderne og/eller næserøret flyttes igen, indtil der registreres en tilstrækkelig stor respons. I tilfælde (ii), blot genindspilning en frisk fortynding serie af odorant, ved hjælp af rent glas og vand. I tilfælde (iii) skal det kontrolleres, at vandstrømmen over fiskens gæller er tilstrækkelig, at vandet strømmer over gællerne (dvs. at komme ud via operculaen i stedet for munden), og at vandet er godt luftet. Forskellige fiskearter har vidt forskellige temperaturpræferencer; sikre, at laboratoriets temperatur (og temperaturen af det vand, der kommer i kontakt med fisken) er så tæt på den temperatur, som fiskene holdes på som muligt. Sørg også for, at fiskene ikke er stressede, og undgå at flytte dem (selv fra en tank til en anden) i mindst en uge før optagelse. Elektrisk støj er naturligvis den bane af en elektrofysiolog liv; Men den nuværende artikel er ikke det rette medie til at diskutere, hvordan man kan overvinde / reducere dette. Ikke desto mindre er ‘The Axon Guide’ (tilgængelig frit som pdf til download fra producentens hjemmeside) en kilde til praktiske råd om støjminimering. Når en stor, stabil respons er fremkaldt af standard stimulus, og en koncentration serie giver en koncentration-afhængig stigning i amplitude, med minimal respons på den tomme, registrering svar på test stimuli kan begynde. Nogle forfattere giver den samme stimulus tre gange, og beregne det aritmetiske middel for efterfølgende dataanalyse. Men disse er tekniske replikater, og denne tilgang vil øge den tid, en optagelse session tager med tre gange. De nuværende forfattere foretrækker at teste en given odorant én gang, men altid en del af en koncentration-respons kurve. Dette gør det ikke kun muligt at beregne påvisningstærsklen ellerEF 50 (som beskrevet), men sikrer også, at koncentrationer tæt på dem, som fiskene ville opleve i det naturlige miljø, testes (dette er ikke altid kendt). Desuden er eventuelle afvigende reaktioner, på grund af forurening for eksempel, lettere at få øje på; disse kan derefter gentages ved hjælp af en frisklavet prøve, hvis det er nødvendigt.
Multi-enhed optagelse fra olfaktoriske nerve kan være invasive, men det er mere følsom end EOG, når de registreres i havvand7, da det er uafhængigt af ydre saltholdighed. Det kan derfor anvendes til at vurdere olfaktoriske følsomhed over for lugtstoffer, såsom calcium og natrium, ændringer i koncentrationerne, som også ville påvirke ledningsevne og dermed spændingerregistreret 15. Som et skøn over antallet af ORN’er reagerer på en given lugt (dvs. handling potentialer rejser langs ORN axoner fra olfaktoriske epitel til pæren), det repræsenterer en rå, uforarbejdet signal (indledende behandling af olfaktoriske input begynder i pærer). Det er derfor en bedre parameter at vurdere de direkte virkninger af forurenende stoffer, såsom tungmetaller, og miljøændringer, såsom pH, på olfaktoriske system end EOG eller EEG24,25. Optagelse fra olfaktoriske pære i havvand med høj PCO2 (og derfor lav pH) kan blive påvirket af centrale virkninger af pH på neural behandling; den ‘GABAEn receptor teori’ af havet forsuring26, hvorved reduktion i vand pH forårsager en omfordeling af Cl– og HCO3– ion i CSF og en deraf følgende skift af GABAergic aktivering fra hæmmende (hyperpolarisering) til excitatoriske (depolarisering). I sådanne undersøgelser er det desuden vigtigt at vurdere virkningerne af forsuring eller forurenende stoffer ved hjælp af koncentrationer af lugtende stoffer svarende til dem, fiskene sandsynligvis vil støde på i dets naturlige miljø. For aminosyrer, dette er i nano til mikromolar rækkevidde27,28,29; tæt på tærsklen for påvisning af disse forbindelser i fisk1,18. Vurdering af tærsklen for påvisning for en given odorant kan give en idé om betydningen og / eller biologiske rolle olfaktoriske følsomhed. F.eks. har havlygte (Petromyzon marinus) høj olfaktorisk følsomhed over for specifikke galdesyrer, der frigives af larver ned til en tærskel på 10-13 M30; denne følsomhed gør det muligt for voksne at lokalisere og identificere egnede gydepladser og fungerer derfor som en vandrende feromon over lange afstande. Tilsvarende moden kvindelig hav lamprey har høj olfaktoriske følsomhed over for sæd (tærskel 10-14 M), en polyamin frigivet i milten af hanner, som derefter tiltrækker dem til reder af spermiating hanner31. Andre fisk har også olfaktorisk følsomhed over for polyamin32,33,34,35, men ikke med tilstrækkeligt lave påvisningstærskler til at understøtte en lignende feromonal rolle; i stedet foreslås undgåelse af rådnende fisk. Ikke desto mindre er det med så høje olfaktoriske følsomheder muligt at forestille sig, at en mindre reduktion i følsomheden (dvs. en forhøjelse af tærsklen), selv når responsjolilituden ikke reduceres drastisk, kan forårsage alvorlige problemer for fisk24.
Når afbildet semi-logaritmisk, koncentration-respons kurver til lugtstoffer kan være eksponentiel, lineær eller sigmoidal18. For aminosyrer er sådanne semilogaritmiske koncentrationsresponskurver enten lineære (dvs. logaritmiske), sigmoidale eller effektfunktioner7. At der ikke ses nogen mætning af responsen (dvs. ingen plateau i koncentrations-respons kurven, selv ved supra-miljømæssige koncentrationer) skyldes sandsynligvis flere receptorer, der binder til individuelle aminosyrer, afhængigt af deres koncentration, snarere end hver aminosyre, der binder sig til en bestemt receptor; som koncentrationen af en given aminosyre stiger, flere receptorer er i stand til at binde det og derfor reagere. Ikke desto mindre kan fisk skelne mellem blandinger afaminosyrer 36,37,38,39; dette skyldes sandsynligvis kombinatoriske aktivitetsmønstre i olfaktoriske pærer12,40 axonerne af alle ORNs udtrykke samme receptor protein ender på samme glomeruli i olfaktoriskepærer 41,42, og en aminosyre kan aktivere mere end én glomerulus.
Men, meget specifikke lugtstoffer, såsom feromoner, kan fremkalde sigmoidal eller kvasi-sigmoidal koncentration-respons kurver43,44. Konklusionen, selv om det ikke empirisk testet, er, at disse olfaktoriske reaktioner skyldes meget specifikke receptorer, der binder feromon molekyle og lidt andet. Derfor, over en given koncentration, alle receptorer er besat, og yderligere stigninger vil fremkalde yderligere reaktioner i andre ORNs. Derfor kan disse data monteres på en tre-parameter Hill plot, og den maksimale respons, EC50 og Hill co-effektiv kan beregnes15,,45,46. Dette kan give værdifulde oplysninger, såsom tilsyneladende affinitet og tilsyneladende receptornummer, som lineære eller eksponentielle koncentrationsresponskurver ikke kan give.
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet i forfatternes laboratorium støttes af Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal, projekter PTDC/BIA-BMA/30262/2017 og UID/Multi/04326/2019 og kontraktprogram DL57/2016/CP1361/CT0041 til ZV.
AC pre-amplifier | Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) | NL104 | Neurolog pre-amplifier specifically designed for this type of recording. |
Digidata | Molecular Devices, LLC. (San Jose, CA, USA) | 1440A | Analogue-digital converter. |
EMG Integrator | Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) | NL703 | Leaky' electrical integrator to integrate raw activity of the nerve. |
Faraday cage | Made in-house | To reduce electrical noise. | |
Filter | Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) | NL125/6 | Filter module for electrophysiological recording. |
Gallamine triethiodide | Sigma-Aldrich (Portugal) | G8134 | Neuromuscular blocker |
L-glutamine | Sigma-Aldrich (Portugal) | G3126 | Amino acid used as odorant |
L-leucine | Sigma-Aldrich (Portugal) | L80000 | Amino acid used as odorant |
L-serine | Sigma-Aldrich (Portugal) | S4500 | Amino acid used as odorant |
Metalic base-plate | Any | Provides base for micro-manipulators. | |
Micro-hematocrit tubes | Any | To position water supply to the olfactory epithelium | |
Micro-manipulators | Narishige International Ltd (London, UK) | M-152 | Position electrodes |
MS222 (ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma-Aldrich (Portugal) | E10505 | Anesthetic |
pH probe | Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) | HI12302 | Probe to measure pH of water. |
Refractometer | Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) | HI96822 | Refractometer to measure water salinity |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich (Portugal) | 746398 | For saline solution |
Solenoid valves | The Lee Co. (Essex, CT, USA) | LFAA1201618H | For switching between background water and stimuus solutions (no longer available) |
Stereo-microscope | Zeiss, Leica, Olympus | Any suitable model. | For dissection and placement of electrodes. |
Titrator | Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) | HI84531 | Titrator to measure water alkalinity, pH and temperature. |
Tungsten micro-electrodes 0.1 MΩ | World Precision Instruments (Hitchin, UK) | TM31A10 | Extracellular electrodes. |
Valve Driver | Made in-house | 12 V DC source for operating solenoid valves. | |
Water pump (submersible) | Any | To supply anesthetic-containing water to the gills of the fish. |