후각 신경에서 세포 외 다단위 기록은 해양 물고기의 후각 감도를 평가하기위한 민감하고 견고하며 재현 가능한 방법입니다. 그것은 기본 감각 입력을 기록하고 외부 염도의 독립적이다.
최근 연구에 따르면 해양 산성화는 물고기의 후각 중심 행동에 영향을 미칩니다. 이는 부분적으로 높은 PCO2/낮은pH 물에서 후각 감도의 감소때문일 수 있다. 해양 산성화또는 해양어류의 후각 민감도의 효과를 평가하기 위해 후각 신경으로부터 세포외 다단위 기록이 선택방법임을 제안합니다. 침습적이지만 민감하고 견고하며 재현 가능하며 외부 염도와 무관합니다(예를 들어 전기 올리티그램[EOG]과는 달리). 또한 중앙 처리 전에 CNS에 대한 1차 감각 입력을 기록합니다. 우리는 이 방법이 농도 반응 곡선을 구성하고 검출의 임계값을 계산하기 위하여 아미노산의 범위를 사용하여, 임시 및 냄새에 의존하는 후각 감도의 감소를 보여줄 수 있다는 것을 보여줍니다.
물고기는 음식을 찾고, 육식 동물을 피하고, 잠재적 인 동료와 이주를 평가하고, 다른 사람의 사이에서1,,2,,3을포함하여 삶의 많은 측면에 대한 olfaction에 크게 의존합니다. 따라서, 물고기의 후각 감도 평가 (그들은 어떤 냄새가 나는가? 그들은 이 화합물에 얼마나 민감합니까?) 이러한 프로세스를 완전히 이해하는 데 필수적입니다. 더욱이, 해양 산성화 및 오염과 같은 환경에 대한 인위적영향은 주변물과 반드시 밀접한 접촉이기 때문에, 심지어 아묘한 수준에서도 후각 시스템에 지대한 영향을 미칠 수 있다4. 생체 내 전기 생리학은 물고기의 후각 민감성을 평가하기 위한 실험적인 접근법입니다. 세 가지 주요 기술을 사용할 수 있습니다: 전기-olfactogram (EOG), 후각 전구에서 기록 된 전기 뇌전 (EEG), 후각 신경에서 다중 단위 기록5.
EOG는 이 세 가지 6 중 가장 널리 사용되는것입니다. 그것은 직접 전류 (DC) 후각 상피 위에 기록 된 필드 잠재력 및 주어진 된 냄새에 응답 하는 그 후각 수용 체 뉴런의 합계 된 발생 기 잠재력 것으로 추정 된다. 그러나, 물고기 내부가 아닌 물에 기록되기 때문에, 반응의 진폭은 물고기에 의해 생성된 신호뿐만 아니라 주변 물의 전도도에 의존한다. 전도도가 높을수록(또는 저항이 낮음), 하부진이 된다. 이는 EOG가 담수7보다바닷물에서 덜 민감한 방법임을 의미할 수 있다.
후각 전구에서 기록된 EEG는 또한 물고기의 olfaction를 조사하는 데 널리 사용됩니다. 그러나 후각 전구는 후각 감각 입력8을위한 1차 처리 센터입니다. 그것은 매우 구체로 조직되고, 결과적으로 기록 된 응답은 기록 전극의 위치에 크게 의존한다. 예를 들어, 아미노산을 검출하는 ORNs로부터의 입력은 후각 전구의 측면 영역에서 사구에 의해 처리되는 반면, 콘특이성 유래 화학물질로부터 내측 영역99,10,,11,,12로향한다. 페로몬 입력은 후각 전구 내에서 고도로 국소화된 구체로 향할 수 있다. 또한 문제의 종의 해부학에 따라, 주어진 냄새에 대한 이상적인 기록 위치는 쉽게 접근 할 수 없습니다.
후각 신경에서 다중 단위 기록은 위에서 설명한 EOG 및 EEG의 주요 문제를 우회합니다. 그것은 전구에 상피에서 ORN의 축삭을 전달하는 작업 잠재력을 기록으로, 그것은 기본 감각 신호입니다. 그리고 물고기 내부에 기록되기 때문에 반응의 진폭은 외부 염도와 독립적입니다. 그럼에도 불구하고, 물론 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, 종의 해부학에 따라, 더 광범위한 수술은 EOG에 대한 것보다 후각 신경을 노출하는 데 필요합니다. 둘째, 신호가 EOG보다 작기 때문에 약간 더 정교하고 비용이 많이 드는 장비가 필요합니다. 다른 실험적 접근법에 대한 일반적인 설명은 존 카프리오5에의해 제공됩니다. 이 문서의 목적은 이 기술의 예로 아미노산 냄새물질을 생체내에서선천적(Sparus aurata)의후각 신경으로부터 세포외 다단위 반응을 기록하는 방법과 이러한 실험에서 발생하는 일반적인 문제 중 일부를 식별하고 극복하는 방법을 설명하는 것이다.
현재 연구는 해양에서 매우 중요한 해양 스페이드 인 seabream(S. aurata)의후각 신경에서 다중 단위 (세포 외) 기록의 사용을 설명합니다. 그러나, 이 실험적인 접근은 광범위하게 그밖 물고기에 적용될 수 있습니다; 전극의 수술 및 정확한 배치는 명확하게 후각 시스템의 해부학에 따라 달라집니다, 마취의 선택과 농도는 연구 하에 종에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어,금붕어(카라시우스 오라투스)의후각 신경은 짧다. 이 경우 후각 전구에서 EEG를 기록하는 것이 더 쉬울 것입니다. 냄새의 선택은 또한 어느 정도, 종에 따라 달라질 수 있습니다. 현재 연구는 아미노산을 사용. 저자가 알고있는 한, 현재까지 조사 된 모든 물고기 종은 아미노산1,18에후각 감도가 있습니다.1 이러한 민감도는 식품 위치, 화학통신,,산하19,20,,19,21,22,23등의 다양한 공정을 내포하고있다. 그러나, 다른 종의 감도는, 광범위하게 말하기, 오히려 유사하고 라이프 스타일이나 서식지에 의존하지 않습니다. 그들은 또한 잘 정의 된 분자이며 저렴하고 쉽게 사용할 수 있습니다. 이러한 이유로 물고기의 olfaction에 대 한 연구에 대 한 이상적인 테스트 자극, 특히 그 인위적 장애의 효과 조사 (예를 들어, 산성 화 또는 오염), 어디 결과 종에 걸쳐 쉽게 비교할 수 있습니다24.
문제의 종에 따라 다중 단위 기록 에 대한 준비는 몇 시간 동안 안정적으로 유지 될 수 있습니다. 내부 표준(현재 연구에서10-3 M L-세린)에 대한 응답진폭은 연속적인 시험 간에 10% 이상 차이가 없어야 합니다. 엄지 손가락의이 규칙에서 어떤 중요한 편차는 때문일 수 있습니다: (i) 물고기의 움직임, 따라서 전극 및 /또는 코 튜브의 변위; (ii) 물의 오염, 예를 들어, 실험자의 손과 접촉하여 (특히 주어진 악취의 낮은 농도가 더 높은 농도보다 더 큰 반응을 주는 경우); 또는 (iii) 준비의 건강의 악화). 경우에 (i), 물고기는 이동 한 경우 확인되어야한다; 그렇다면, 그것을 재배치하고, 물에 더 많은 마취제를 추가하고 / 또는 갈라민 트리에티오디드의 또 다른 복용량을 제공합니다. 5분 동안 허용하고 표준을 다시 테스트합니다. 응답이 여전히 작으면 충분히 큰 응답이 기록될 때까지 전극 및/또는 코 튜브를 재배치합니다. 경우에 (ii), 단순히 깨끗한 유리 제품과 물을 사용하여, 냄새의 신선한 희석 시리즈를 리메이크합니다. 경우에 (iii), 물고기의 아가미 를 통해 물의 흐름이 적절한 지 확인, 물이 아가미 (즉, 입보다는 오퍼큘라를 통해 종료) 통해 흐르는 것을 확인하고, 물은 잘 방출된다. 다른 어종은 온도 선호도가 크게 다르다. 실험실) 온도 (그리고 물고기와 접촉하는 물의)가 물고기가 가능한 한 유지되는 온도에 가깝습니다. 물고기가 스트레스를 받지 않도록 하고 녹음하기 최소 1주일 전에 (한 탱크에서 다른 탱크로도) 움직이지 않도록 하십시오. 전기 소음은 물론 전기 생리학자의 삶의 베인입니다. 그러나 현재 문서는 이를 극복/줄이는 방법을 논의하기에 적합한 매체가 아닙니다. 그럼에도 불구하고 , ‘축슨 가이드'(제조업체의 웹 사이트에서 다운로드할 수 있는 PDF로 자유롭게 사용할 수 있음)는 소음 최소화에 대한 실용적인 조언의 원천입니다. 일단 크고 안정적인 반응이 표준 자극에 의해 발생되고, 농도 계열은 빈에 대한 최소한의 반응으로 진폭의 농도 의존적 증가를 제공하며, 시험 자극에 대한 응답을 기록할 수 있다. 일부 저자는 동일한 자극을 세 번 주고 후속 데이터 분석을 위한 산술 평균을 계산합니다. 그러나 이러한 복제는 기술 복제이며 이 방법은 레코딩 세션이 세 배씩 걸리는 시간을 증가시게 됩니다. 현재 저자는 주어진 냄새를 한 번 테스트하는 것을 선호하지만 항상 농도 반응 곡선의 일부입니다. 이것은 검출 임계값 또는 EC50(설명된 대로)의 계산을 허용할 뿐만 아니라 물고기가 자연 환경에서 경험할 농도가 테스트되도록 합니다(항상 알려진 것은 아닙니다). 또한, 예를 들어 오염으로 인한 이상치 응답은 쉽게 발견할 수 있습니다. 이러한 샘플은 필요한 경우 갓 만든 샘플을 사용하여 반복할 수 있습니다.
후각 신경으로부터의 다중 단위 기록은 침습적일 수 있지만, 외부 염도와 무관하기 때문에 해수7에기록될 때 EOG보다 더 민감하다. 따라서 칼슘과 나트륨과 같은 악취에 대한 후각 민감도를 평가하는 데 사용할 수 있으며, 농도의 변화는 전도도에 영향을 미치고 결과적으로15도기록된 전압을 기록하였다. 주어진 냄새에 반응하는 ORN의 수(즉, 후각 상피에서 전구로 ORN 축축을 따라 이동하는 작업 잠재력)의 추정치로서, 그것은 원시, 처리되지 않은 신호(후각 입력의 초기 처리가 전구에서 시작됨)를 나타낸다. 따라서, EOG 또는EEG(24)및25보다후각 시스템에 중금속, pH 와 같은 오염물질의 직접적인 영향 및 pH와 같은 환경적 변화를 평가하는 것이 더 나은 파라미터이다. 높은 PCO2 (따라서 낮은 pH)와 바닷물에서 후각 전구에서 기록 신경 처리에 pH의 중앙 효과에 의해 영향을 받을 수 있습니다; 해양산성화의 ‘GABAA 수용체이론'(26)은수분 pH의 감소로 인해Cl-및 HCO3-이온의 재분배를 유발하고, CSF에서 이온과 억제(hyperpolarizing)에서 흥분(탈극화)으로 GABAergic 활성화의 결과적 변화.3 더욱이, 이러한 연구에서는, 물고기가 자연 환경에서 발생할 가능성이 있는 것과 유사한 냄새 농도를 사용하여 산성화 또는 오염물질의 효과를 평가하는 것이 중요하다. 아미노산의 경우, 이것은 나노에서 마이크로몰라 범위27,,28,,29; 물고기1,18에서이러한 화합물의 검출 임계값에가깝습니다. 주어진 냄새에 대한 검출 임계값의 추정은 후각 감도의 중요성 및 / 또는 생물학적 역할에 대한 몇 가지 아이디어를 줄 수 있습니다. 예를 들어, 바다램프레이(Petromyzon marinus)는애벌레에 의해 방출된 특정 담즙산에 대해10-13 M30의임계값까지 높은 후각 민감성을 갖는다. 이 감도는 성인이 적절한 산란 장을 찾고 식별 할 수 있으므로 장거리에서 철새 페로몬 역할을합니다. 유사하게, 잘 익은 암컷 바다 램프레이는 스퍼민 (임계값 10-14 M)에 높은 후각 감도를 가지고, 다음 정자 남성의 둥지에 그들을 유치 남성에 의해 milt에서 방출 폴리 아민(31). 다른 물고기는 또한 폴리 아민32,33,,,34,,35에후각 감도가 있지만, 유사한 페로몬 역할을 지원하기에 검출의 충분히 낮은 임계 값을 가지고; 대신, 부패 물고기의 회피를 제안한다. 그럼에도 불구하고, 이러한 높은 후각 민감성으로, 반응 진폭이 극적으로 감소되지 않더라도 감도의 약간의 감소(즉, 임계값 증가)가 물고기24에심각한 문제를 일으킬 수 있다고 상상할 수 있다.
반로가리타로 플롯될 때, 악취에 대한 농도 반응 곡선은 지수, 선형 또는시그모이드(18)일수 있다. 아미노산의 경우, 이러한 반로개심 농도 반응 곡선은 선형(즉, 로개반스믹), 시그모이드 또는 전력 기능7이다. 응답의 포화도가 보이지 않는다는 것은 (즉, 농도 반응 곡선의 고원이 없고, 심지어 수프라-환경 농도에서도) 아마도 특정 수용체에 결합되는 각 아미노산이 아닌 개별 아미노산에 결합하는 여러 수용체 때문일 수 있습니다. 주어진 아미노산의 농도 증가, 더 많은 수용 체 그것을 바인딩 하 고 따라서 응답할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 물고기는 아미노산의 혼합물을 구별할 수 있습니다36,,37,,38,,39; 이는 후각전구(12,,40)에서발생하는 조합적 활동 패턴 때문일 가능성이 있다. 동일한 수용체 단백질을 발현하는 모든 ORN의 축축은 후각전구(41,,42)에서동일한 구체로 메몰리로 종료되며, 하나의 아미노산은 하나 이상의 글로메룰러스를 활성화할 수 있다.
그러나 페로몬과 같은 매우 특이적인 악취는 시그모이드 또는 준시-시그모이드 농도 응답곡선(43,,44)을불러일으킬 수 있다. 추론, 비록 경험적으로 테스트, 이러한 후각 응답페로몬 분자와 거의 다른 바인딩 하는 매우 구체적인 수용 체 때문. 따라서, 주어진 농도 위의, 모든 수용체가 점유되고, 추가 증가는 다른 ORN에 있는 더 이상 반응을 불러 일으키지 않을 것입니다. 따라서 이러한 데이터는 3파라미터 힐 플롯에 장착할 수 있으며 최대 응답, EC50 및 Hill 의 공동 효율은15,,45,,46을계산할 수 있다. 이것은 명백한 친화성 및 명백한 수용체 수와 같은 귀중한 정보를 줄 수 있습니다, 그 선형 또는 기하급수체 농도 반응 곡선은 줄 수 없습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자의 실험실에서 작업은 Fundação 파라 Ciência e 테크놀로지아 (FCT), 포르투갈, 프로젝트 PTDC / BIA-BMA / 30262/2017 및 UID / Multi/04326/2019 및 계약 프로그램 DL57/2016/CP1361/CT004V에 의해 지원됩니다.
AC pre-amplifier | Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) | NL104 | Neurolog pre-amplifier specifically designed for this type of recording. |
Digidata | Molecular Devices, LLC. (San Jose, CA, USA) | 1440A | Analogue-digital converter. |
EMG Integrator | Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) | NL703 | Leaky' electrical integrator to integrate raw activity of the nerve. |
Faraday cage | Made in-house | To reduce electrical noise. | |
Filter | Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) | NL125/6 | Filter module for electrophysiological recording. |
Gallamine triethiodide | Sigma-Aldrich (Portugal) | G8134 | Neuromuscular blocker |
L-glutamine | Sigma-Aldrich (Portugal) | G3126 | Amino acid used as odorant |
L-leucine | Sigma-Aldrich (Portugal) | L80000 | Amino acid used as odorant |
L-serine | Sigma-Aldrich (Portugal) | S4500 | Amino acid used as odorant |
Metalic base-plate | Any | Provides base for micro-manipulators. | |
Micro-hematocrit tubes | Any | To position water supply to the olfactory epithelium | |
Micro-manipulators | Narishige International Ltd (London, UK) | M-152 | Position electrodes |
MS222 (ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma-Aldrich (Portugal) | E10505 | Anesthetic |
pH probe | Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) | HI12302 | Probe to measure pH of water. |
Refractometer | Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) | HI96822 | Refractometer to measure water salinity |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich (Portugal) | 746398 | For saline solution |
Solenoid valves | The Lee Co. (Essex, CT, USA) | LFAA1201618H | For switching between background water and stimuus solutions (no longer available) |
Stereo-microscope | Zeiss, Leica, Olympus | Any suitable model. | For dissection and placement of electrodes. |
Titrator | Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) | HI84531 | Titrator to measure water alkalinity, pH and temperature. |
Tungsten micro-electrodes 0.1 MΩ | World Precision Instruments (Hitchin, UK) | TM31A10 | Extracellular electrodes. |
Valve Driver | Made in-house | 12 V DC source for operating solenoid valves. | |
Water pump (submersible) | Any | To supply anesthetic-containing water to the gills of the fish. |