Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

CRISPR-Cas9-Vermittelte Genombearbeitung in der filamentösen Ascomycete Huntiella omanensis

Published: June 9, 2020 doi: 10.3791/61367
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Biochemistry, Genetics & Microbiology, University of Pretoria, 2Forestry & Agricultural Biotechnology Institute (FABI), University of Pretoria

Summary

Das CRISPR-Cas9 Genom-Editing-System ist ein benutzerfreundliches Genom-Editor, das in Modell- und Nicht-Modell-Arten verwendet wurde. Hier präsentieren wir eine proteinbasierte Version dieses Systems, die verwendet wurde, um ein vorzeitiges Stop-Codon in ein Paarungsgen eines nicht-modellischen fadenförmigen Ascomycet-Pilzes einzuführen.

Abstract

Das CRISPR-Cas9 Genom-Editing-System ist ein molekulares Werkzeug, das verwendet werden kann, um präzise Veränderungen in die Genome von Modell- und Nicht-Modellarten gleichermaßen einzuführen. Diese Technologie kann für eine Vielzahl von Genom-Editing-Ansätzen verwendet werden, von Gen Knockouts und Knockins bis hin zu spezifischeren Veränderungen wie der Einführung einiger Nukleotide an einem gezielten Ort. Die Genombearbeitung kann für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich der partiellen funktionellen Charakterisierung von Genen, der Produktion transgener Organismen und der Entwicklung diagnostischer Werkzeuge. Im Vergleich zu den bisher verfügbaren Gen-Editing-Strategien hat sich gezeigt, dass das CRISPR-Cas9-System sich bei neuen Arten leicht etablieren lässt und eine hohe Effizienz und Spezifität bietet. Der Hauptgrund dafür ist, dass das Bearbeitungswerkzeug ein RNA-Molekül verwendet, um das Gen oder die Sequenz von Interesse zu zielen, was das Design von Zielmolekülen einfach macht, da Standard-Basenpaarungsregeln genutzt werden können. Ähnlich wie andere Genom-Editing-Systeme erfordern CRISPR-Cas9-basierte Methoden auch effiziente und effektive Transformationsprotokolle sowie Zugang zu qualitativ hochwertigen Sequenzdaten für die Gestaltung der Ziel-RNA- und DNA-Moleküle. Seit der Einführung dieses Systems im Jahr 2013, Es wurde verwendet, um eine Vielzahl von Modellarten zu gentechnisch verändert, einschließlich Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster und Mus musculus. In der Folge haben Forscher, die an Nicht-Modell-Arten arbeiten, das System genutzt und es für die Untersuchung von Genen genutzt, die an so unterschiedlichen Prozessen wie dem Sekundärstoffwechsel bei Pilzen, Demematodenwachstum und Krankheitsresistenz in Pflanzen beteiligt sind, unter anderem. Dieses unten aufgeführte Protokoll beschreibt die Verwendung des CRISPR-Cas9-Genom-Editing-Protokolls zur Kürzung eines Gens, das am Sexualzyklus von Huntiella omanensisbeteiligt ist, einem fadenförmigen Ascomycete-Pilz, der zur Familie der Ceratocystidaceae gehört.

Introduction

Die zunehmende Verfügbarkeit von hochwertigen, vollständig zusammengesetzten Genomen und Transkriptomen hat die Fähigkeit, eine Vielzahl von biologischen Prozessen in einer Reihe von Organismen zu untersuchen, erheblich verbessert1. Dies gilt sowohl für Modellarten als auch für Nichtmodellarten, von denen viele ein vielfältigeres Verständnis biologischer Prozesse bieten können. Diese Arten von Daten können für die Genentdeckung, die Identifizierung von Transkriptionsnetzwerken und sowohl für das gesamte Genom als auch für Transkriptom-Vergleiche verwendet werden, von denen jede mit ihren eigenen Anwendungen kommt. Doch während Gene vorhergesagt, mit Anmerkungen und vermeintlichen Verknüpfungen mit verschiedenen funktionellen Pfaden in nie dagewesener Geschwindigkeit verbunden werden, bleibt die funktionelle Charakterisierung dieser Gene zurück, begrenzt durch die molekularen Toolkits, die für viele Arten verfügbar sind. Dies gilt insbesondere für die Nichtmodellarten, bei denen genomische Daten relativ einfach zu generieren sind, eine weitere molekulare Charakterisierung jedoch nahezu unmöglich war1,2.

Eine partielle Charakterisierung der Funktionen spezifischer Gene, die für die Biologie von Pilzarten wichtig sind, kann entweder durch Knockout- oder Knockin-Experimente erreicht werden, gefolgt von einer phänotyptischen Analyse der mutierten Stämme3. Diese beiden Systeme beruhen vollständig auf der Verfügbarkeit von Gentechnikprotokollen, einschließlich eines zumindest Transformationssystems und eines genetischen Bearbeitungssystems. Es gibt eine Reihe von verschiedenen Transformationssystemen, die in einer Vielzahl von fadenförmigen Pilzen entwickelt wurden4. Physikalische Systeme wie solche, die auf Biollistik und Elektroporation angewiesen sind, wurden in Trichoderma harzianum5 bzw. Aspergillus niger6entwickelt. Systeme, die Chemikalien wie Calciumchlorid oder Lithiumacetat verwenden, wurden in Neurospora crassa7entwickelt. Schließlich wurden biologische Systeme, die auf die Verwendung von Agrobacterium tumefaciens für die Transformation angewiesen sind, erfolgreich in Ceratocystis albifundus8eingesetzt.

Im Gegensatz zur Verfügbarkeit verschiedener Transformationsprotokolle sind Genom-Editing-Systeme weniger vorhanden. Viele der traditionellen funktionellen Charakterisierungsexperimente, die an fadenförmigen Pilzen durchgeführt wurden, nutzten ein Split-Marker-Knockout-Konstrukt in Form eines wählbaren Markers, der von Homologieregionen zur Zielregion oder zum Gen im Genom3flankiert wurde. Die Methode beruht auf homologiegesteuerter (HR) DNA-Reparatur, die homologe Rekombination zwischen dem Knockout-Konstrukt und der Region von Interesse bietet. Dieses Rekombinationsereignis führt dazu, dass das betreffende Gen durch die Sequenz des wählbaren Markers ersetzt wird. Leider, während dies bei vielen Arten erfolgreich war, einschließlich Cercospora nicotianae10, Aspergillus fumigatus11 und Grosmannia clavigera12, sind die Raten der homologen Rekombination bei verschiedenen Pilzarten sehr variabel, was dies zu einem ineffizienten und manchmal unbrauchbaren Protokoll bei bestimmten Arten3macht.

Andere Genom-Editing-Systeme, einschließlich derer, die Zink-Finger-Nuklease (ZFNs) und Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen (TALENs) verwenden, stellten eine große Verbesserung gegenüber den älteren Systemen dar, insbesondere angesichts ihrer Fähigkeit, spezifische und gezielte Änderungen vorzunehmen13. Sowohl ZFNs als auch TALENs bestehen aus einem Nukleaseprotein und einem Protein, das in der Lage ist, spezifische Nukleotidsequenzen zu erkennen13. Bei der Erkennung induziert die Nuklease einen doppelsträngigen DNA-Bruch, der die Einführung spezifischer Mutationen erleichtern kann. Um Genomveränderungen herbeizuführen, muss die Proteinregion, die die Nukleotidsequenz erkennt, für jedes Experiment speziell entwickelt werden. Aufgrund dieser Abhängigkeit von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen, um die Bearbeitung, Das Entwerfen und Produzieren der Targeting-Moleküle für jedes Knockout- oder Knockin-Experiment zu leiten, ist schwierig und arbeitsintensiv14,15. Zur Veranschaulichung dieser Herausforderungen wurden nur sehr wenige fadenförmige Pilze der Genombearbeitung mit diesen Systemen unterzogen. Ein Beispiel ist das TALENs-basierte System, das im Reisstrahlpilz Magnaporthe oryzae16entwickelt wurde.

Die wohl größte Revolution auf dem Gebiet der Genombearbeitung war die Entdeckung und anschließende Entwicklung des CRISPR-Cas9-Systems - ein Genomeditor, der die gezielte Spaltung einer Interessenfolge durch eine Endonuklease ermöglicht, die von einem RNA-Molekül geleitet wird. Dies war eine enorme Verbesserung gegenüber den zuvor entwickelten Genom-Editoren, die auf Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen beruhten, da der Hauptvorteil des CRISPR-Cas9-Systems darin besteht, dass es auf ein RNA-Molekül angewiesen ist, um die Region des Interesses anzusprechen. Dies bedeutet, dass das System auf eine RNA-DNA-Interaktion angewiesen ist und somit Standard-Base-Pairing-Regeln bei der Gestaltung jedes Experiments15ausgenutzt werden können.

Das HIER beschriebene CRISPR-Cas9-System besteht aus drei Hauptkomponenten: einer einzigen Guide-RNA (sgRNA), dem Cas9-Enzym und einer Spender-DNA (dDNA)17. Die sgRNA besteht aus einer 20 Nukleotidregion namens Protospacer sowie einer längeren Region, dem Gerüst18. Der Protospacer-Bereich wird verwendet, um das Bearbeitungssystem in die Zielregion zu führen und wird somit für jedes Experiment neu gestaltet. Das Gerüst ist die RNA-Region, die physikalisch an das Cas9-Enzym bindet, um das Ribonukleoprotein (RNP) zu bilden und somit unabhängig von der zielzurichtenden Region identisch ist. Das Cas9-Enzym erleichtert physisch die Spaltung der Ziel-DNA, indem der Protospacer als Leitfaden verwendet wird, um diese Region zu identifizieren19. Die letzte Komponente, die dDNA, ist optional und ihre Verwendung hängt vom jeweiligen Experiment20ab. Die dDNA enthält die Sequenz, die speziell in die Region eingefügt werden sollte, die vom Cas9-Enzym geschnitten wird, und ist daher ideal für Gen-Knockin-Experimente, bei denen ein Gen in das Genom eingeführt wird, oder für Gen-Knockout-Experimente, bei denen ein Antibiotikaresistenzgen oder ein anderer wählbarer Marker eingeführt wird, um das gen von Interesse zu ersetzen. Die dDNA kann auch so gestaltet werden, dass sie neue Sequenzen in das Genom einführt. Zum Beispiel ist es, wie unten beschrieben, möglich, ein In-Frame-Stop-Codon in eine bestimmte Region im Gen von Interesse einzuführen, wenn ein Genabschneidung erforderlich ist21. Andere Anwendungen umfassen die Mutation bestimmter Regionen des Gens, wie z. B. eine funktionelle Domäne22, oder die Einführung einer Tagging-Sequenz23.

Ein großer Vorteil des CRISPR-Cas9-Systems ist seine Vielseitigkeit24. Ein Beispiel für diese Anpassungsfähigkeit ist, dass das Cas9-Enzym in einer seiner drei Formen - DNA, RNA oder Protein - je nach verwendetem Transformationssystem in die Wirtszelle eingeführt werden kann. Wenn das cas9-Gen in DNA-Form eingeführt wird, wird es oft zusammen mit einem wählbaren Marker, einer Kassette zum Ausdruck der sgRNA und ggf. einer Kassette, die die dDNA-Sequenz25kodiert, auf einem Plasmid enthalten. Der Hauptvorteil dieses Systems besteht darin, dass nur ein einzelnes Konstrukt in die Zelle umgewandelt werden muss und eine erfolgreiche Transformation sicherstellt, dass alle notwendigen Komponenten für die CRISRP-Cas9-vermittelte Genombearbeitung vorhanden sind. Diese Methode beruht jedoch auf der Verfügbarkeit eines Ausdruckssystems für die Wirtsart. Damit Cas9 dna-Schäden erfolgreich induzieren kann, muss es auf hohem Niveau ausgedrückt werden, und daher ist ein geeigneter und potenziell spezifischer Promotor erforderlich. Für Nicht-Modell-Arten, bei denen solche Promotoren noch nicht entwickelt wurden, kann dies ein ablenkender Faktor sein und daher kann die Fähigkeit, Cas9 in RNA- oder Proteinform einzuführen, eine attraktivere Option sein. Die Einführung von RNA in die Zelle bringt ihre eigenen Herausforderungen mit sich – insbesondere darin, dass die RNA instabil ist und den Transformationsprozess möglicherweise nicht überlebt. Darüber hinaus muss die Cas9-Gensequenz, wenn sie in DNA- oder RNA-Form eingeführt wird, für den Einsatz im jeweiligen Wirtssystem codonoptimiert werden17. Beispielsweise kann das cas9-Gen von Streptococcus pyogenes in einer Säugetier-Wirtszelle nicht funktionieren, und ein cas9-Gen, das für den Einsatz in einer Säugetierzelle kodonoptimiert wurde, kann in einer Pflanzenzelle möglicherweise nicht funktionieren. All diese Herausforderungen können mit der Proteinform Von Cas9 bewältigt werden, die zusammen mit der sgRNA zu einem RNP zusammengebaut und in die Wirtszelle26,27umgewandelt werden kann. Dieses System stützt sich nicht auf ein endogenes Expressionssystem oder Codon-Optimierung und sollte daher in der Mehrheit der Nicht-Modell-Arten funktionieren. Der Nachteil des proteinbasierten Systems ist, dass es nicht mit DNA-basierten Transformationssystemen wie Agrobacterium-vermitteltemTransfer kompatibel ist. Damit die proteinbasierte Methode funktioniert, muss also ein Transformationsprotokoll wie jene, die auf Protoplasten oder Biolistika angewiesen sind, zur Verfügung stehen. Dieses RNP-basierte System wurde erfolgreich in den fadenförmigen Pilzen Fusarium oxysporum26 und Mucor circinelloides27eingesetzt.

Huntiella omanensis, ein Mitglied der Ceratocystidaceae Familie, ist ein kosmopolitischer Pilz, der oft auf frisch verwundeten holzigen Pflanzen gefunden wird28. Während für diese Art hochwertige Genom- und Transkriptomdaten zur Verfügung stehen28,29,30, wurden keine Transformations- oder Genombearbeitungsprotokolle entwickelt. Bis heute hat sich die Forschung an H. omanensis auf die zugrunde liegenden genetischen Komponenten seines Sexualzykluskonzentriert 29,31. Dieser Pilz weist einen typischen heterothallic Enzykle auf, wobei die sexuelle Fortpflanzung ausschließlich zwischen den Isolaten der Mat1-1- und MAT1-2-Paarungstypen31auftritt. Im Gegensatz dazu sind MAT1-2 Isolate der eng verwandten Huntiella moniliformis in der Lage, eine unabhängige sexuelle Fortpflanzung zu ermöglichen und einen Sexualzyklus in Abwesenheit eines MAT1-1 Partners31abzuschließen. Dieser Unterschied in den sexuellen Fähigkeiten wird angenommen, zumindest teilweise, aufgrund eines großen Unterschieds im Paarungsgen, MAT1-2-7, wo H. omanensis eine volle Länge und intakte Kopie beherbergt, während das Gen in H. moniliformis29,31stark abgeschnitten ist. Um die Rolle dieses Gens in der sexuellen Fortpflanzung weiter zu charakterisieren, wurde das MAT1-2-7-Gen von H. omanensis abgeschnitten, um die Inkation zu imitieren, die in H. moniliformis21zu sehen ist.

Das folgende Protokoll beschreibt die Transformation von H. Omanensis und die Kürzung des MAT1-2-7-Gens unter Verwendung einer proteinbasierten Version des CRISPR-Cas9 Genom-Editing-Systems. Dieses Protokoll wurde entwickelt, nachdem die Ansätze des homologen Rekombinations-basierten Genersatzes und der plasmidbasierten CRISPR-Cas9-Genombearbeitung erfolglos waren.

Protocol

1. Design und Synthese der sgRNA

  1. Um potenzielle Protospacer-Regionen zu identifizieren, die Teil der sgRNA sein werden, durchsuchen Sie manuell das Gen-of-Interest nach 5' NGG 3' Drillingen, wobei die Suchfunktion in welchem Programm auch immer verwendet wird. Kommentieren Sie diese Drillinge als PAM-Sequenzen.
    HINWEIS: Es stehen verschiedene Softwareprogramme zur Verfügung, die nach potenziellen PAM- und Protospacer-Sequenzen suchen und diese kommentieren.
    1. Wählen Sie die 20 bp vor jeder der identifizierten PAM-Sequenzen aus und kommentieren Sie diese Sequenzen als potenzielle Protospacer.
  2. Um sich für einen einzelnen Protospacer zu entscheiden, führen Sie die folgenden Filterschritte aus, um Sequenzen niedriger Qualität zu verwerfen.
    1. Um die Spezifität der potentiellen Protospacer zu testen, kombinieren Sie die PAM-Sequenz und den Protospacer in einer einzigen Sequenz und verwenden Sie sie als BLASTn-Abfrage gegen das gesamte Genom. Verwerfen Sie alle Protospacer, die Ähnlichkeitmit einer anderen Region im Genom als der Zielregion aufweisen (Abbildung 1A).
    2. Um sicherzustellen, dass sich das RNA-Molekül zur Bindung an das Cas9-Enzym in die richtige 3D-Struktur einklappt, erstellen Sie eine kombinierte Sequenz, die den Protospacer und die Gerüstsequenz speziell für das Cas9-Enzym enthält.
      1. Laden Sie jede der kombinierten Protospacer-Gerüstsequenzen in ein RNA-Sekundärstrukturvorhersagewerkzeug (Tabelle der Materialien )hoch.
      2. Analysieren Sie die Ergebnisse, indem Sie die minimalen freien Energie- und Schwerpunktsekundärstrukturen vergleichen.
        HINWEIS: Ideale Protospacer-Kandidaten haben identische minimale freie Energie und zentroide Sekundärstrukturen. Beide Sekundärstrukturen sollten aus drei Stammschleifen bestehen, unterbrochen durch fünf Ringstrukturen. Die Strukturen sollten auch hohe Bindungswahrscheinlichkeiten (rot) in der gesamten Struktur aufweisen, mit Ausnahme der Region, die den Protospacer darstellt (Abbildung 1B). Die tatsächlichen Energiewerte sind nicht relevant.
    3. Wählen Sie einen endgültigen Kandidaten aus den optionen ausgeführten Filterschritten aus, indem Sie den Kandidaten auswählen, der der Zielregion am nächsten ist.
  3. Um die sgRNA als einzelnes RNA-Molekül zu synthetisieren, verwenden Sie ein sgRNA-Synthesekit(Tabelle des Materialss), das mit dem jeweiligen Cas9-Enzym kompatibel ist, das verwendet wird (z.B. Cas9 von Streptococcus pyogenes).
    HINWEIS: Die folgenden Schritte können vom verwendeten sgRNA-Synthesekit abhängen. Für den Fall, dass ein anderes Kit verwendet wird, folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Alternativ kann die sgRNA vorsynthetisiert bestellt werden. Verwenden Sie bei der Arbeit mit RNA nukleasefreie Reagenzien und Einwegprodukte.
    1. Wenn der in Schritt 1.3 oben gewählte 20 bp Protospacer kein G am 5'-Ende enthält, fügen Sie dieser Region ein G hinzu.
    2. Fügen Sie die T7-Promoter-Sequenz am 5'-Ende der Zielsequenz hinzu. Diese Sequenz ist Standard und ist 5' TTCTAATACGACTCACTATAG 3'.
    3. Fügen Sie dem 3' Ende der Zielsequenz eine 14-nt-Überlappungssequenz hinzu. Diese Sequenz ist kit-spezifisch und ist 5' GTTTTAGAGCTAGA 3' für das hier verwendete Kit.
    4. Bestellen Sie das resultierende Fragment 5' TTCTAATACGACTCACTATAG(N)20 GTTTTAGAGCTAGA, wobei (N)20 den ausgewählten Protospacer vorsynthetisiert (Materialtabelle) darstellt.
    5. Kombinieren Sie gemäß dem Herstellerprotokoll (Materialtabelle)folgende Reagenzien bei Raumtemperatur: 2 l Wasser, 10 l Reaktionspuffer, 5 l synthetisierte Protospacersequenz, 1 l 0,1 m DTT und 2 l Transkriptase-Enzym.
    6. Inkubieren Sie diese Lösung bei 37 °C für 30 min und übertragen Sie auf Eis.
    7. Fügen Sie 30 l Wasser und 2 l DNase I hinzu, mischen und bei 37 °C für weitere 15 min mischen.
    8. Visualisieren Sie die resultierende sgRNA auf einem 2% Agarose Gel.

2. Prüfung der in vitro Cleavage Fähigkeit der sgRNA

HINWEIS: Dieser Schritt ist optional, wird jedoch empfohlen.

  1. Designprimer, die ein Fragment verstärken, das die Sequenz des Standorts beherbergt, auf den die gewählte sgRNA zielt, und die Region mit einer Standard-DNA-Polymerase verstärken.
    HINWEIS: Wenn möglich, entwerfen Sie die Primer so, dass die Spaltung am Zielstandort zwei Fragmente sehr unterschiedlicher Größe erzeugt, die sich auf einem Standard-Agarose-Gel leicht voneinander unterscheiden lassen.
  2. Montieren Sie das kombinierte sgRNA-Cas9 Ribonucleoprotein (RNP) durch Inkubation einer Lösung bestehend aus 30 nM sgRNA, wie oben synthetisiert, 30 nM Cas9 Protein, 10x Reaktionspuffer und 10 l Wasser bei 25 °C für 10 min.
  3. Testen Sie die Spaltungsfähigkeit der sgRNA, indem Sie das PCR-Produkt der Zielregion in die RNP-Lösung zu einer Endkonzentration von 3 nM einfügt.
    1. Inkubieren Sie die Lösung bei 37 °C für 15 min.
    2. Fügen Sie der Lösung 3 g Proteinase K und 2 g RNase hinzu, um die Spaltreaktion zu stoppen und bei Raumtemperatur 10 min zu inkubieren.
    3. Visualisieren Sie die resultierenden DNA-Fragmente auf einem 2% Agarose-Gel. Die sgRNA eignet sich für In-vivo-Experimente, wenn zwei Bänder der erwarteten Größe auf dem Gel beobachtet werden.

3. Design und Synthese der dDNA

  1. Entwerfen Sie die dDNA so, dass sie aus drei Regionen - 5' und 3' mit Komplementarität zur Zielregion und einer mittleren Region mit einem wählbaren Marker besteht (Materialtabelle, Abbildung 2).
    HINWEIS: Diesem wählbaren Marker können auch andere spezifische Sequenzen hinzugefügt werden. Für dieses spezielle Experiment wurde kurz vor dem wählbaren Marker eine Stop-Codon-Sequenz (5' TGA 3') hinzugefügt, wodurch ein In-Frame-Stop-Codon in das Gen eingeführt wurde. Die dDNA kann vorsynthetisiert bestellt werden. Alternativ kann die dDNA mit einem schrittweisen, überlappenden PCR-Ansatz verstärkt und montiert werden, wie unten beschrieben.
    1. Design-Primer, um ca. 800 bp der 5' und 3' flankierenden Bereiche zu verstärken. Fügen Sie 20 nt Sequenz hinzu, die die Sequenz des wählbaren Markers komplementär zum umgekehrten Primer der 5' Region und zum Vorwärtsprimer der Region 3' ergänzt.
    2. Designprimer, die den wählbaren Marker verstärken und sicherstellen, dass das verstärkte Produkt das Resistenzgen sowie einen Promotor beherbergt, der bekanntermaßen in der Interessierten Art arbeitet.
  2. Mit einer Hochtreue-DNA-Polymerase (Materialtabelle) verstärken Sie die drei dDNA-Regionen. Verstärken Sie die 5' und 3' Regionen aus der gDNA des organismus, der bearbeitet wird. Verstärken Sie den wählbaren Marker aus einer relevanten Quelle.
    1. Kombinieren Sie in einer einzigen Reaktion den verstärkten 5'-Bereich mit dem wählbaren Marker und verstärken Sie mit einer hochgradigen, hochgradigen DNA-Polymerase die gesamte Region.
    2. Kombinieren Sie in einer zweiten Einzelreaktion den verstärkten 3'-Bereich mit dem wählbaren Marker und verstärken Sie mit einer hochgradigen, hochgradigen DNA-Polymerase die gesamte Region.
    3. Kombinieren Sie schließlich die beiden vorhergehenden PCR-Produkte zu einer einzigen Reaktion und verstärken Sie die gesamte dDNA-Sequenz mit einer langgezogenen, hochgradigen DNA-Polymerase.
    4. Visualisieren Sie das DNA-Fragment auf einem 1% Agarose-Gel. Für den Fall, dass zwei oder mehr Fragmente produziert werden, reinigen Sie das richtig dimensionierte Fragment aus dem Gel mit einem Gel-Reinigungssatz.

4. Extraktion von Protoplasten

  1. Um Conidia herzustellen, impfen Sie 200 ml frische 2% Malzextraktbrühe (MEB) in einem 500 ml Kolben mit einem 1 cm x 1 cm Mycelia-bedeckten Agarblock.
    HINWEIS: Nicht alle Pilze sind in der Lage, Conidia zu produzieren. In diesem Fall kann auch Mycelia verwendet werden. Dies erfordert in der Regel höhere Konzentrationen von Lysing-Enzym weiter im Protokoll.
    1. Inkubieren Sie die flüssige Kultur in einem Schüttelinkubator bei 25 °C mit Schütteln bei 120 Umdrehungen pro Minute für 24 - 48 h.
      HINWEIS: Diese Inkubationszeit und Temperatur wurde für H. omanensisoptimiert. Dies muss für andere Arten optimiert werden.
    2. Um die Conidia zu ernten; die Flüssigkultur durch eine Schicht steriler Labortücher (z.B. Miracloth) filtern, die Konidialsuspension in 50 ml Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 3.220 x g bei 4 °C für 10 min übertragen. Entsorgen Sie den Überstand.
    3. Setzen Sie die Conidia in 5 ml Wasser und Pipette 10 l der Conidia-Lösung auf ein Mikroskopschlitten und Decken mit einem Deckelschlupf aus. Visualisieren Sie mit einem zusammengesetzten Mikroskop unter 40-facher Vergrößerung, um sicherzustellen, dass nur Conidia wiederhergestellt wurden (Abbildung 3A).
    4. In einem 500 ml-Kolben 200 ml frisches 1% MEB mit dem Gesamtvolumen von resuspendiertem Conidie impfen.
    5. Die flüssige Kultur in einem Schüttelinkubator bei 25 °C mit Schütteln bei 120 Umdrehungen pro Minute bis zu 12 h bebrüten.
      HINWEIS: Diese Inkubationszeit wurde für H. omanensisoptimiert. Dies muss für andere Arten optimiert werden.
    6. Um die Keime zu ernten, übertragen Sie die flüssige Kultur in 50 ml Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 3.220 x g bei 4 °C für 10 min. Entsorgen Sie den Überstand.
    7. Die Keimlinge in bis zu 10 ml von 1 M Sorbitol wieder aussetzen.
    8. Pipette 10 l der Keimlösung auf ein Mikroskopschlitten und Abdeckung mit einem Deckelschlupf. Visualisieren Sie mit einem zusammengesetzten Mikroskop unter 40-facher Vergrößerung, um sicherzustellen, dass nur Keimlinge zurückgewonnen wurden (Abbildung 3B).
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Keime in 1 M Sorbitbei bei -80 °C lagern.
  2. Um die Zellwände der jungen Keimlinge zu lysieren und die Protoplaste freizusetzen, fügen Sie 1 ml der Keimsuspension in verschiedenen Konzentrationen in einem sterilen 50 ml-Kolben zu 9 ml Lysing-Enzym hinzu.
    HINWEIS: Es werden unterschiedliche Enzymkonzentrationen und Inkubationszeiten verwendet, die in Tabelle 1zu finden sind. Die Enzyme und Konzentrationen sind auch wahrscheinlich variieren, je nach Pilz und müssen für jede Art optimiert werden.
    1. Die Sporenenzymlösung in einem Schüttelinkubator bei 25 °C mit Schütteln bei 80 Umdrehungen pro Minute für 2 bis 3 h inkubieren.
    2. Filtern Sie die Protoplastlösung durch eine Schicht steriler Labortücher und sammeln Sie die Protoplaste durch Zentrifugation bei 1.810 x g bei 4 °C für 10 min. Entsorgen Sie den Überstand.
      HINWEIS: Protoplaste sind Zellen ohne Zellwände und sind daher sehr empfindlich gegenüber mechanischen Störungen. Achten Sie darauf, sie sorgfältig zu behandeln, vor allem beim Pipetieren.
    3. Das Protoplastpellet vorsichtig in 200 l STC-Puffer (Materialtabelle )aussetzen.
    4. Pipette 10 l der Protoplastlösung auf ein Mikroskopschlitten und Abdeckung mit einem Deckelschlupf. Visualisieren Sie mit einem zusammengesetzten Mikroskop unter 40-facher Vergrößerung, um sicherzustellen, dass nur Protoplaste zurückgewonnen wurden (Abbildung 3C).
    5. Zählen und berechnen Sie anhand eines Hämozytometers die Anzahl der protoplasten Protoplasten, die in den obigen Schritten erzeugt werden. Verdünnen Sie die Protoplastlösung in Aliquots mit ca. 5 x 106 Protoplasten.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Protoplaste im STC-Puffer bei -80 °C lagern.

5. Protoplast- und PEG-unterstützte Transformation und transformative Erholung

  1. Um mit der Transformation zu beginnen, kombinieren Sie ca. 5 x 106 Protoplaste mit einem einzigen Volumen der RNP-Lösung und ca. 6 g des dDNA-Fragments.
    HINWEIS: Protoplaste reagieren sehr empfindlich auf mechanische Störungen. Achten Sie darauf, sie sorgfältig zu behandeln, vor allem beim Pipetieren.
    1. Mit einer Pipette, tropfen Sie langsam 1 ml einer frisch zubereiteten 30% PTC-Lösung auf die Protoplastlösung und inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur für 20 min.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist ein sensibler und sehr wichtiger Schritt. Achten Sie darauf, frisch zubereitete PTC-Lösung zu verwenden und die Lösung so langsam und gleichmäßig wie möglich über die Zellen zu werfen, wodurch eine hydrophobe Schicht über die Zelloberfläche entsteht.
    2. Fügen Sie der Protoplastlösung und Pipette langsam und schonend 5 ml osmotisches Steuermedium (OCM) hinzu, um sicherzustellen, dass die Lösung gründlich gemischt wird.
    3. Inkubieren Sie die Protoplastlösung in einem Schüttelinkubator bei 25 °C mit Schütteln bei 80 Umdrehungen pro Minute über Nacht.
  2. Um die transformierten Isolate auszuwählen, teilen Sie die Lösung in 5 leere 60 mm Kulturplatten auf.
    1. Fügen Sie 10 ml OCM-Agar, ergänzt mit 30 g/ml Hygromycin B, zu jeder Kulturplatte hinzu und drehen Sie jede Platte langsam, um sie gründlich zu mischen.
    2. Lassen Sie die erste Schicht agar setzen, bevor Sie 10 ml osmotisches Kontrollmedium Agar hinzufügen, ergänzt mit 40 g/ml Hygromycin B.
    3. Lassen Sie die zweite Agarschicht die Kulturen bei 25 °C setzen und bebrüten, bis einzelne Isolate durch beide Agarschichten wachsen.
  3. Um erfolgreich transformierte Isolate zurückzugewinnen, übertragen Sie die einzelnen wachstumsfähigen Isolate durch die mit 40 g/ml Hygromycin B ergänzte Agarschicht auf frische Malzextrakt-Agar-Agar-Platten (MEA), die mit 50 g/ml-Hygromycin B (MEA-50) ergänzt werden.
    1. Inkubieren Sie die frischen Kulturen bei 25 °C für 5 Tage, überprüfen Sie täglich auf Wachstum. Kulturen, die in diesen Medien nachhaltig wachsen können, haben sich erfolgreich transformiert und können für weitere Studien genutzt werden.

6. Bestätigung der Integration und Stabilität der dDNA

  1. Um zu bestätigen, dass die dDNA in das Genom im Zielbereich integriert wurde, entwerfen Sie Primer, die die vorhergesagten 5' und 3' Insert-Sites flankieren (Abbildung 2).
    1. Führen Sie zwei PCRs mit diesen beiden Primer-Sets und einer High-Fidelity-DNA-Polymerase durch. Wenn beide PCRs Amplicons der erwarteten Größe und Sequenz ergeben, wurde die dDNA erfolgreich in die Zielregion integriert. Bewerten Sie dann den mutierten Fleck für eine stabile Integration der dDNA.
  2. Um zu bestätigen, dass die dDNA stabil in das Genom integriert wurde und während des vegetativen Wachstums aufrechterhalten wird, führen Sie einen Medientransfertest durch.
    1. Übertragen Sie einen Block myzelbedeckter Agar von einem aktiv wachsenden mutierten Isolat auf MEA-50 Medium auf unsupplementiertes MEA-Medium. 3 Tage lang bei 25 °C inkubieren.
    2. Übertragen Sie einen Block von Mycelia-bedeckten Agar aus dem Isolat, das auf MEA-Medium wächst, auf MEA-50 Medium. 3 Tage lang bei 25 °C inkubieren.
    3. Wiederholen Sie diesen Vorgang, Übertragung aktiv wachsende Mycelia von ergänzt auf unergänzendes Medium für mindestens vier Runden.
      HINWEIS: Wenn das Isolat nach vielen Übertragungen ein nachhaltiges Wachstum auf MEA-50-Medium erreichen kann, wurde die dDNA stabil in das Genom integriert und kann durch vegetatives Wachstum aufrechterhalten werden. Der mutierte Fleck kann auf das Vorhandensein von nur einer einzigen Kopie der integrierten dDNA untersucht werden.
  3. Um zu bestätigen, dass die dDNA an einem einzigen Ort in das Genom integriert wurde, führen Sie eine Southern Blot-Analyse durch.
    1. Verdauen Sie insgesamt 30 gDNA von jedem mutierten Stamm mit HindIII und EcoRI Restriktionsenzymen in Übereinstimmung mit den Protokollen des Herstellers.
      HINWEIS: Während die Wahl des Restriktionsenzyms dem Forscher obliegt, stellen Sie sicher, dass die Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms nicht in der dDNA-Sequenz vorhanden ist.
    2. Trennen Sie die verdaute gDNA auf einem 0,75% Agarose-Gel und übertragen Sie die DNA auf eine Nylonmembran mit Standardverfahren32.
    3. Unterwerfen Sie die Membran der Hybridisierung mit einer Sonde, die auf die dDNA-Sequenz abzielt.
      1. Design-Primer, um einen kurzen (300 bp) Bereich der dDNA zu verstärken.
      2. Mit diesen Primern synthetisieren Sie die Sonde mit einem PCR DIG-Etikettierungsmix.
      3. Verwenden Sie die neu synthetisierte Sonde zur Membranhybridisierung, -behandlung und -visualisierung mit Standardverfahren32. Wenn in jeder Spur nur ein einzelnes Band zu sehen ist, ist die dDNA nur an einer einzigen Stelle im Genom vorhanden. Der mutierte Stamm kann nun für weitere phänotypische Analysen und funktionelle Charakterisierungsexperimente verwendet werden.

7. Phänotypische Analyse der mutierten Stämme

  1. Führen Sie Paarungsexperimente durch, MAT um festzustellen, ob die Störung des MAT-Gens einen Einfluss auf die sexuellen Fähigkeiten des untersuchten Pilzes hatte.
    HINWEIS: Dieser Schritt hängt von den untersuchten Gen- und Arten ab. In diesem Fall wird angenommen, dass das Gen, das gezielt ist, an der sexuellen Fortpflanzung beteiligt ist und somit Paarungstests durchgeführt wurden. Wenn man zum Beispiel dachte, das Gen sei an der asexuellen Fortpflanzung beteiligt, dann könnte so etwas wie die Konidialproduktion gemessen werden.
    1. Um die heterothallicen Fähigkeiten des mutierten Stammes zu testen, ko-inoculate frischeme MEA-Medium mit einem mutierten Stamm sowie eine Sorte von entgegengesetztem Paarungstyp. Im Falle von H. omanensis,halten Sie die Deckel der Platten geschlossen, aber nicht versiegelt und inkubieren bei Raumtemperatur für 7 Tage. Visuell für die Produktion von Sexualstrukturen bewerten.
    2. Um die homothallicen Fähigkeiten des mutierten Stammes zu testen, impfen Sie frisches MEA-Medium mit einem mutierten Stamm. Im Falle von H. omanensis,halten Sie die Deckel der Platten geschlossen, aber nicht versiegelt und inkubieren bei Raumtemperatur für 7 Tage. Visuell für die Produktion von Sexualstrukturen bewerten.
  2. Führen Sie Wachstumsratenexperimente durch, MAT um festzustellen, ob die Störung des MAT-Gens einen Einfluss auf die Wachstumsrate des untersuchten Pilzes hatte.
    1. Erstellen Sie mycelial-bedeckte Agar-Stecker aus dem aktiv wachsenden Rand der Kulturen der mutierten und wildtypischen Stämme, indem Sie die Rückseite einer großen, sterilen Pipettenspitze in den Agar einsetzen.
    2. Impfen Sie frisches MEA-Medium mit diesen Agar-Steckern. Stellen Sie sicher, dass mindestens drei Replikationen pro Kulturtyp erstellt werden.
    3. Messen Sie nach 3 Tagen Wachstum bei 20 °C das Wachstum an zwei senkrechten Durchmessern.
    4. Vergleichen Sie die Daten der Wildtype und mutierte Stämme.

Representative Results

Das oben beschriebene Protokoll erleichterte die Einführung eines vorzeitigen Stop-Codons in ein Paarungsgen aus dem Nicht-Modell Ascomycete, H. omanensis. Dieser Prozess nutzte eine Version des CRISPR-Cas9 Genom-Editing-Systems und als solche ist einer der wichtigsten Schritte in diesem Protokoll die Konstruktion und Synthese einer hochwertigen sgRNA. Abbildung 1 zeigt, wie dieses Molekül so konzipiert wurde, dass es A) gezielt auf das Gen von Interesse abzielt und wenig Ähnlichkeit mit anderen Regionen im Genom zeigt und B) falten richtig, um mit dem Cas9-Protein zu binden. Die sgRNA muss auch in der Lage sein, die Zielregion effektiv zu verkleben. Die Fähigkeit der sgRNA, die Spaltung der Zielregion zu zielen und zu ermöglichen, wurde in vitrodurchgeführt, was zwei Produkte der erwarteten Größe ergab.

Sobald eine erfolgreiche Transformation stattgefunden hat, ist es wichtig sicherzustellen, dass sich die dDNA nur einmal und an der erwarteten Stelle in das Genom integriert hat. Abbildung 2 zeigt das Design von PCR-Primern, die auf die Einfügesites abzielen, die zum Abschirmen der potenziellen Transformationsfaktoren für die richtige Integrationssite verwendet werden können. Durch das Entwerfen von Primern, die die 5' und 3' Einfügestellen flankieren, ist eine Verstärkung nur möglich, wenn die dDNA am richtigen Bereich eingefügt wird. Abbildung 4 zeigt, dass das vorzeitige Stop-Codon in das MAT1-2-7-Gen in den korrekten Leserahmen eingeführt wurde, um sicherzustellen, dass das Gen in ähnlicher Weise abgeschnitten wird wie das von H. moniliformis. Darüber hinaus zeigte die Southern Blot-Analyse, dass das dDNA-Konstrukt nur an einem einzigen Standort in das Genom integriert war.

Der Erfolg des Protokolls wurde durch die phänotypische Analyse der mutierten Stämme bestätigt. Im Fall des MAT1-2-7 Disruption-Experiments wurden zwei unabhängige mutierte Stämme entwickelt. In beiden Isolaten wurde die vegetative radiale Wachstumsrate signifikant reduziert, was auf eine pleiotrope Wirkung des neuartigen Paarungsgens hindeutet (Abbildung 5). Darüber hinaus waren die mutierten Isolate nicht in der Lage, einen Sexualzyklus zu vollenden, wodurch nur unreife Sexualstrukturen produziert wurden, die keine sexuellen Sporen produzierten (Abbildung 5). Dies war im Gegensatz zu Wildtyp-Isolaten, die den gesamten Sexualzyklus innerhalb weniger Tage nach der Inkubation abgeschlossen (Abbildung 5).

Figure 1
Abbildung 1: Auswahl eines geeigneten sgRNA-Kandidaten.
(A) Eine geeignete sgRNA hat nur Ähnlichkeit mit der Zielregion des Genoms (in diesem Fall durch die MAT-Locus-Sequenz angegeben). MAT (B) Eine geeignete sgRNA hat identische minimale freie Energie und zentroide Sekundärstrukturen, mit den drei Stammschleifen und fünf Ringen in der primären Schrittschleife. Darüber hinaus wird der Großteil der Struktur hohe Bindungswahrscheinlichkeiten aufweisen (in dunkelorange und rot angegeben), während niedrigere Bindungswahrscheinlichkeiten im Protospacer-Bereich zu sehen sind (angezeigt durch die schwarzen Dreiecke). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Entwurf, Verstärkung und Montage der dDNA.
Die ersten und zweiten Primerpaare (PP1 und PP2) werden verwendet, um etwa 800 bp vorgelagert (5') und 800 bp stromabwärts (3') des Gens von Interesse zu verstärken. Die umgekehrte Grundierung von PP1 und die Vorwärtsgrundierung von PP2 umfassen Bereiche der Homologie zur Hygromycin-Widerstandskassette. Das dritte Primerpaar verstärkt die gesamte Hygromycin-Widerstandskassette. In schrittweiser Weise werden die verschiedenen Amplicons so lange zusammengesetzt, bis die gesamte dDNA, bestehend aus der 5'-Region, der Hygromycin-Widerstandskassette und der 3'-Region, zusammengebaut ist. Bei der Umwandlung in die Zelle sollte die dDNA in der Region, in der das Cas9-Enzym zum Schneiden geleitet wurde, neu kombiniert werden, wodurch das betreffende Gen durch die Hygromycin-Resistenzkassette ersetzt wird. PP4 und PP5 können verwendet werden, um festzustellen, ob die dDNA korrekt in das Genom an der entsprechenden Stelle eingeführt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Die verschiedenen Zelltypen, die während des Protoplast-Extraktionsprotokolls wichtig sind.
(A) Conidia werden als Ausgangsmaterial für das Protokoll verwendet. Diese Conidien dürfen keimen und wachsen, bis sie (B) junge Keimlinge sind. Die ideale Wachstumsphase der jungen Keimlinge wird durch die beiden schwarzen Pfeile angezeigt. Andere myceliale Stränge, die auf (B) zu sehen sind, sind zu reif für den Abbau und sollten nicht verwendet werden. Der letzte Schritt des Protokolls ist die Freigabe der (C) runden Protoplaste, die durch die schwarzen, gepunkteten Kreise angezeigt werden. Diese Zellen haben keine Zellwände mehr und sind daher sehr empfindlich gegenüber mechanischen Störungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Die erfolgreiche Integration des TGA-Stoppcodons in das MAT1-2-7-Gen von H. omanensis.
(A) Das H. omanensis MAT1-2-7 Gen in voller Länge, wobei die sgRNA-Zielstelle durch den grünen Pfeil gekennzeichnet ist. (B) Ein vergrößerter Schaltplan der sgRNA-Zielstelle innerhalb des Gens H. omanensis MAT1-2-7. (C) Ein vergrößertes Schaltschema einer Region der dDNA, die das Stopp-Codon zeigt, das von Armen flankiert wird, die dem MAT1-2-7-Gen von H. omanensiszuhomken. (D) Sanger-Sequenzchromatogramm, das auf die erfolgreiche Integration des Stop-Codons in das MAT1-2-7-Gen hinweist. Geändert von Wilson et al. 202021. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Die phänotypischen Unterschiede zwischen (A) Wildtypisolaten und (B) mutierten Isolaten.
Die ersten drei Bilder in jedem Panel zeigen die Unterschiede in den sexuellen Fähigkeiten der beiden Isolattypen. Während die Wildtypisatisaisen während der sexuellen Fortpflanzung reifen Askomate bilden, komplett mit dem Ausexsudat von Sporen aus den Spitzen der ascomatalen Hälse, bilden die Mutantenisolate nur unreife Sexualstrukturen, die keine sexuellen Sporen produzieren. Das vierte Bild in jedem Panel zeigt den Unterschied in der Wachstumsrate und Morphologie der beiden Isolattypen. Während das Wildtyp-Isolat viel schneller und mit mehr Luftmyzelia wächst, zeigt der Mutant langsamer und taucht im Agar unter. Geändert von Wilson et al. 202021. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Reaktion Enzymkonzentration Abbauzeit
Eine 1.250 mg/ml 180 Min.
B 1.875 mg/ml 180 Min.
C 2.500 mg/ml 150 Min.
D 3.750 mg/ml 150 Min.
E 4,375 mg/ml 120 Min.
F 5.000 mg/ml 120 Min.

Tabelle 1: Abbau der Keim-/Mycelia-Lösung mit Lysing-Enzymen aus Trichoderma harzianum. Die verschiedenen Enzymkonzentrationen entsprechen unterschiedlichen Inkubationszeiten, wobei niedrigere Konzentrationen längere Inkubationen erfordern.

Discussion

Das Protokoll zur erfolgreichen Transformation von H. Omanensis und der Bearbeitung des MAT1-2-7-Gens wurde durch die Einführung eines inframe vorzeitigen Stop-Codons zusammen mit einem Gen zur Resistenz gegen Hygromycin B21demonstriert. Dies wurde mit einer proteinbasierten Version des CRISPR-Cas9 Genom-Editing-Systems erreicht. Das Experiment beinhaltete die In-vitro-Transkription der sgRNA, PCR-basierte Montage der dDNA und die Ko-Transformation dieser beiden Nukleinsäuren mit einem kommerziell erhältlichen Cas9-Enzym in Protoplasten, die aus H. Omanensis extrahiert wurden.

Im Gegensatz zu anderen Protokollen, die auf der Verfügbarkeit vieler anderer molekularer Werkzeuge beruhen, kann das oben beschriebene Protokoll erfolgreich bei Arten verwendet werden, für die die molekulare Toolbox noch ziemlich begrenzt ist21. Das Protokoll stützt sich nur auf ein etabliertes Transformationssystem und die Verfügbarkeit von NGS-Daten, vorzugsweise ganze Genomsequenz. Während ein effektives Transformationssystem einige Optimierung in einer Art, für die dies nicht verfügbar ist, kann es viele verschiedene Protokolle für eine Vielzahl von Arten zur Verfügung. Darüber hinaus werden Genomdaten immer mehr für die dunkelsten Arten verfügbar und werden immer leichter zu generieren de novo, wenn sie nicht bereits vorhanden sind.

Angesichts der Länge des Protokolls gibt es viele Schritte, in denen Änderungen vorgenommen werden können und bei denen eine Fehlerbehebung erforderlich sein kann. Dies gilt insbesondere für die Schritte, die als artspezifisch gelten. Beispielsweise gibt es viele Inkubationsschritte in diesem Protokoll, die bei bestimmten Temperaturen und für bestimmte Zeiträume durchgeführt werden müssen, um zellspezifische Typen zu generieren, die für das Experiment wichtig sind. Diese Schritte würden daher eine artspezifische Optimierung erfordern. Soweit möglich, wurden Mikrographen der einzelnen Zellen oder Wachstumsphasen zur Verfügung gestellt, um die Übertragung dieses Protokolls auf eine andere Art zu unterstützen(Abb. 1). Die Art und Konzentration von Enzymen, die verwendet werden, um die Zellwände der Pilzzellen zu degradieren, um die Protoplaste freizusetzen, wird auch spezifisch für die untersuchten Pilzarten sein. In diesem Protokoll wird nur eine Quelle von Lysing-Enzymen verwendet, während verschiedene Enzymkombinationen für die Extraktion von Protoplasten bei Arten wie Fusarium verticillioides33erforderlich sind. Dieser Schritt hängt ganz von der chemischen Herstellung der Zellwand ab und muss daher artgerecht optimiert werden.

Diese Methode ist besonders wichtig für diejenigen, die Nicht-Modell-Arten studieren, da es keine Abhängigkeit von einem Ausdruckssystem gibt. Eine beliebte Methode zur Etablierung des CRISPR-Cas9-Genombearbeitungssystems besteht darin, das Cas9-Protein, die sgRNA sowie die dDNA aus einem oder zwei Plasmiden auszudrücken, die in die Zellen der Wahl umgewandelt werden. In diesem Fall muss der Cas9 von einem Promotor ausgedrückt werden, der in der Lage ist, in dem untersuchten Organismus ein hohes Expressionsniveau zu erreichen. Allgemeine Förderer wurden für den Einsatz in fadenförmigen Pilzen entwickelt, und obwohl sie nicht in allen Arten kompatibel sind, ermöglichen sie eine niedrige Expression und können erfolgreich verwendet werden, um beispielsweise Antibiotikaresistenzgene auszudrücken. Diese Promotoren lassen jedoch oft keine hohe Expression zu und können daher nicht zur Expression des Cas9-Proteins verwendet werden. Die Verwendung einer proteinbasierten Version des CRISPR-Cas9 Genom-Editing-Systems überwindet diese Einschränkung und ermöglicht die Ko-Umwandlung von sgRNA und dDNA in die Zelle mit einem bereits produzierten Cas9-Enzym.

Die Entwicklung dieses proteinbasierten Systems für den Einsatz in H. omanensis erfolgte nach vielen erfolglosen Versuchen der Genombearbeitung sowohl mit dem klassischen Split-Marker-Ansatz als auch mit dem Plasmid-basierten CRISPR-Cas9-System. Während die Effizienz von Art zu Art unterschiedlich ist, wurde der Split-Marker-Ansatz erfolgreich mit 100% Effizienz bei so unterschiedlichen Arten wie Alternaria alternata34,35und C. nicotianae36eingesetzt. Im Gegensatz dazu war die Effizienz dieses Systems in H. omanensis null, trotz mehr als 80 unabhängiger Transformations- und Integrationsereignisse. In ähnlicher Weise wurde das plasmidbasierte CRISPR-Cas9-System erfolgreich mit hoher Effizienz in Trichoderma reesei (>93%)17 und Penicillium chrysogenum (bis zu 100%)37eingesetzt. Dies steht wiederum im Gegensatz zur Nützlichkeit dieses Systems in H. omanensis. Eine ausreichende Expression des Cas9-Proteins war bei H. omanensis nicht erreichbar, obwohl eine Reihe potenzieller Promotoren versucht wurden, darunter zwei artspezifische Promotoren, die von Haushaltsgenen vorhergesagt wurden. Somit konnte dieses System überhaupt nicht verwendet werden. Mit der proteinbasierten Version des CRISPR-Cas9-Systems ergaben jedoch viele unabhängige Transformationsmittel, von denen zwei die integrierte dDNA an der richtigen Stelle beherbergten. Darüber hinaus wurde dieses Experiment nur einmal versucht und war erfolgreich - weiter, um die Leichtigkeit zu veranschaulichen, mit der dieses System verwendet werden kann.

Zukünftige Anwendungen dieses Protokolls umfassen seine Optimierung und Verwendung in anderen Arten der Ceratocystidaceae. Es gibt bereits eine Fülle von NGS-Daten für diese Arten30,38,39 und Studien über ihre Wirtsspezifität40, Wachstumsrate und Virulenz41 wurden durchgeführt. Diese Studien können durch die funktionelle Charakterisierung der Gene, von denen angenommen wird, dass sie an diesen Prozessen beteiligt sind, verstärkt werden, forschung, die nun durch die Verfügbarkeit eines Transformations- und Genom-Editing-Protokolls möglich sein wird.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine gründliche Untersuchung der Gene, die wichtigen biologischen Prozessen in Nicht-Modellarten zugrunde liegen, dank der Verfügbarkeit von benutzerfreundlichen Genom-Editing-Protokollen, die nicht auf der Existenz umfangreicher biologischer Ressourcen und molekularer Toolkits beruhen, zugänglicher wird. Das Studium von Nicht-Modell-Arten wird immer einfacher und ermöglicht die Entdeckung neuartiger Pfade und interessanter Abweichungen von den biologischen Standardprozessen, die in Modellarten aufgeklärt wurden.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Dieses Projekt wurde von der Universität Pretoria, dem Department of Science and Technology (DST)/National Research Foundation (NRF) Centre of Excellence in Tree Health Biotechnology (CTHB) unterstützt. Das Projekt wurde zusätzlich durch den DST/NRF SARChI-Lehrstuhl von Prof. BD Wingfield in Fungal Genomics (Grant-Nummer: 98353) sowie Dr. AM Wilsons NRF PhD-Stipendium (108548) unterstützt. Die Stipendiaten erkennen an, dass die in dieser Arbeit zum Ausdruck gebrachten Meinungen, Feststellungen und Schlussfolgerungen oder Empfehlungen die der Forscher sind und dass die Förderstellen in dieser Hinsicht keinerlei Haftung übernehmen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EcoRI-HF New England Biolabs, Ipswich, USA R3101S
EnGen Spy Cas9 NLS protein New England Biolabs, Ipswich, USA M0646T Used to assemble the RNP
Eppendorf 5810 R centrifuge Eppendorf, Hamberg, Germany
FastStart Taq DNA Polymerase Sigma, St Louis, USA 12032902001 Standard DNA polyermase
GeneJET Gel Extraction Kit ThermoFisher Scientific, Waltham, USA K0691
HindIII-HF New England Biolabs, Ipswich, USA R3104S
HiScribeTM T7 Quick High Yield RNA synthesis kit New England Biolabs, Ipswich, USA E2050S
Hygromycin B from Streptomyces hygroscopicus Sigma, St Louis, USA 10843555001
Infors HT Ecotron Shaking Incubator Infors AG, Bottmingen, Switzerland
LongAmp Taq DNA Polymerase New England Biolabs, Ipswich, USA M0323S Long-range, high-fidelity DNA polymerase
Malt extract agar, 2% (MEA) 20 g ME and 20 g agar in 1 l ddH20
Malt extract Sigma, St Louis, USA 70167-500G
Agar Sigma, St Louis, USA A5306
Malt Extract broth, 1% (MEB) Sigma, St Louis, USA 70167-500G 2 g ME in 200 ml ddH20
Malt Extract broth, 2% (MEB) Sigma, St Louis, USA 70167-500G 4 g ME in 200 ml ddH20
Miracloth Merck Millipore, New Jersey, USA 475855
Nylon membrane (positively charged) Sigma, St Louis, USA 11209299001
Osmotic control medium (OCM) 0.3% yeast extract, 20% sucrose, 0.3% casein hydrolysate
Casein Hydrolysate Sigma, St Louis, USA 22090
Sucrose Sigma, St Louis, USA 84097
Yeast extract Sigma, St Louis, USA Y1625
Osmotic control medium (OCM) agar Osmotic control medium (OCM) + 1% agar
Agar Sigma, St Louis, USA A5306
PCR DIG Labeling Mix Sigma, St Louis, USA 11585550910
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase ThermoFisher Scientific, Waltham, USA F-530XL High fidelity DNA polymerase
Plasmid pcb1004 N/A N/A From: Carroll et al., 1994
Presynthesized sgRNA Inqaba Biotec, Pretoria, South Africa Ordered as an synthesized dsDNA with specified sequence
Proteinase K Sigma, St Louis, USA P2308
PTC Solution 30% polyethylene glycol 8000 in STC buffer from above
Polyethylene glycol 8000 Sigma, St Louis, USA 1546605
RNase A ThermoFisher Scientific, Waltham, USA 12091021
RNAfold Webserver Institute for Theoretical Chemistry, University of Vienna N/A http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
RNAstructure Mathews Lab N/A https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html
Sorbitol, 1 M Sigma, St Louis, USA 1617000 182.17g sorbitol in 1 l ddH20
STC Buffer 20% sucrose, 50 mM Tris-HCl pH 8.00 and 50 mM CaCl2
Calcium chloride Sigma, St Louis, USA 429759
Tris-HCl pH 8.00 Sigma, St Louis, USA 10812846001
Sucrose Sigma, St Louis, USA 84097
Trichoderma harzianum lysing enzymes Sigma, St Louis, USA L1412
Zeiss Axioskop 2 Plus Ergonomic Trinocular Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ekblom, R., Galindo, J. Applications of next generation sequencing in molecular ecology of non-model organisms. Heredity. 107, 1-15 (2011).
  2. Russell, J. J., et al. Non-model model organisms. BMC Biology. 15 (55), 1-31 (2017).
  3. Kück, U., Hoff, B. New tools for the genetic manipulation of filamentous fungi. Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 51-62 (2010).
  4. Li, D., Tang, Y., Lin, J., Cai, W. Methods for genetic transformation of filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 16 (168), 1-13 (2017).
  5. Lorito, M., Hayes, C. K., Di Pietro, A., Harman, G. E. Biolistic transformation of Trichoderma harzianum and Gliocladium virens using plasmid and genomic DNA. Current Biotechnology. 24, 349-356 (1993).
  6. Taylor, P., et al. Transformation of intact Aspergillus niger by electroporation. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 58 (12), 2224-2227 (2014).
  7. Dhawale, S. S., Paietta, J. V., Marzluf, G. A. A new, rapid and efficient transformation procedure for Neurospora. Current Genetics. 8, 77-79 (1984).
  8. Sayari, M., Van Der Nest, M. A., Steenkamp, E. T., Adegeye, O. O., Marincowitz, S. Agrobacterium-mediated transformation of Ceratocystis albifundus. Microbiological Research. 226, 55-64 (2019).
  9. Meyer, V. Genetic engineering of filamentous fungi- Progress, obstacles and future trends. Biotechnology Advances. 26, 177-185 (2008).
  10. You, B. J., Lee, M. H., Chung, K. R. Gene-specific disruption in the filamentous fungus Cercospora nicotianae using a split-marker approach. Archives of Microbiology. 191, 615-622 (2009).
  11. Gravelat, F. N., Askew, D. S., Sheppard, D. C. Targeted gene deletion in Aspergillus fumigatus using the hygromycin-resistance split-marker approach. Host-Fungus Interactions. 845, 119-130 (2012).
  12. Wang, Y., Diguistini, S., Bohlmann, J., Breuil, C. Agrobacterium-meditated gene disruption using split-marker in Grosmannia clavigera, a mountain pine beetle associated pathogen. Current Genetics. 56, 297-307 (2010).
  13. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333, 307 (2011).
  14. Mahfouz, M. M., Piatek, A., Neal, C. Genome engineering via TALENs and CRISPR/Cas9 systems: Challenges and perspectives. Plant Biotechnology. 12, 1006-1014 (2014).
  15. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in genome editing and beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
  16. Arazoe, T., et al. Tailor-made TALEN system for highly efficient targeted gene replacement in the rice blast fungus. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1335-1342 (2015).
  17. Liu, R., Chen, L., Jiang, Y., Zhou, Z., Zou, G. Efficient genome editing in filamentous fungus Trichoderma reesei using the CRISPR/Cas9 system. Cell Discovery. 1, 1-11 (2015).
  18. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-822 (2012).
  19. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (39), 2579-2586 (2012).
  20. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Cell. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  21. Wilson, A. M., Wilken, P. M., Van Der Nest, M. A., Wing, M. J., Wing, B. D. The novel Huntiella omanensis mating gene, MAT1-2-7, is essential for ascomatal maturation. Fungal Genetics and Biology. 137, 103335 (2020).
  22. Miao, J., et al. Characterization of an N-terminal non-core domain of RAG1 gene disrupted Syrian Hamster model generated by CRISPR Cas9. Viruses. 10 (243), 10050243 (2018).
  23. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2016).
  24. Schneider, S., Kirchner, M., Kirchner, M., Schneider, S. CRISPR-Cas: From the bacterial adaptive immune system to a versatile tool for genome engineering. Angewandte Chemie International Edition. 54 (46), 13508-13514 (2015).
  25. Nødvig, C. S., Nielsen, J. B., Kogle, M. E., Mortensen, U. H. A CRISPR-Cas9 system for genetic engineering of filamentous fungi. PLoS ONE. 10 (7), 1-18 (2015).
  26. Wang, Q., Cobine, P. A., Coleman, J. J. Efficient genome editing in Fusarium oxysporum based on CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Fungal Genetics and Biology. 117, 21-29 (2018).
  27. Nagy, G., et al. Development of a plasmid free CRISPR-Cas9 system for the genetic modification of Mucor circinelloides. Scientific Reports. 7 (16800), 1-10 (2017).
  28. Al-Subhi, A. M., Al-Adawi, A. O., Van Wyk, M., Deadman, M. L., Wingfield, M. J. Ceratocystis omanensis, a new species from diseased mango trees in Oman. Mycological Research. 110 (2), 237-245 (2006).
  29. Wilson, A. M., van der Nest, M. A., Wilken, P. M., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D. Pheromone expression reveals putative mechanism of unisexuality in a saprobic ascomycete fungus. PLoS ONE. 13 (3), 0192517 (2018).
  30. van der Nest, M. A., et al. Draft genomes of Amanita jacksonii, Ceratocystis albifundus, Fusarium circinatum, Huntiella omanensis, Leptographium procerum, Rutstroemia sydowiana, and Sclerotinia echinophila. IMA Fungus. 5 (2), 472-485 (2014).
  31. Wilson, A. M., Godlonton, T., van der Nest, M. A., Wilken, P. M., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D. Unisexual reproduction in Huntiella moniliformis. Fungal Genetics and Biology. 80, 1-9 (2015).
  32. Sambrook, J., Green, M. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  33. Ramamoorthy, V., Govindaraj, L., Dhanasekaran, M., Vetrivel, S., Kumar, K. K., Ebenezar, E. Combination of driselase and lysing enzyme in one molar potassium chloride is effective for the production of protoplasts from germinated conidia of Fusarium verticillioides. Journal of Microbiological Methods. , (2015).
  34. Lin, C., Yang, S. L., Wang, N., Chung, K. The FUS3 MAPK signaling pathway of the citrus pathogen Alternaria alternata functions independently or cooperatively with the fungal redox-responsive AP1 regulator for diverse developmental, physiological and pathogenic processes. Fungal Genetics and Biology. 47 (4), 381-391 (2010).
  35. Lin, C., Chung, K. Specialized and shared functions of the histidine kinase- and HOG1 MAP kinase-mediated signaling pathways in Alternaria alternata, a filamentous fungal pathogen of citrus. Fungal Genetics and Biology. 47 (10), 818-827 (2010).
  36. Choquer, M., et al. The CTB1 gene encoding a fungal polyketide synthase is required for cercosporin biosynthesis and fungal virulence of Cercospora nicotianae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (5), 468-476 (2005).
  37. Pohl, C., Kiel, J. A. K. W., Driessen, A. J. M., Bovenberg, R. A. L., Nygård, Y. CRISPR/Cas9 based genome editing of Penicillium chrysogenum. ACS Synthetic Biology. 5 (7), 754-764 (2016).
  38. van der Nest, M. A. M. A., et al. Draft genome sequences of Diplodia sapinea, Ceratocystis manginecans and Ceratocystis moniliformis. IMA Fungus. 5 (1), 135-140 (2014).
  39. Wingfield, B. D., et al. Draft genome sequences for Ceratocystis fagacearum, C. harringtonii, Grosmannia penicillata, and Huntiella bhutanensis. IMA Fungus. 7 (2), 317-323 (2016).
  40. Fourie, A., Van Der Nest, M. A., De Vos, L., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D., Barnes, I. QTL mapping of mycelial growth and aggressiveness to distinct hosts in Ceratocystis pathogens. Fungal Genetics and Biology. 131, 103242 (2019).
  41. Lee, D. H., Roux, J., Wingfield, B. D., Wingfield, M. J. Variation in growth rates and aggressiveness of naturally occurring self-fertile and self-sterile isolates of the wilt pathogen Ceratocystis albifundus. Plant Pathology. 64 (5), 1103-1109 (2015).

Tags

Genetik Ausgabe 160 Genombearbeitung CRISPR-Cas9 RNP Transformationen Sexuelle Fortpflanzung Pilze Huntiella omanensis
CRISPR-Cas9-Vermittelte Genombearbeitung in der filamentösen Ascomycete <em>Huntiella omanensis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilson, A. M., Wingfield, B. D.… More

Wilson, A. M., Wingfield, B. D. CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis. J. Vis. Exp. (160), e61367, doi:10.3791/61367 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter