यह प्रोटोकॉल झिल्ली-बाध्य बहिर्मंडल के रूप में सी एलिगेंस कोशिकाओं द्वारा उत्पादित बड़े कुल और/या ऑर्गेनेल एक्सट्रूज़न (~ 4 माइक्रोन) का पता लगाने और क्वांटिटेशन के लिए दृष्टिकोणों का वर्णन करता है । हम इस मलबे निष्कासन तंत्र के विच्छेदन को सुविधाजनक बनाने के लिए आवश्यक उपभेदों, विकास की स्थिति, स्कोरिंग मानदंड, समय और माइक्रोस्कोपी विचारों का वर्णन करते हैं ।
गलतुस् हुआ प्रोटीन और माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन की विषाक्तता निर्णायक कारक हैं जो प्रजातियों में उम्र से जुड़े कार्यात्मक न्यूरोनल गिरावट और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग को बढ़ावा देते हैं। यद्यपि इन न्यूरोटॉक्सिक चुनौतियों को लंबे समय से सेल-आंतरिक माना जाता है, लेकिन अब काफी सबूत इस बात का समर्थन करते हैं कि एक न्यूरॉन में उत्पन्न होने वाले मानव रोग प्रोटीन पड़ोसी कोशिकाओं में दिखाई दे सकते हैं, एक घटना जो मानव न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग में फैले विकृति को बढ़ावा देने के लिए प्रस्तावित है।
सी एलिगेंस वयस्क न्यूरॉन्स जो एकत्रित प्रोटीन को व्यक्त करते हैं, बड़े (~ 4 माइक्रोन) झिल्ली से घिरे वेसिकल्स को बाहर निकाल सकते हैं जिसमें एकत्रित प्रोटीन, माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम्स शामिल हो सकते हैं। इन बड़े वेसिकल्स को “एक्सोफर्स” कहा जाता है और एक्सोसोम्स से अलग होते हैं (जो लगभग 100x छोटे होते हैं और विभिन्न बायोजेनेसिस होते हैं)। एक्सोफर्स में सेलुलर मलबे को फेंकना एक संरक्षित तंत्र द्वारा हो सकता है जो एक मौलिक, लेकिन पूर्व में गैर-मान्यता प्राप्त, न्यूरोनल प्रोटेओस्टेसिस और माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण की शाखा है, जो उन प्रक्रियाओं के लिए प्रासंगिक है जिनके द्वारा मानव न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों में फैलता है।
जबकि एक्सोफर्स का ज्यादातर उन जानवरों में अध्ययन किया गया है जो टच न्यूरॉन्स के भीतर उच्च कॉपी ट्रांसजेनिक म्हेरी व्यक्त करते हैं, ये प्रोटोकॉल फ्लोरोफेरेनेसिस के अध्ययन में फ्लोरोसेंटली टैग किए गए ऑर्गेनेल्स या न्यूरॉन्स के विभिन्न वर्गों में रुचि के अन्य प्रोटीन का उपयोग करके समान रूप से उपयोगी होते हैं।
यहां वर्णित सी एलिगेंस एक्सोफेर्स की भौतिक विशेषताएं हैं, उनका पता लगाने के लिए रणनीतियां, पहचान मानदंड, क्वांटिटेशन के लिए इष्टतम समय, और पशु विकास प्रोटोकॉल जो तनावों के लिए नियंत्रण करते हैं जो एक्सोफर उत्पादन स्तर को संशोधित कर सकते हैं। साथ में, यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल का विवरण प्रयोगशालाओं में बहिर्मंडलों के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक मानक स्थापित करने की सेवा करनी चाहिए । यह दस्तावेज प्रयोगशालाओं के लिए क्षेत्र में एक संसाधन के रूप में काम करना चाहता है, जिसके द्वारा एक्सोफर का उत्पादन किया जाता है और जिसके द्वारा पड़ोसी और दूर की कोशिकाओं द्वारा एक्सोफर्स पर प्रतिक्रिया व्यक्त की जाती है ।
समुच्चय और बेकार माइटोकॉन्ड्रिया की न्यूरोटॉक्सिक चुनौतियों को लंबे समय से सेल-आंतरिक माना जाता रहा है, लेकिन हाल ही में यह स्पष्ट हो गया है कि एक न्यूरॉन में निकलने वाले मानव रोग प्रोटीन पड़ोसी कोशिकाओं में भी फैल सकते हैं, विकृति1को बढ़ावा दे सकते हैं। इसी तरह, स्तनधारी माइटोकॉन्ड्रिया को उनके मूल उत्पादन की कोशिका से ट्रांससेलुलर क्षरण 2 या चुनौती प्राप्त पड़ोसी कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियलआबादी के बचाव के लिए भेजा जा सकता है3। विभिन्न आकारों के वेसिकल्स को आम तौर पर सेलुलर सामग्रियों को पड़ोसी कोशिकाओं या तरल वातावरण में स्थानांतरित करने के लिएदेखागया है । कुछ निकाले गए वेसिकल्स औसत न्यूरोनल सोमा (औसत स्पर्श न्यूरॉन सोमा ~ 6 माइक्रोन) के आकार का दृष्टिकोण रखते हैं और बड़े समुच्चय और ऑर्गेनेल्स को समायोजित कर सकते हैं।
बड़े वेसिकल एक्सट्रूज़न का एक उल्लेखनीय उदाहरण जो प्रोटीन समुच्चय ले जा सकता है और ऑर्गेनेल्स सी एलिगेंस टच रिसेप्टर न्यूरॉन्स में होता है जो एक उच्च कॉपी संख्या रिपोर्टर को व्यक्त करता है जो एक हानिकारक एकत्रीकरण-प्रवण, क्षरण प्रतिरोधी रीचरी5का निर्माण करता है। स्पर्श न्यूरॉन्स से एक्सोफर्स कहा जाता है, से निष्कासन ~ 4 माइक्रोन औसत व्यास हैं, चुनिंदा में एमएचरी या अन्य समुच्चय शामिल हैं, और सीधे पड़ोसी हाइपोडर्मिस में वितरित किए जाते हैं, जो आम तौर पर स्पर्श रिसेप्टर न्यूरॉन्स को घेरे रहते हैं। हाइपोडर्मिस लाइसोसोम-आधारित गिरावट का प्रयास करता है, लेकिन कुछ गैर-पचने वाली सामग्री जैसे कि म्हेरी समुच्चय को हाइपोडर्मिस द्वारा जानवर के तरल पदार्थ से भरे छद्म कोकोलोम में फिर से निकाला जा सकता है, जिसमें से रीचेरी को रिमोट मेहतर कोशिकाओं द्वारा लिया जा सकता है जिसे दीर्घकालिक भंडारण(चित्रा 1, चित्रा 2) 5के लिए कोलोमोसाइट्स कहाजाताहै।
बड़े एक्सोफर वेसिकल्स स्पर्श रिसेप्टर प्लाज्मा झिल्ली से घिरे कोशिका को छोड़ देते हैं और इसमें एकत्रित मानव रोग प्रोटीन, माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम्स हो सकते हैं। एक्सोफ्रेड उत्पादन की प्रक्रिया में संभावित विषाक्त प्रजातियों की छंटाई शामिल प्रतीत होती है (उदाहरण के लिए एक एकत्रीकरण-प्रवण व्यक्त mCherry घुलनशील, GFP जैसे आक्रामक प्रोटीन से अलग किया जाता है जो ज्यादातर न्यूरोनल सोमा में रहता है)। इस तरह, धमकी देने वाली संस्थाओं के निर्देशित निष्कासन को न्यूरॉन 5 द्वारा पूरा कियाजाताहै। एक प्रोटेओस्टेसिस चैलेंज, जैसे ऑटोफैगी नॉकडाउन से प्रेरित तनाव, MG132-मध्यस्थता प्रोटेसोम अवरोध, या मानव रोग प्रोटीन की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति जैसे हंटिंगटन रोग से जुड़े विस्तारित पॉलीग्लुटामाइन Q128 या अल्जाइमर रोग-फंसाया टुकड़ा एक1-42,न्यूरॉन्स की संख्या में वृद्धि कर सकते हैं जो एक्सोथर्स5का उत्पादन करते हैं।
के रूप में बहिर्मंडल केवल हाल ही में प्रलेखित किया गया है, क्या उनके जीव विज्ञान गुण विवरण के बारे में जाना जाता है । एक्सोफर्स की खोज की गई थी, और सी एलिगेंस टच रिसेप्टर न्यूरॉन्स में सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किया जाता है। छह सी एलिगेंस मेकेनोसेंसरी टच न्यूरॉन्स हैं जिनमें शरीर के चारों ओर सेल बॉडी वितरित होती है(चित्रा 3 ए)और माइक्रोट्यूबुल कोशिकाएं कहा जाता है क्योंकि उनके अल्ट्रास्ट्रक्चर में विशिष्ट 15 प्रोटोफिलामेंट माइक्रोट्यूबुल्स होते हैं। स्पर्श रिसेप्टर न्यूरॉन्स पूर्वकाल एवीएम (पूर्वकाल वेंट्रल माइक्रोट्यूबुल न्यूरॉन), एएलएमआर, और एएलएमएल (पूर्वकाल पार्श्व माइक्रोट्यूबुल न्यूरॉन्स दाएं और बाएं), अधिक केंद्रीय पीवीएम (पीछे वेंट्रल माइक्रोट्यूबुल न्यूरॉन), और पीछे पीएलएमआर और पीएलएम (पीछे पार्श्व माइक्रोट्यूबुल न्यूरॉन्स दाएं और बाएं) हैं। दिलचस्प बात यह है कि छह टच रिसेप्टर न्यूरॉन्स एक ही आक्रामक ट्रांसजीन(चित्रा 3C)व्यक्त करने के बावजूद, विभिन्न दरों पर एक्सोफर्स का उत्पादन करते हैं। छह मेकेनोसेंसरी टच रिसेप्टर न्यूरॉन्स में से, एएलएमआर न्यूरॉन अन्य स्पर्श न्यूरॉन्स की तुलना में अधिक बार एक्सोफेरजेनेसिस से गुजरता है। स्पर्श न्यूरॉन्स से बहिर्पोफर संख्या का मात्रातुन इस प्रकार आमतौर पर एएलएमआर पर ध्यान केंद्रित करके स्थापित किया जाता है।
एक्सोफेरजेनेसिस एक गतिशील प्रक्रिया है जो आमतौर पर न्यूरोनल साइटोप्लाज्म(चित्रा 1ए-बी)की सूजन से शुरू होती है। सेलुलर सामग्री, ऑर्गेनेल्स, या प्रोटीन समुच्चय को न्यूरोनल सोमा के एक तरफ एकत्र किया जाता है, जो आमतौर पर एएलएमआर न्यूरॉन के पीछे के अंत (पेश न्यूराइट से दूर) की ओर होता है, जो प्री-एक्सोफेर डोमेन (पीईडी)(चित्रा 1B)बनाता है। शुरुआती फैलाव के रूप में PED बाहर परियोजना शुरू होता है, एक पहचानने योग्य फैला हुआ कली बनाने के रूप में मनाया जाता है । देर से कली को परिभाषित किया जाता है जब पूर्व-बहिर्पोफर डोमेन का व्यापक व्यास सोमा-एक्सोफर गर्दन(चित्रा 1C)के कसना के व्यास से लगभग 1/3 बड़ा होता है। एक्सोफर्स को सोमा से लगभग किसी भी दिशा में बाहर निकाला जा सकता है, लेकिन अधिकांश बहिर्मंडल कोशिका शरीर से पीछे से बाहर निकलते हैं और लगभग उसी फोकल प्लेन में उभरते सोमा के रूप में रहते हैं।
एक्सोफर प्रारंभिक सोमा से दूर जा सकता है क्योंकि कली की गर्दन एक पतली फिलामेंट में संकरी हो गई है। एक्सोफर इस फिलामेंट(चित्रा 1डी, तीर)के माध्यम से सोमा से जुड़े रह सकते हैं और बाद में अलग हो सकते हैं। कैल्शियम, समुच्चय और माइटोकॉन्ड्रिया जैसी सेलुलर सामग्री को इस फिलामेंट के माध्यम से संलग्न एक्सोफर 5 में स्थानांतरित किया जा सकता है, हालांकि एक्सट्रूडेड सामग्री का थोक बड़े पैमाने पर नवोदित घटना द्वारा एक्सोफर डिब्बे में डाल दियाजाताहै। एक्सोफर्स को परिपक्व माना जाता है जब कोई दृश्यमान कनेक्टिंग ट्यूब या पतला फिलामेंट नहीं होता है और एक्सोफर पूरी तरह से भेजने वालेसोमा (चित्रा 1E)से अलग हो जाता है।
सी एलिगेंस टच न्यूरॉन्स द्वारा उत्पादित एक्सोफर्स तुरंत हाइपोडर्मिस का सामना करते हैं, ऊतक जो स्पर्श न्यूरॉन को घेरे हुए हैं। सबसे अधिक, एक्सोफर वेसिकल पूंछ की ओर पीछे हाइपोडर्मिस के भीतर यात्रा करने के लिए प्रकट होता है, और असमा से काफी दूर हो सकता है इससे पहले कि एक्सोफर सामग्री गिरावट के लिए लक्षित दिखाई देती है (उदाहरण के लिए, दूरी सोमा(चित्रा 1F)से ~ 100 माइक्रोन दूर हो सकती है।) । फ्लोरोसेंट एक्सोफेर वेसिकल हाइपोडर्मिस के भीतर कई छोटे वेसिकल्स में टूट जाता है, जिसे “तारों से जड़ा हुआ रात”(चित्रा 1G और चित्रा 2)के रूप में संदर्भित किया जाता है। “तारों से जड़ा हुआ रात” चरण में, मूल एकांत बहिर्मंडल की तुलना में फ्लोरेसेंस के कई छोटे बिंदुओं में हाइपोडर्मल सिंक्यियम में स्पंदित फ्लोरोसेंट सामग्री को देखा जा सकता है। तारों से जड़ा रात कम आवर्धन के तहत पंचाट देख सकते है और उच्च आवर्धन के साथ, punctate और/ तारों से जड़ा रात का फ्लोरोसेंट संकेत आमतौर पर एक्सोफर और न्यूरोली व्यक्त फ्लोरेसेंस(चित्रा 2बी-सी)की तुलना में मंद होता है। कई पंचम वेसिकल्स में रीचेरी के फैलाव को हाइपोडर्मल सेल के एंडोसोमल/लाइसोसोमल नेटवर्क के साथ फागोसोम परिपक्वता और संलयन शामिल करने के लिए सोचा जाता है । कुछ बहिर्मुखी सामग्रियों की संभावना हाइपोडरमल lysosomal नेटवर्क में अपमानित कर रहे हैं, लेकिन अवशिष्ट प्रजातियों है कि गिरावट के लिए प्रतिरोधी है (जैसे mCherry समुच्चय) छद्म कोलोम, एक तरल पदार्थ के डिब्बे है कि सेलुलर मलबे को शामिल कर सकते है में hypodermis से बाहर फेंक दिया जाता है । फ्लोरोसेंट सामग्री को बाद में कोलोमोसाइट्स(चित्रा 2 सी)नामक दूरस्थ मेहतर कोशिकाओं द्वारा ली जाती है, जो ध्यान केंद्रित कर सकती है, स्टोर कर सकती है, और फिर से रीचेरी के क्षरण का प्रयास कर सकती है।
कुल निष्कासन और हस्तांतरण की घटना फिला में संरक्षित दिखाई देती है, सी एलिगेंस5,6, 7और डी मेलनोगेस्टर,8,,,7 9 के साथ-साथ कई स्तनधारी मॉडलों में आनुवंशिक मॉडलों में रिपोर्ट की गई है। स्तनधारी कोशिकाओं के लिए एक्सोफर जैसे एक्सट्रूज़न की सूचना दी गई है, एक अवलोकन जिसमें यह सुझाव दिया गया है किसंरक्षिततंत्र समग्र और ऑर्गेनेल निष्कासन को कम कर सकता है । एक्सोफ्रेड उत्पादन इस प्रकार सेलुलर मलबे प्रबंधन का एक संरक्षित तंत्र हो सकता है जो एक मौलिक, लेकिन पूर्व में गैर मान्यता प्राप्त, न्यूरोनल प्रोटेओस्टेसिस और माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण की शाखा है, जो असंतुलित होने पर, सक्रिय रूप से न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग में योगदान दे सकता है। मलबे भेदभाव और छंटाई में शामिल अणुओं की पहचान, एक अलग उपकोशिकीय स्थान के लिए परिवहन, निष्कासन, गठन/सोमा और देर से बहिर्पोफर को जोड़ने ट्यूबलर कनेक्शन की कैंची, और एक पड़ोसी सेल द्वारा दूरदराज के क्षरण के लिए बड़े बाहर वेसिकल की मांयता भविष्य के काम के लिए रहते हैं । शारीरिक संदर्भ में भाग लेने वाले अणुओं की पहचान करने के लिए इन मॉडलों द्वारा पेश किए गए निष्पक्ष आनुवंशिक दृष्टिकोणों और शक्तिशाली सेल जैविक उपकरणों का उपयोग करते हुए, समग्र और ऑर्गेनेल संग्रहण और हस्तांतरण के तंत्र को परिभाषित करने के लिए नेमाटोड और फ्लाई मॉडल में अध्ययन गंभीर रूप से महत्वपूर्ण होंगे।
एक्सोफर जीव विज्ञान में ऑपरेटिव तंत्र को समझने में महत्वपूर्ण पहले कदमों में वीवो एक्सोफर क्वांटिफिकेशन में प्रजनन योग्य के लिए प्रोटोकॉल को परिभाषित करना शामिल है। सी एलिगेंस मॉडल ऐसे प्रयासों के लिए एक विशेष लाभ प्रदान करता है क्योंकि शरीर पारदर्शी है और एक्सोफर्स को आसानी से देखा जा सकता है जब उनमें फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन या ऑर्गेनेल्स होते हैं। एक्सोफर्स को सी एलिगेंस डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स पीडीई और सीईपी, एएसई और एएसईआर संवेदी न्यूरॉन्स, और डाई-फिलिंग एम्फिड न्यूरॉन्स5द्वारा उत्पन्न होने की सूचना दी गई है । क्योंकि टच रिसेप्टर न्यूरॉन्स द्वारा उत्पादित एक्सोफर्स सबसे अच्छी विशेषता है, यहां ध्यान एक्सोफर विश्लेषण के लिए टच न्यूरॉन्स के उपयोग पर है। हालांकि बुनियादी दृष्टिकोण किसी भी सेल से बहिर्पोफर उत्पादन को मापने के लिए लागू किया जा सकता है। सी एलिगेंस टच रिसेप्टर न्यूरॉन्स द्वारा उत्पादित एक्सोफर्स का पता लगाने और क्वांटिटेट करने के लिए प्रोटोकॉल जो ट्रांसजेनिक रूप से रीचेरी प्रोटीन को व्यक्त करते हैं, कार्गो पर जोर देने के साथ रेखांकित किए जाते हैं जिन्हें स्कोरिंग में निगरानी और अस्थायी बाधाओं पर जोर दिया जा सकता है। यह लेख वीवो एक्सोफर पहचान की ओर दृष्टिकोण को परिभाषित करता है, और पर्यावरण और आनुवंशिक स्थितियों का मात्रा, जो बहिर्मंडल उत्पादन को संशोधित करता है। प्रोटोकॉल बेसलाइन एक्सोफर उत्पादन के निर्धारण के लिए और जीनोटाइप में तुलना के लिए लगातार गैर-तनाव की स्थिति पर महत्वपूर्ण ध्यान देने पर जोर देते हैं।
बड़े एक्सोफर्स के रूप में कुल और ऑर्गेनेल उन्मूलन के वीवो आणविक तंत्र में का लक्षण वर्णन इसकी प्रारंभिक अवस्था में है। निष्कासन के लिए कार्गो के पदनाम के रूप में प्रश्न, सेल के भीतर इन कार्गो का ध्रुवीकृत संग्रह, एक्सोफर्स उत्पन्न करने के निर्णय का विनियमन, एक्सट्रूज़न मध्यस्थता करने वाली मशीनरी, और पड़ोसी सेल में डिग्रेडिव मशीनरी के साथ एक्सोफर्स की बातचीत सभी को संबोधित किया जाना बाकी है। इसके अलावा, ट्यूबलर कनेक्शन के वीवो विज़ुअलाइज़ेशन में जो जैविक सामग्रियों को पारित कर सकते हैं जिसमें कैल्शियम, समुच्चय और माइटोकॉन्ड्रिया शामिल हैं, अपने आप में दिलचस्प और कम अध्ययन किए गए जीव विज्ञान हैं। क्यों कुछ कोशिकाओं को और अधिक दूसरों की तुलना में उत्पादन बहिर्पोफर के लिए प्रवण है के सवाल भी अनसुलझे हैं, लेकिन आनुवंशिक रूप से इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित दृष्टिकोण के साथ विच्छेदित किया जा शुरू कर सकते हैं ।
इस प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णित एक्सोफर उत्पादन के प्रजनन योग्य स्कोरिंग को प्राप्त करने के दृष्टिकोण हैं, पास के सेल सोमास से एक्सोफर्स को अलग करने पर ध्यान देने के साथ, एक्सोफर उत्पादन के शिखर पर कब्जा करने के लिए विश्लेषण का समय, और अनपेक्षित तनावों को खत्म करने के लिए विकास की स्थिति का सख्त नियंत्रण जो एक्सोफेर स्तरों को संशोधित कर सकता है। बड़े शुरुआती एक्सोफर के दोनों अंतर, या आसपास के हाइपोडर्मिस में “तारों से रात’ फैलाव को एक्सोफर उत्पादन के सबूत के रूप में विस्तृत किया जा सकता है। यह कहा जा रहा है, बेसल स्थितियों के तहत mCherry व्यक्त न्यूरॉन्स सबसे अधिक बार एक विशिष्ट प्रकार के न्यूरॉन्स के 5-25% के साथ जुड़े रहे है एक बहिर्पोफर उत्पादन । तनाव की स्थिति का नियंत्रित परिचय एक्सोफर उत्पादन को बढ़ाने के लिए लागू किया जा सकता है, जो एक्सट्रूस का उत्पादन करने वाले 90% न्यूरॉन्स का पता लगाने के लिए है, विशेष रूप से संशोधक के लिए आनुवंशिक या औषधीय स्क्रीन के लिए उपयोगी है।
मानव न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग में, बड़े समुच्चय रोगी न्यूरॉन्स से पड़ोसी कोशिकाओं में स्थानांतरित कर सकते हैं ताकि विकृति फैल को बढ़ावा दिया जा सके। एक्सोफर तंत्र फिला में कुल निष्कासन के लिए उपयोग किए जाने वाले संरक्षित तंत्र के माध्यम से मालूम हो सकता है। वीवो अणुओं में परिभाषित करना जो या तो इस प्रक्रिया की दक्षता को बढ़ाते हैं (जिसे अधिक प्रभावी प्रोटेओस्टेसिस नियंत्रण माना जाता है) या ब्लॉक इसे कई न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों का मुकाबला करने के लिए उपन्यास रणनीतियों के डिजाइन को प्रभावित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जैसे, यहां वर्णित प्रोटोकॉल शास्त्रीय आनुवंशिक म्यूटेनेसिस स्क्रीन, जीनोम-वाइड आरएनएआई स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो व्यवस्थित रूप से एन्जेवर और दमन की पहचान करने के लिए जीन को नीचे गिराते हैं, या दवा हस्तक्षेप अध्ययन के लिए जो इस प्रक्रिया के उम्मीदवार औषधीय संशोधकों की पहचान करते हैं। दृष्टिकोण सीधा है, हालांकि कुछ हद तक श्रमसाध्य है। एक्सोफर्स इतने बड़े हैं कि उन्हें एक उच्च आवर्धन विच्छेदन माइक्रोस्कोप के साथ देखा जा सकता है। फिर भी, सी एलिगेंस न्यूरॉन्स अपेक्षाकृत छोटे होते हैं और उनके ऑर्गेनेल्स को देखते हैं या उनकी झिल्ली को उच्च शक्ति कॉन्फोकल छवियों की आवश्यकता होती है और यह एक धीमी प्रक्रिया है। उच्च थ्रूपुट के विकल्पों में बहु-वेल प्लेट प्रारूप में उच्च सामग्री इमेजिंग दृष्टिकोण शामिल हो सकते हैं।
स्कोरिंग को एक्सोफर करने के लिए एक मानकीकृत दृष्टिकोण के आवेदन को उस प्रक्रिया के एक ठोस आनुवंशिक विच्छेदन को रेखांकित करना चाहिए जिसके द्वारा न्यूरॉन्स सेलुलर मलबे को व्यवस्थित और खत्म कर सकते हैं।
The authors have nothing to disclose.
हम निम्नलिखित NIH अनुदान स्वीकार करते हैं: R01AG047101 और R37AG56510. ड्रिस्कोल और ग्रांट लैब्स के सदस्यों ने कठोर प्रयोगों और मजबूत संचार के साथ वर्णित प्रोटोकॉल के विकास और ठीक ट्यूनिंग में बड़े पैमाने पर योगदान दिया है।
95B Scientific CMOS camera | Photometrics Prime | ||
1,000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
9 cm sterile Petri dishes | Fisher Scientific | 11309283 | |
absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
cholesterol | Acros | 110190250 | |
dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
E. coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
FBS10 Standard microscope | Meyer Instruments | KSC 410-1-100-1 | FBS10 Standard with Plate Base, 100/100 Trinocular Head and Flip zoom |
glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
LDI – Laser Diode Illuminator | 89 North | ||
levamisole | Sigma Aldrich | 16595-80-5 | |
M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
Polystyrene microbeads | Sigma Aldrich | MFCD00131491 | |
RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
Reusable ringed cytology slides | ThermoFisher Scientific | 22037242 | |
SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP] | contract Driscoll lab | GFP expressed in touch neurons | |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
Triton-X | Thermofisher scientific | 28313 | |
Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
X-Light V2 Spinning Disk Confocal Unit | CrestOptics | ||
ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] | contract Driscoll lab | mCherry expressed in touch neurons | |
ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+] | contract Driscoll lab | Q128 expressed in touch neurons | |
ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP] | contract Driscoll lab | mitoROGFP expressed in touch neurons | |
ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP] | contract Driscoll lab | autophagy marker expressed in touch neurons | |
ZEISS Axio Vert.A1 | Zeiss |