CRISPR-Cas9-genomredigeringssystemet är en lättanvänd genomredigerare som har använts i modell- och icke-modellarter. Här presenterar vi en proteinbaserad version av detta system som användes för att införa en tidig stopp kodon i en parning gen av en icke-modell fintrådiga ascomycete svamp.
CRISPR-Cas9-genomredigeringssystemet är ett molekylärt verktyg som kan användas för att införa exakta förändringar i såväl modells genom som icke-modellarter. Denna teknik kan användas för en mängd olika genomredigeringsmetoder, från genkna knockouts och knockins till mer specifika förändringar som införandet av några nukleotider på en riktad plats. Genomredigering kan användas för en mängd tillämpningar, inklusive delvis funktionell karakterisering av gener, produktion av transgena organismer och utveckling av diagnostiska verktyg. Jämfört med tidigare tillgängliga genredigeringsstrategier har CRISPR-Cas9-systemet visat sig vara lätt att etablera hos nya arter och har hög effektivitet och specificitet. Den främsta orsaken till detta är att redigeringsverktyget använder en RNA-molekyl för att rikta genen eller sekvensen av intresse, vilket gör målmolekyldesignen okomplicerad, med tanke på att standardregler för basparning kan utnyttjas. I likhet med andra genomredigeringssystem kräver CRISPR-Cas9-baserade metoder också effektiva och effektiva omvandlingsprotokoll samt tillgång till sekvensdata av god kvalitet för utformningen av inriktnings-RNA- och DNA-molekylerna. Sedan införandet av detta system i 2013, Det har använts för att genetiskt ingenjör en mängd olika modellarter, inklusive Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster och Mus musculus. Därefter har forskare som arbetar med icke-modellarter tagit vara på systemet och använt det för studier av gener som är involverade i så skilda processer som sekundär metabolism i svampar, nematodtillväxt och sjukdomsresistens hos växter, bland många andra. Detta protokoll som beskrivs nedan beskriver användningen av CRISPR-Cas9 genomet redigering protokollet för trunkering av en gen som deltar i den sexuella cykeln av Huntiella omanensis, en fintrådig ascomycete svamp som tillhör Ceratostidaceae familjen.
Den ökande tillgången på högkvalitativa, helt monterade genom och transkriptomer har avsevärt förbättrat förmågan att studera en mängd olika biologiska processer i en rad organismer1. Detta gäller både modellarter och icke-modellarter, av vilka många kan erbjuda en mer varierad förståelse av biologiska processer. Dessa typer av data kan användas för genupptäckt, identifiering av transkriptionsnätverk och både hela genom- och transkriptomjämförelser, som alla kommer med sin egen uppsättning applikationer. Men medan gener förutspås, kommenterade och förmodade kopplade till olika funktionella vägar i en aldrig tidigare sett takt, den funktionella karakterisering av dessa gener kvar, begränsas av de molekylära verktygslådor som finns för många arter. Detta gäller särskilt för de icke-modellarter, där genomiska data är relativt lätta att generera men där ytterligare molekylär karakterisering har varit nära omöjligt1,2.
Partiell karakterisering av funktionerna hos specifika gener som är viktiga för biologin hos svamparter kan uppnås genom antingen knockout- eller knockin-experiment följt av fenotypisk analys av de muterade stammarna3. Dessa två system är helt beroende av att det finns gentekniska protokoll, som åtminstone omfattar ett omvandlingssystem och ett genetiskt redigeringssystem. Det finns ett antal olika omvandlingssystem som har utvecklats i en mängd filamentösa svampar4. Fysiska system som de som är beroende av biolistics och elektroporation har utvecklats i Trichoderma harzianum5 och Aspergillus niger6, respektive. System som utnyttjar kemikalier som kalciumklorid eller litiumacetat har utvecklats i Neurospora crassa7. Slutligen har biologiska system som är beroende av användning av Agrobacterium tumefaciens för omvandling framgångsrikt använts i Ceratocystis albifundus8.
I motsats till tillgången på olika omvandlingsprotokoll är genomredigeringssystemen mindre rikliga. Många av de traditionella funktionella karakterisering experiment som utförs i fintrådiga svampar utnyttjas en delad markör knockout konstruera i form av en valbar markör flankerad av regioner av homologi till målet regionen eller genen i arvsmassan3. Metoden bygger på homologi riktad (HR) DNA reparation, som anläggningar homologa rekombination mellan knockout konstruktion och den region av intresse. Denna rekombination händelse resulterar i ersättning av genen av intresse med sekvensen av den valbara markören. Tyvärr, medan detta var framgångsrik i många arter inklusive Cercospora nicotianae10, Aspergillus fumigatus11 och Grosmannia clavigera12, frekvensen av homolog rekombination är mycket varierande mellan olika svamparter, vilket gör detta till en ineffektiv och ibland oanvändbara protokoll i vissa arter3.
Andra genomredigeringssystem, inklusive de som använder sig av zink-finger nukleaser (ZFNs) och transkription activator-liknande effektor nukleaser (TALENs) utgjorde en stor förbättring på de äldre systemen, särskilt med tanke på deras förmåga att göra specifika och riktade förändringar13. Både ZFNs och TALENs består av ett nukleasprotein och ett protein som kan känna igen specifika nukleotidsekvenser13. Vid erkännande inducerar nukleas en dubbel strandade DNA-brytning som kan underlätta införandet av specifika mutationer. För att få till stånd genomförändringar måste proteinregionen som känner igen nukleotidsekvensen vara särskilt utformad för varje experiment. På grund av denna tillit till protein-nukleinsyra interaktioner för att styra redigering, utforma och producera målmolekyler för varje knockout eller knockin experiment är svårt ocharbetsintensiva 14,15. Belysande av dessa utmaningar, mycket få fintrådiga svampar har utsatts för genomet redigering med hjälp av dessa system. Ett exempel är DET TALENs-baserade systemet som utvecklades i risblästringssvampen, Magnaporthe oryzae16.
Förmodligen den största revolutionen på området för genomredigering var upptäckten och den efterföljande utvecklingen av CRISPR-Cas9-systemet- en genomredigerare som möjliggör riktad klyvning av en sekvens av intresse av en endonuclease som styrs av en RNA-molekyl. Detta var en enorm förbättring jämfört med de tidigare utvecklade arvsmassa redaktörer som förlitade sig på protein-nukleinsyra interaktioner som den stora fördelen med CRISPR-Cas9 systemet är att den bygger på en RNA-molekyl för att rikta den region av intresse. Detta innebär att systemet bygger på en RNA-DNA-interaktion och därmed kan standardbasparningsregler utnyttjas vid utformningen av varje experiment15.
CRISPR-Cas9-systemet som beskrivs här består av tre viktiga komponenter: en enda guide RNA (sgRNA), Cas9-enzymet och ett donator-DNA (dDNA)17. SgRNA består av en 20 nukleotidregion som kallas protospaceren as well as en längre region som kallas scaffolden18. Regionen protospacer används för att styra redigeringssystemet till målregionen och är därmed omgjord för varje experiment. Byggnadsställningen är den region av RNA som fysiskt binder till Cas9-enzymet för att bilda ribonukleoprotein (RNP) och är därmed identisk oavsett vilken region som ska riktas. Cas9-enzymet underlättar fysiskt klyvningen av mål-DNA, med hjälp av protospacern som en vägledning för att identifiera denna region19. Den sista komponenten, dDNA, är valfri och dess användning beror på det särskilda experimentet20. DDNA hyser den sekvens som specifikt bör införas i regionen som skärs av Cas9-enzymet, och är därmed idealisk för genknackningsexperiment där en gen införs i genomet eller för genknackningsexperiment där en antibiotikaresistensgen eller annan valbar markör införs för att ersätta den gen som är intresserad. DDNA kan också utformas på ett sådant sätt att nya sekvenser införs i arvsmassan. Till exempel, som beskrivs nedan, är det möjligt att införa en in-frame stop kodon i en viss region i genen av intresse när en gen trunkering krävs21. Andra tillämpningar inkluderar mutation av specifika regioner i genen, såsom en funktionell domän22, eller införandet av en taggning sekvens23.
En stor fördel med att använda CRISPR-Cas9-systemet är dess mångsidighet24. Ett exempel på denna anpassningsförmåga är att Cas9-enzymet kan introduceras i värdcellen i en av dess tre former- DNA, RNA eller protein- beroende på det särskilda omvandlingssystem som används. När den introduceras i DNA-form, ingår ofta cas9 genen på en plasmid tillsammans med en valbar markör, en kassett för att uttrycka sgRNA och, om nödvändigt, en kassett som kodar dDNA-sekvensen25. Den primära fördelen med detta system är att endast en enda konstruktion behöver omvandlas till cellen och framgångsrik omvandling säkerställer att alla nödvändiga komponenter för CRISRP-Cas9-medierad genomredigering är närvarande. Denna metod bygger dock på tillgängligheten av ett uttryckssystem för värdarten. För att Cas9 framgångsrikt ska kunna framkalla DNA-skador måste den uttryckas på höga nivåer, och därför krävs en lämplig och potentiellt specifik promotor. För icke-modellarter där sådana promotorer ännu inte har utvecklats kan detta vara en förringande faktor och därmed kan förmågan att införa Cas9 i RNA- eller proteinform vara ett mer attraktivt alternativ. Införandet av RNA i cellen ger sina egna utmaningar- särskilt i att RNA är instabil och kanske inte överlever omvandlingsprocessen. När den införs i antingen DNA- eller RNA-form kan gensekvensen i Cas9 dessutom behöva kodonoptimerad för användning i det särskilda värdsystemet17. Till exempel kan det hända att cas9-genen från Streptococcus pyogenes inte fungerar i en värdcell för däggdjur och en cas9-gen som har kodonoptimerats för användning i en däggdjurscell kanske inte fungerar i en växtcell. Alla dessa utmaningar kan övervinnas med hjälp av proteinformen av Cas9, som tillsammans med sgRNA kan sättas ihop till en RNP och omvandlas tillvärdcellen 26,27. Detta system är inte beroende av något endogent uttryckssystem eller kodonoptimering och bör därmed fungera i majoriteten av icke-modellarter. Nackdelen med det proteinbaserade systemet är att det inte är kompatibelt med DNA-baserade transformationssystem som Agrobacterium-medierad överföring. För att den proteinbaserade metoden ska fungera måste alltså ett transformationsprotokoll som de som förlitar sig på protoplaster eller biolistics finnas tillgängligt. Detta RNP-baserade system har framgångsrikt använts i de fintrådiga svamparna, Fusarium oxysporum26 och Mucor circinelloides27.
Huntiella omanensis, en medlem av Ceratocystidaceae familjen, är en kosmopolitisk svamp ofta finns på nyligen sårade vedartadeväxter 28. Medan gendata av hög kvalitet och transkriptom finns tillgängliga för denna art28,29,30, har ingen omvandling eller genomredigeringsprotokoll utvecklats. Hittills har forskning om H. omanensis fokuserat på de underliggande genetiska komponenterna i sin sexuella cykel29,31. Denna svamp uppvisar en typisk heterothallic sexuell cykel, med sexuell reproduktion sker uteslutande mellan isolat av MAT1-1 och MAT1-2 parning typer31. Däremot ÄR MAT1-2 isolat av den närbesläktade Huntiella moniliformis kan oberoende sexuell reproduktion och slutföra en sexuell cykel i avsaknad av en MAT1-1 partner31. Denna skillnad i sexuella förmåga tros vara, åtminstone delvis, på grund av en stor skillnad i parning genen, MAT1-2-7, där H. omanensis hamnar en full längd och intakt kopia, medan genen är allvarligt trunkeras i H. moniliformis29,31. För att ytterligare karakterisera den här genens roll i sexuell reproduktion, avkortades MAT1-2-7-genen av H. omanensis för att efterlikna den trunkering som sågs i H. moniliformis21.
Protokollet nedan beskriver omvandlingen av H. omanensis och trunkering av MAT1-2-7 genen med hjälp av en proteinbaserad version av CRISPR-Cas9 genomet redigeringssystem. Detta protokoll har utvecklats efter att tillvägagångssätten för homolog rekombination-baserade gen ersätter och plasmid-baserade CRISPR-Cas9 genomet redigering misslyckades.
Protokollet för framgångsrik omvandling av H. omanensis och redigering av MAT1-2-7 genen visades genom att införa en in-frame tidigt stopp kodon tillsammans med en gen för resistens mot hygromycin B21. Detta uppnåddes med hjälp av en proteinbaserad version av CRISPR-Cas9-genomredigeringssystemet. Experimentet medförde in vitro-transkription av sgRNA, PCR-baserad montering av dDNA och samomvandling av dessa två nukleinsyror med ett kommersiellt tillgängligt Cas9-enzym till protoplaster extraherade från H. omanensis
Till skillnad från andra protokoll som är beroende av tillgängligheten hos många andra molekylära verktyg, kan det protokoll som beskrivs ovan med framgång användas i arter för vilka den molekylära verktygslådan fortfarande är ganska begränsad21. Protokollet bygger endast på ett etablerat omvandlingssystem och tillgängligheten av NGS-data, helst hela genomsekvensen. Medan ett effektivt omvandlingssystem kan ta en del optimera i en art som detta inte är tillgänglig, det finns många olika protokoll tillgängliga för en mängd olika arter. Dessutom blir genomdata allt mer tillgängliga för även de mest obskyra arter och blir lättare att generera de novo om det inte redan finns.
Med tanke på protokollets längd finns det många steg vid vilka modifieringar kan införas och där felsökning kan vara nödvändig. Detta gäller särskilt de steg som anses vara arter specifika. Det finns till exempel många inkubationssteg i det här protokollet som måste genomföras vid specifika temperaturer och för specifika tidsperioder för att generera celltyper som är viktiga för experimentet. Dessa steg skulle därmed kräva artspecifik optimering. Där så är möjligt har mikrografier av de särskilda cellerna eller tillväxtfaserna tillhandahållits som hjälp vid överföring av detta protokoll till en annan art (Figure 1). Typ och koncentration av enzymer som används för att bryta ned svampcellscellernas cellväggar för att frigöra protoplasterna kommer också att vara specifika för den svampart som studeras. I detta protokoll används endast en källa till att man tar enzymer från, medan olika enzymkombinationer krävs för utvinning av protoplaster hos arter som Fusarium verticillioides33. Detta steg beror helt på den kemiska göra av cellväggen och kommer därmed att behöva optimeras på en art till art basis.
Denna metod är särskilt betydelsefull för dem som studerar icke-modellarter eftersom det inte finns någon tillit till ett uttryckssystem. En populär metod för att etablera CRISPR-Cas9 genomredigeringssystem är att uttrycka Cas9-proteinet, sgRNA samt dDNA från en eller två plasmider som omvandlas till de celler som valts. I detta fall behöver Cas9 uttryckas av en promotor som är kapabel till höga uttrycksnivåer i den särskilda organism som studeras. Allmänna initiativtagare har utvecklats för användning i fintrådiga svampar och även om de inte är kompatibla i alla arter, de gör det möjligt för låg nivå uttryck och framgångsrikt kan användas för att uttrycka till exempel antibiotikaresistens gener. Dessa initiativtagare tillåter dock ofta inte höga uttrycksnivåer och kan därmed inte användas för att uttrycka Cas9-proteinet. Med hjälp av en proteinbaserad version av CRISPR-Cas9-genomredigeringssystemet övervinner denna begränsning och gör att sgRNA och dDNA kan samtransformas till cellen med ett redan producerat Cas9-enzym.
Utvecklingen av detta proteinbaserade system för användning i H. omanensis kom efter många misslyckade försök till genomredigering med både den klassiska split markör tillvägagångssätt samt plasmid-baserade CRISPR-Cas9 systemet. Medan effektivitetsvinster skiljer sig åt från art till art, har split markör tillvägagångssätt framgångsrikt använts med 100% effektivitet i arter så olika som Alternaria alternata34,35, och C. nicotianae36. I motsats till detta system effektivitet i H. omanensis var noll, trots mer än 80 oberoende transformation och integration händelser. På samma sätt har det plasmidbaserade CRISPR-Cas9-systemet framgångsrikt använts med höga effektivitetsvinster i Trichoderma reesei (>93%)17 och Penicillium chrysogenum (upp till 100%)37. Detta är, återigen, i motsats till detta system användbarhet i H. omanensis. Tillräcklig uttryck för Cas9 proteinet var inte uppnåelig i H. omanensis trots att försöka ett antal potentiella initiativtagare, inklusive två art-specifika främjare förutspådde från hushållning gener. Således kunde detta system inte användas alls. Med hjälp av den proteinbaserade versionen av CRISPR-Cas9-systemet gav det dock många oberoende transformanter, varav två hyste den integrerade dDNA på rätt plats. Vidare var detta experiment försök endast en gång och var framgångsrik- ytterligare illustrerar den lätthet med vilken detta system kan användas.
Framtida tillämpningar av detta protokoll inkluderar dess optimering och användning i andra arter av Ceratocystidaceae. Det finns redan en mängd NGS-data tillgängliga för dessaarter 30,38,39 och studier angående deras värdsegenskap40, tillväxttakt och virulens41 har genomförts. Dessa studier kan stärkas genom den funktionella karakteriseringen av de gener som tros vara involverade i dessa processer, forskning som nu kommer att bli möjlig på grund av tillgången till en omvandling och genomredigeringsprotokoll.
Sammanfattningsvis blir grundlig undersökning av de gener som ligger bakom viktiga biologiska processer hos icke-modellarter allt mer tillgänglig tack vare tillgången till lättanvända genomredigeringsprotokoll som inte är beroende av förekomsten av omfattande biologiska resurser och molekylära verktygslådor. Att studera icke-modellarter blir lättare och kommer att möjliggöra upptäckten av nya vägar och intressanta avvikelser från de vanliga biologiska processer som har klarlagts i modellarter.
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt fick stöd av University of Pretoria, Institutionen för vetenskap och teknik (DST)/National Research Foundation (NRF) Centre of Excellence in Tree Health Biotechnology (CTHB). Projektet stöddes dessutom av Prof BD Wingfields DST/NRF SARChI-stol i Svampgenomik (Anslagsnummer: 98353) samt Dr AM Wilsons NRF PhD bursary (108548). Bidragsinnehavarna erkänner att åsikter, resultat och slutsatser eller rekommendationer som uttrycks i detta arbete är forskarnas och att finansieringsorganen inte accepterar något som helst ansvar i detta avseende.
EcoRI-HF | New England Biolabs, Ipswich, USA | R3101S | |
EnGen Spy Cas9 NLS protein | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0646T | Used to assemble the RNP |
Eppendorf 5810 R centrifuge | Eppendorf, Hamberg, Germany | ||
FastStart Taq DNA Polymerase | Sigma, St Louis, USA | 12032902001 | Standard DNA polyermase |
GeneJET Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific, Waltham, USA | K0691 | |
HindIII-HF | New England Biolabs, Ipswich, USA | R3104S | |
HiScribeTM T7 Quick High Yield RNA synthesis kit | New England Biolabs, Ipswich, USA | E2050S | |
Hygromycin B from Streptomyces hygroscopicus | Sigma, St Louis, USA | 10843555001 | |
Infors HT Ecotron Shaking Incubator | Infors AG, Bottmingen, Switzerland | ||
LongAmp Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0323S | Long-range, high-fidelity DNA polymerase |
Malt extract agar, 2% (MEA) | 20 g ME and 20 g agar in 1 l ddH20 | ||
Malt extract | Sigma, St Louis, USA | 70167-500G | |
Agar | Sigma, St Louis, USA | A5306 | |
Malt Extract broth, 1% (MEB) | Sigma, St Louis, USA | 70167-500G | 2 g ME in 200 ml ddH20 |
Malt Extract broth, 2% (MEB) | Sigma, St Louis, USA | 70167-500G | 4 g ME in 200 ml ddH20 |
Miracloth | Merck Millipore, New Jersey, USA | 475855 | |
Nylon membrane (positively charged) | Sigma, St Louis, USA | 11209299001 | |
Osmotic control medium (OCM) | 0.3% yeast extract, 20% sucrose, 0.3% casein hydrolysate | ||
Casein Hydrolysate | Sigma, St Louis, USA | 22090 | |
Sucrose | Sigma, St Louis, USA | 84097 | |
Yeast extract | Sigma, St Louis, USA | Y1625 | |
Osmotic control medium (OCM) agar | Osmotic control medium (OCM) + 1% agar | ||
Agar | Sigma, St Louis, USA | A5306 | |
PCR DIG Labeling Mix | Sigma, St Louis, USA | 11585550910 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific, Waltham, USA | F-530XL | High fidelity DNA polymerase |
Plasmid pcb1004 | N/A | N/A | From: Carroll et al., 1994 |
Presynthesized sgRNA | Inqaba Biotec, Pretoria, South Africa | Ordered as an synthesized dsDNA with specified sequence | |
Proteinase K | Sigma, St Louis, USA | P2308 | |
PTC Solution | 30% polyethylene glycol 8000 in STC buffer from above | ||
Polyethylene glycol 8000 | Sigma, St Louis, USA | 1546605 | |
RNase A | ThermoFisher Scientific, Waltham, USA | 12091021 | |
RNAfold Webserver | Institute for Theoretical Chemistry, University of Vienna | N/A | http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi |
RNAstructure | Mathews Lab | N/A | https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html |
Sorbitol, 1 M | Sigma, St Louis, USA | 1617000 | 182.17g sorbitol in 1 l ddH20 |
STC Buffer | 20% sucrose, 50 mM Tris-HCl pH 8.00 and 50 mM CaCl2 | ||
Calcium chloride | Sigma, St Louis, USA | 429759 | |
Tris-HCl pH 8.00 | Sigma, St Louis, USA | 10812846001 | |
Sucrose | Sigma, St Louis, USA | 84097 | |
Trichoderma harzianum lysing enzymes | Sigma, St Louis, USA | L1412 | |
Zeiss Axioskop 2 Plus Ergonomic Trinocular Microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany |