Ekstracellulær multi-enhet opptak fra olfactory nerve er en følsom, robust og reproduserbar metode for å vurdere olfaktorisk følsomhet i marine fisk. Den registrerer primære sensoriske innganger og er uavhengig av ekstern saltholdighet.
Nyere studier har vist at havforsuring påvirker olfaktorisk drevet atferd hos fisk. Dette kan delvis skyldes en reduksjon i olfaktorisk følsomhet i høyt PCO2/lavt pH-vann. For å vurdere effekten av havforsuring, eller olfaktorisk følsomhet i marin fisk generelt, foreslår vi at ekstracellulær multi-enhet opptak fra olfaktornerven er den metoden for valg. Selv om den er invasiv, er den følsom, robust, reproduserbar og uavhengig av ekstern saltholdighet (i motsetning til elektro-olfactogram [EOG], for eksempel). Videre registrerer den en primær sensorisk inngang i CNS, før sentral behandling. Vi viser at denne metoden kan vise en reduksjon i olfaktorisk følsomhet som er både midlertidig og luktavhengig, ved hjelp av en rekke aminosyrer for å konstruere konsentrasjonsresponskurver og beregne terskler for deteksjon.
Fisk er avhengige av olfaction for mange aspekter av deres liv, inkludert å finne mat, unngå rovdyr, vurdere potensielle kamerater og migrasjon, blantannet 1,2,3. Derfor vurderer olfaktorisk følsomhet i fisk (Hva lukter de? Hvor følsomme er de for disse forbindelsene?) er avgjørende for å forstå disse prosessene fullt ut. Videre kan antropogene effekter på miljøet, som havforsuring og forurensning, ha dype effekter på olfaktorisk system, selv på sublethal nivåer, fordi det nødvendigvis er i intim kontakt med det omkringliggende vannet4. In vivo elektrofysiologi er den eksperimentelle tilnærmingen til valg for å vurdere olfaktorisk følsomhet hos fisk. Tre hovedteknikker er tilgjengelige: elektro-olfactogram (EOG), elektro-encefalogram (EEG) registrert fra olfactory pære, og multi-enhet opptak fra olfactory nerve5.
EOG er den mest brukte av disse tre6. Det er en direkte strøm (DC) felt potensial registrert over olfactory epitel og antas å være den oppsummerte generator potensialer av de olfactory reseptor nevroner (ORNer) reagerer på en gitt lukt. Men som det er registrert i vannet, i stedet for inne i fisken, er amplituden av respons ikke bare avhengig av signalet som genereres av fisken, men også på ledningsevnen til det omkringliggende vannet; jo høyere ledningsevne (eller jo lavere motstand), jo lavere vil være amplituden. Dette kan bety at EOG er en mindre følsom metode i sjøvann enn ferskvann7.
EEG registrert fra olfaktorisk pære er også mye brukt i undersøkelse av olfaction i fisk. Olfaktorisk pære er imidlertid første-ordre behandlingssenter for olfaktorisk sensorisk inngang8; Det er svært organisert i glomeruli, og dermed avhenger responsen som er registrert sterkt av plasseringen av opptakselektrodene. For eksempel behandles inngangen fra ORNer som oppdager aminosyrer av glomeruli i det laterale området av olfaktoriske pærer, mens det fra konspesifikke avledede kjemikalier er rettet mot medialregionen9,10,11,12. Feromonal input kan rettes til svært lokaliserte glomeruli i olfaktorisk pære. Avhengig av også anatomien til den aktuelle arten, kan den ideelle opptaksposisjonen for en gitt lukt ikke være lett tilgjengelig.
Multi-enhet opptak fra olfactory nerve omgår de viktigste problemene med EOG og EEG skissert ovenfor. Når den registrerer handlinger potensialer passerer ned aksonene til ORNene fra epitelet til pæren, er det et primært sensorisk signal. Og som det er registrert inne i fisken, amplituden av respons er uavhengig av ekstern saltholdighet. Likevel, selvfølgelig har det noen ulemper. For det første, avhengig av artens anatomi, er det nødvendig med mer omfattende kirurgi for å avsløre olfaktornerven enn for EOG. For det andre, fordi signalet er mindre enn EOG, krever det litt mer sofistikert, og derfor dyrt, utstyr. En generell beskrivelse av andre eksperimentelle tilnærminger er gitt av John Caprio5. Målet med denne artikkelen er å skissere hvordan man registrerer ekstracellulære multi-unit svar fra olfaktorisk nerve av seabream (Sparus aurata) in vivo til aminosyre luktstoffer som et eksempel på denne teknikken, og hvordan å identifisere, og overvinne, noen av de vanligste problemene som oppstår i et slikt eksperiment.
Den nåværende studien beskriver bruken av multi-unit (ekstracellulær) opptak fra olfaktorisk nerve av seabream (S. aurata), en marine sparid av stor betydning i akvakultur. Denne eksperimentelle tilnærmingen kan imidlertid brukes bredt på annen fisk; kirurgi og nøyaktig plassering av elektroder vil helt klart avhenge av anatomien til olfaktorisk system, og valg og konsentrasjon av bedøvelse kan avhenge av arten som studeres. For eksempel er olfaktorisk nerve av gullfisken (Carassius auratus) kort; i dette tilfellet ville det være enklere å registrere EEG fra olfaktorisk pære. Valget av lukt kan også avhenge av arten til en viss grad. Den nåværende studien brukte aminosyrer. Så vidt forfatterne er klar over, alle fiskearter undersøkt til dags dato har olfaktorisk følsomhet for aminosyrer1,18. Denne følsomheten har vært innblandet er ulike prosesser som mat plassering, kjemisk kommunikasjon og anerkjennelse av natal farvann19,,20,,21,,22,,23. Imidlertid er følsomheten til forskjellige arter, generelt sett, ganske like og er ikke avhengig av livsstil eller habitat. De er også veldefinerte molekyler og er billig og lett tilgjengelig. Disse grunnene gjør dem ideelle test stimuli for studier på olfaction i fisk, spesielt de som undersøker effekten av antropogene forstyrrelser (f.eks forsuring eller forurensning), hvor resultatene lett kan sammenlignes på tvers av arter24.
Avhengig av den aktuelle arten kan forberedelsene til multi-unit opptak forbli stabile i flere timer; amplituden av respons på den interne standarden (10-3 M L-serin i den nåværende studien) bør ikke variere med mer enn 10% mellom påfølgende tester. Eventuelle vesentlige avvik fra denne tommelfingerregelen kan skyldes: (i) bevegelse av fisken, og derfor forskyvning av elektrodene og / eller nese-rør; (ii) forurensning av vannet, for eksempel ved å komme i kontakt med eksperimentererens hender (spesielt hvis lavere konsentrasjoner av en gitt luktmiddel gir større respons enn høyere konsentrasjoner); eller (iii) forverring av preparatets helse). I tilfelle (i), bør fisken kontrolleres for å ha flyttet; I så fall, omplassere det, og tilsett mer bedøvelse til vannet og / eller gi en ny dose gallamin triethiodide. Tillat 5 min og test standarden på nytt. Hvis responsen fortsatt er mindre, kan elektrodene og/eller neserøret flyttes til det registreres tilstrekkelig stor respons. I tilfelle (ii), bare remake en frisk fortynning serie av luktstoff, ved hjelp av rent glass og vann. I tilfelle (iii), kontroller at strømmen av vann over fiskens gjeller er tilstrekkelig, at vannet strømmer over gjellene (det vil si spennende via opercula, i stedet for munnen), og vannet er godt luftet. Ulike fiskearter har vidt forskjellige temperaturpreferanser; sikre at laboratoriet) temperaturen (og at vannet i kontakt med fisken) er så nær temperaturen som fisken holdes på som mulig. Sørg også for at fisken ikke er stresset, og unngå å flytte dem (selv fra en tank til en annen) i minst en uke før opptak. Elektrisk støy er selvfølgelig banen til en elektrofysiologs liv; Den nåværende artikkelen er imidlertid ikke riktig medium for å diskutere hvordan man kan overvinne / redusere dette. Likevel er ‘The Axon Guide’ (tilgjengelig fritt som pdf for nedlasting fra produsentens hjemmeside) en kilde til praktiske råd om støyminimering. Når en stor, stabil respons fremkales av standard stimulans, og en konsentrasjonsserie gir en konsentrasjonsavhengig økning i amplitud, med minimal respons på det tomme, kan opptaksresponser på teststimuli begynne. Noen forfattere gir samme stimulans tre ganger, og beregner det aritmetiske gjennomsnittet for etterfølgende dataanalyse. Dette er imidlertid tekniske repliker, og denne tilnærmingen vil øke tiden en opptaksøkt tar med tre ganger. De nåværende forfatterne foretrekker å teste en gitt lukt en gang, men alltid en del av en konsentrasjonsresponskurve. Dette tillater ikke bare beregning av terskelen for deteksjon eller EC50 (som beskrevet), men sikrer også at konsentrasjoner nær de som fisken vil oppleve i sitt naturlige miljø testes (dette er ikke alltid kjent). Videre er eventuelle ytre responser, på grunn av forurensning for eksempel, lettere å oppdage; disse kan deretter gjentas ved hjelp av en nylaget prøve om nødvendig.
Multi-enhet opptak fra olfactory nerve kan være invasiv, men det er mer følsomt enn EOG når registrert i sjøvann7, som det er uavhengig av ekstern saltholdighet. Det kan derfor brukes til å vurdere olfaktorisk følsomhet for luktstoffer, som kalsium og natrium, endringer i konsentrasjonene som også vil påvirke konduktiviteten og dermed spenninger registrert15. Som et estimat av antall ORN-er som reagerer på en gitt lukt (det vil si handlingspotensialer som reiser langs ORN-aksoner fra olfaktoriske epitel til pæren), representerer det et rått, ubehandlet signal (innledende behandling av olfaktorisk inngang begynner i pærene). Derfor er det en bedre parameter for å vurdere de direkte effektene av forurensende stoffer, som tungmetaller og miljøendringer, for eksempel pH, på olfaktorisk system enn EOG eller EEG24,25. Opptak fra olfaktorisk pære i sjøvann med høy PCO2 (og derfor lav pH) kan påvirkes av sentrale effekter av pH på neural behandling; ‘GABAEn reseptorteori’ av havforsuring26, hvorved reduksjon i vann pH forårsaker en omfordeling av Cl– og HCO3– ion i CSF og et påfølgende skifte av GABAergic aktivering fra hemmende (hyperpolarizing) til excitatory (depolariserende). Videre, i slike studier, er det viktig å vurdere effekten av forsuring eller forurensende stoffer ved hjelp av luktkonsentrasjoner som ligner på de fisken sannsynligvis vil møte i sitt naturlige miljø. For aminosyrer er dette i nano til mikromosområde27,28,29; nær terskelen for påvisning av disse forbindelsene i fisk1,18. Estimering av terskelen for deteksjon for en gitt lukt kan gi noen ide om viktigheten og / eller biologisk rolle olfaktorisk følsomhet. For eksempel har sjøsøye (Petromyzon marinus) høy olfaktorisk følsomhet for spesifikke gallesyrer utgitt av larver ned til en terskel på 10-13 M30; Denne følsomheten gjør det mulig for voksne å lokalisere og identifisere egnede gyteområder, og fungerer derfor som en migrerende feromon over lang avstand. Tilsvarende har moden kvinnelig sjøøye høy olfaktorisk følsomhet for sædceller (terskel 10-14 M), et polyamin utgitt i milten av menn, som deretter tiltrekker dem til reiret av spermierende menn31. Andre fisk har også olfaktorisk følsomhet for polyamin32,,33,,34,,35, men ikke med tilstrekkelig lave terskler for deteksjon for å støtte en lignende feromonal rolle; I stedet foreslås unngåelse av råtnende fisk. Likevel, med så høye olfaktoriske følsomheter, er det mulig å forestille seg at en liten reduksjon i følsomhet (det vil si økning i terskel), selv når responsalituden ikke reduseres dramatisk, kan forårsake alvorlige problemer for fisk24.
Når plottet semi-logaritmisk, konsentrasjon-respons kurver til luktstoffer kan være eksponentiell, lineær eller sigmoidal18. Når det gjelder aminosyrer, er slike halvloggaritmiske konsentrasjonsresponskurver enten lineære (det vil vil vil ha logaritmisk), sigmoidal eller effektfunksjoner7. At ingen metning av responsen er sett (det vil si ingen platå i konsentrasjonsresponskurven, selv ved supra-miljøkonsentrasjoner) skyldes sannsynligvis flere reseptorer som binder seg til individuelle aminosyrer, avhengig av konsentrasjonen, i stedet for hver aminosyre som binder seg til en bestemt reseptor; som konsentrasjonen av en gitt aminosyre øker, flere reseptorer er i stand til å binde den og derfor svare. Likevel kan fisk skille mellom blandinger av aminosyrer36,37,38,39; dette skyldes sannsynligvis kombinatoriske aktivitetsmønstre fremkalt i olfaktoriske pærer12,,40; aksonene til alle ORNer som uttrykker det samme reseptorproteinet avsluttes på samme glomeruli i olfaktoriske pærer41,,42,og en aminosyre kan aktivere mer enn én glomerulus.
Imidlertid kan svært spesifikke luktstoffer, som feromoner, fremkalle sigmoidal eller kvasi-sigmoidal konsentrasjonsresponskurver43,44. Slutningen, men ikke empirisk testet, er at disse olfaktoriske reaksjonene skyldes svært spesifikke reseptorer som binder feromonmolekylet og lite annet. Derfor, over en gitt konsentrasjon, er alle reseptorer okkupert, og ytterligere økninger vil ikke fremkalle ytterligere svar i andre ORNer. Derfor kan disse dataene monteres på en tre-parameter Hill tomt, og maksimal respons, EC50 og Hill co-effektiv kan beregnes15,,45,,46. Dette kan gi verdifull informasjon, for eksempel tilsynelatende affinitet og tilsynelatende reseptornummer, at lineære eller eksponentielle konsentrasjonsresponskurver ikke kan gi.
The authors have nothing to disclose.
Arbeid i forfatternes lab støttes av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal, prosjekter PTDC/BIA-BMA/30262/2017 og UID/Multi/04326/2019 og kontraktsprogram DL57/2016/CP1361/CT0041 til ZV.
AC pre-amplifier | Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) | NL104 | Neurolog pre-amplifier specifically designed for this type of recording. |
Digidata | Molecular Devices, LLC. (San Jose, CA, USA) | 1440A | Analogue-digital converter. |
EMG Integrator | Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) | NL703 | Leaky' electrical integrator to integrate raw activity of the nerve. |
Faraday cage | Made in-house | To reduce electrical noise. | |
Filter | Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) | NL125/6 | Filter module for electrophysiological recording. |
Gallamine triethiodide | Sigma-Aldrich (Portugal) | G8134 | Neuromuscular blocker |
L-glutamine | Sigma-Aldrich (Portugal) | G3126 | Amino acid used as odorant |
L-leucine | Sigma-Aldrich (Portugal) | L80000 | Amino acid used as odorant |
L-serine | Sigma-Aldrich (Portugal) | S4500 | Amino acid used as odorant |
Metalic base-plate | Any | Provides base for micro-manipulators. | |
Micro-hematocrit tubes | Any | To position water supply to the olfactory epithelium | |
Micro-manipulators | Narishige International Ltd (London, UK) | M-152 | Position electrodes |
MS222 (ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma-Aldrich (Portugal) | E10505 | Anesthetic |
pH probe | Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) | HI12302 | Probe to measure pH of water. |
Refractometer | Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) | HI96822 | Refractometer to measure water salinity |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich (Portugal) | 746398 | For saline solution |
Solenoid valves | The Lee Co. (Essex, CT, USA) | LFAA1201618H | For switching between background water and stimuus solutions (no longer available) |
Stereo-microscope | Zeiss, Leica, Olympus | Any suitable model. | For dissection and placement of electrodes. |
Titrator | Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) | HI84531 | Titrator to measure water alkalinity, pH and temperature. |
Tungsten micro-electrodes 0.1 MΩ | World Precision Instruments (Hitchin, UK) | TM31A10 | Extracellular electrodes. |
Valve Driver | Made in-house | 12 V DC source for operating solenoid valves. | |
Water pump (submersible) | Any | To supply anesthetic-containing water to the gills of the fish. |