Denne protokol beskriver metoder til påvisning og kvantisering af store aggregerede og/eller organelle ekstruderinger (~4 μm), der produceres af C. elegans celler i form af membranbundne exfoner. Vi beskriver stammer, vækstbetingelser, scoringskriterier, timing og mikroskopi overvejelser, der er nødvendige for at lette dissektion af denne debris udvisning mekanisme.
Toksicitet af misfolded proteiner og mitokondriel dysfunktion er afgørende faktorer, der fremmer aldersrelaterede funktionelle neuronal tilbagegang og neurodegenerative sygdomme på tværs af arter. Selv om disse neurotoksiske udfordringer længe har været anset for at være celle-iboende, betydelige beviser understøtter nu, at fejlfoldede humane sygdomsproteiner med oprindelse i en neuron kan forekomme i tilstødende celler, et fænomen foreslået at fremme patologi spredes i menneskelige neurodegenerative sygdomme.
C. elegans voksne neuroner, der udtrykker aggregering proteiner kan ekstrudere store (~ 4 μm) membran-omgivet vesikler, der kan omfatte den aggregerede protein, mitokondrier, og lysosomer. Disse store vesikler kaldes “exophers” og adskiller sig fra exosomer (som er omkring 100x mindre og har forskellige biogenese). Smide ud cellulære vragrester i exophers kan forekomme ved en bevaret mekanisme, der udgør en grundlæggende, men tidligere ukendt, gren af neuronal proteostase og mitokondriel kvalitetskontrol, der er relevante for processer, som aggregater spredes i menneskelige neurodegenerative sygdomme.
Mens exophers er for det meste undersøgt i dyr, der udtrykker høj kopi transgene mCherry inden touch neuroner, disse protokoller er lige så nyttige i studiet af exophergenesis ved hjælp af fluorescerende mærkede organeller eller andre proteiner af interesse i forskellige klasser af neuroner.
Beskrevet her er de fysiske træk ved C. elegans exophers, strategier for deres påvisning, identifikationskriterier, optimal timing for kvantificering, og dyr vækst protokoller, der styrer for understreger, der kan modulere exopher produktionsniveauer. Sammen bør detaljer om protokoller, der er skitseret her, tjene til at fastsætte en standard for kvantitativ analyse af exophers på tværs af laboratorier. Dette dokument har til formål at tjene som en ressource på området for laboratorier, der søger at udarbejde molekylære mekanismer, som exophers produceres, og som exophers reageres på af tilstødende og fjerne celler.
De neurotoksiske udfordringer af aggregater og dysfunktionelle mitokondrier har længe været anset for at være celle-iboende, men for nylig er det blevet klart, at misfolded human sygdom proteiner med oprindelse i en neuron kan også sprede sig til tilstødende celler, fremme patologi1. Ligeledes kan pattedyr mitokondrier sendes ud af cellen af deres oprindelige produktion til transcellulærnedbrydning 2 eller til redning af mitokondrielle populationer i udfordrede tilstødendeceller 3. Vesicles i forskellige størrelser er generelt blevet observeret for at overføre cellulære materialer til tilstødende celler eller til flydende omgivelser4. Nogle ekstruderede vesikler tilgang størrelsen af den gennemsnitlige neuronal soma (gennemsnitlig touch neuron soma ~ 6 μm) og kan rumme store aggregater og organeller.
Et slående eksempel på stor vesicle ekstrudering, der kan bære protein aggregater og organeller forekommer i C. elegans touch receptor neuroner, der udtrykker en høj kopi nummer reporter konstruere kodning en skadelig sammenlægning-tilbøjelige, nedbrydning-resistente mCherry5. Ekstruderinger fra touch neuroner, kaldet exophers, er ~ 4 μm gennemsnitlig diameter, selektivt omfatter mCherry eller andre aggregater, og leveres direkte ind i den nærliggende hypodermis, som normalt omgiver touch receptor neuroner. Hypodermis forsøg lysosom-baseret nedbrydning, men nogle ikke-fordøjelige indhold såsom mCherry aggregater kan re-ekstruderes af hypodermis i væskefyldte pseudocoelom af dyret, hvorfra mCherry kan tages op af fjerntliggende skyllevæske celler kaldet coelomocytes til langtidsopbevaring (Figur 1, Figur 2)5.
De store ekstruderede exopher vesicles forlade cellen omgivet af touch receptor plasma membran og kan indeholde aggregerede humane sygdom proteiner, mitokondrier, og lysosomer. Processen med exopher produktion synes at indebære sortering af potentielt giftige arter (for eksempel en sammenlægning-tilbøjelige udtrykt mCherry er adskilt fra opløselige, inoffensive proteiner som GFP, der forbliver for det meste i neuronal soma). På denne måde, rettet udvisning af de truende enheder opnås ved neuron5. En proteostase udfordring, såsom stress induceret af autofagi knockdown, MG132-medieret afledningshæmmer, eller transgene udtryk for humane sygdomme proteiner såsom Huntingtons Sygdom-associerede ekspanderet polyglutamin Q128 eller Alzheimers sygdom-impliceret fragment Aβ1-42, kan øge antallet af neuroner, der producerer exophers5.
Som exophers er først for nylig blevet dokumenteret, hvad der er kendt af deres biologi fortjener beskrivelse. Exophers blev opdaget i, og er de mest godt undersøgt i, C. elegans touch receptor neuroner. Der er seks C. elegans mechanosensory touch neuroner, der har celle organer fordelt rundt i kroppen (Figur 3A) og kaldes mikrotubule celler, fordi deres ultrastruktur har karakteristiske 15 protofilament mikrotubuli. Touch receptor neuroner er den forreste AVM (forreste ventrale microtubule neuron), ALMR, og ALML (forreste laterale mikrotubule neuroner højre og venstre), jo mere centrale PVM (posterior ventral microtubule neuron), og den bageste PLMR og PLML (posterior lateral microtubule neuroner højre og venstre) i halen. Interessant, de seks touch receptor neuroner producere exophers på forskellige satser, på trods af at udtrykke den samme offensive transgene (Figur 3C). Af de seks mechanosensory touch receptor neuroner, ALMR neuron gennemgår exophergenesis oftere end de andre touch neuroner. Kvantisering af exopher numre fra touch neuroner er således normalt etableret ved at fokusere på ALMR.
Exophergenesis er en dynamisk proces, der typisk begynder med hævelse af neuronal cytoplasma (Figur 1A-B). Cellulære indhold, organeller, eller protein aggregater er indsamlet til den ene side af neuronal soma, oftest mod den bageste ende af ALMR neuron (væk fra den fremskkrivende neurite), danner en præ-exopher domæne (PED) (Figur 1B). Den tidlige fremspring er observeret som PED begynder at projektet udad, danner en genkendelig fremspringende opløbet opløbet. Den sene knop defineres, når den bredeste diameter af præ-exopher domæne er ca 1/3 større end diameteren af konstriktionen af soma-exopher hals (Figur 1C). Exophers kan skubbes ud i næsten alle retninger fra soma, men de fleste exophers exit posteriort fra cellen kroppen og forblive i omtrent samme brændpunkt plan som den oprindelige soma.
Exopher kan bevæge sig væk fra den oprindelige soma som halsen af opløbet indsnævres til en tynd glødetråd. Exophers kan forblive fastgjort til soma via denne glødetråd (Figur 1D, pil) og kan senere blive løsrevet. Cellulære indhold såsom calcium, aggregater, og mitokondrier kan overføres via denne glødetråd i den vedhæftede exopher5, selv om hovedparten af ekstruderet materiale er sat i exopher rummet ved den massive spirende begivenhed. Exophers betragtes som modne, når der ikke er synligt forbindelsesrør eller tynd glødetråd, og exopher er helt adskilt fra sende soma (Figur 1E).
Exophers produceret af C. elegans touch neuroner straks støder på hypodermis, det væv, der omgiver touch neuron. Mest almindeligt, exopher vesicle synes at rejse inden for hypodermis posteriort mod halen, og kan være temmelig fjernt fra soma før exopher indhold synes målrettet til nedbrydning (for eksempel kan afstanden være ~ 100 μm væk fra soma (Figur 1F)). Den fluorescerende exopher vesicle bryder op i mange mindre vesicles i hypodermis, idet der på en udseende benævnt “stjerneklar nat” (Figur 1G og Figur 2). I “stjerneklar nat” fase, punktformig fluorescerende materiale kan observeres spredt over hypodermal syncytium i mange mindre punkter af fluorescens i forhold til den oprindelige ensomme exopher. Stjerneklar nat kan se punktformig under lav forstørrelse og med højere forstørrelse, kan se punktlig og / eller netværksforbundet inden for hypodermis. Den fluorescerende signal af stjerneklar nat er typisk lysdæmper end exopher og neuronally udtrykt fluorescens (Figur 2B-C). Spredningen af mCherry i mange punktformige vesikler menes at involvere fagagosom modning og fusion med den ensomale / lysosomal netværk af hypodermal celle. Nogle exopher materialer er sandsynligvis nedbrudt i hypodermal lysosomal netværk, men resterende arter, der er resistente over for nedbrydning (såsom mCherry aggregater) er smidt ud af hypodermis i pseudocoelom, en væske rum, der kan indeholde cellulære vragrester. Fluorescerende materiale er senere taget i af fjerntliggende skyllevæske celler kaldet coelomocytter (Figur 2C), som kan koncentrere, gemme, og igen forsøge nedbrydning af mCherry.
Fænomenet aggregat ekstrudering og overførsel synes bevaret på tværs af phyla, der er blevet rapporteret i genetiske modeller som C. elegans5,,6,7 og D. melanogaster8,9 samt i flere pattedyr modeller. Exopher-lignende ekstruderinger er blevet rapporteret for pattedyrceller 10, en observation tyder på, at bevarede mekanismer kan ligge til grund for aggregeret og organelle udvisning. Exopher produktion kan således være en bevaret mekanisme cellulære vragrester forvaltning, der udgør en grundlæggende, men tidligere ukendt, gren af neuronal proteostase og mitokondriel kvalitetskontrol, som, når ubalanceret, kan aktivt bidrage til neurodegenerative sygdom. Identifikation af de molekyler, der er involveret i snavs diskrimination og sortering, transport til en særskilt subcellulær lokalitet, ekstrudering, dannelse / scission af rørformede forbindelse forbinder soma og sen exopher, og anerkendelse af den store ekstruderet vesicle for fjernforringelse af en tilstødende celle forbliver til fremtidigt arbejde. Undersøgelser i nematode- og fluemodeller vil være af afgørende betydning for at definere mekanismer for indsamling og overførsel af organiske tog, ved hjælp af upartiske genetiske tilgange og kraftfulde cellebiologiske værktøjer, der tilbydes af disse modeller til at identificere deltagende molekyler i fysiologisk sammenhæng.
Kritiske første skridt i dechifrering mekanismer operative i exopher biologi indebærer at definere protokoller for reproducerbare in vivo exopher kvantificering. C. elegans-modellen giver en særlig fordel for en sådan indsats, da kroppen er gennemsigtig, og exophers let kan observeres, når de indeholder fluorescerende mærkede proteiner eller organeller. Exophers er blevet rapporteret til at blive genereret af C. elegans dopaminerge neuroner PDE og CEP, ASE og ASER sensoriske neuroner, og farvestof-påfyldning amphid neuroner5. Fordi exophers produceret af touch receptor neuroner er bedst karakteriseret, fokus her er på brugen af touch neuroner til exopher analyse. Men den grundlæggende tilgang kan anvendes til at måle exopher produktion fra enhver celle. Protokoller til påvisning og kvantisere exophers produceret af C. elegans touch receptor neuroner, der transgenically udtrykke mCherry protein er skitseret, med vægt på laster, der kan overvåges og tidsmæssige begrænsninger i scoring. Denne artikel definerer tilgange til in vivo exopher identifikation, og mængden af miljømæssige og genetiske tilstande, der modulerer exopher produktion. Protokollerne lægger vægt på kritisk opmærksomhed på konstante ikke-stress betingelser for bestemmelse af baseline exopher produktion og for sammenligninger på tværs af genotyper.
Karakteriseringen af in vivo molekylære mekanismer af aggregat og organelle elimination i form af store exophers er i sin vorden. Spørgsmål med hensyn til udpegning af laster til udvisning, den polariserede samling af disse laster i cellen, regulering af beslutningen om at generere exophers, de maskiner, der formidler ekstruderinger, og samspillet mellem eksophers med de nedbrydende maskiner i en nærliggende celle alle mangler at blive behandlet. Desuden in vivo visualisering af rørformede forbindelser, der kan passere biologiske materialer, der omfatter calcium, aggregater, og mitokondrier er interessant og understudy biologi i sig selv. Spørgsmål om, hvorfor visse celler er mere tilbøjelige til at exopher produktion end andre også er uløste, men kan begynde at være genetisk dissekeret med de tilgange, der er skitseret i denne protokol.
Beskrevet i detaljer i denne protokol er tilgange til at opnå reproducerbar scoring af exopher produktion, med vægt på at skelne exophers fra nærliggende celle somas, timing af analyser til at fange toppen af exopher produktion, og streng kontrol af vækstbetingelser for at fjerne utilsigtede belastninger, der kan modulere exopher niveauer. Både sondringen mellem den store tidlige exopher, eller “stjerneklar nat’ dispersion i de omkringliggende hypodermis kan kvanteres som bevis for exopher produktion. Når det er sagt, neuroner udtrykker mCherry under basale forhold er oftest forbundet med 5-25% af neuroner af en bestemt type producerer en exopher. Kontrolleret indførelse af stressbetingelser kan anvendes til at øge exopher produktion til påvisning så højt som 90% af neuroner producerer ekstruderinger, især nyttige for genetiske eller farmakologiske skærme for modifikatorer.
I human neurodegenerative sygdom, store aggregater kan overføre fra syge neuroner til tilstødende celler til at fremme patologi spredning. Exopher mekanisme kan svede via en bevaret mekanisme, der anvendes til samlet ekstrudering på tværs af phyla. Definition af in vivo molekyler, der enten øge effektiviteten af denne proces (betragtes som mere effektiv proteostase kontrol) eller blokere det kan udnyttes til at påvirke udformningen af nye strategier til bekæmpelse af flere neurodegenerative sygdomme. Som sådan, den protokol, der er beskrevet her kunne bruges til klassiske genetiske mutagenesis skærme, genom-dækkende RNAi skærme, der systematisk vælte gener til at identificere smagsforstærkere og suppressorer, eller for narkotika intervention undersøgelser, der identificerer kandidat farmakologiske modifikatorer af denne proces. Tilgangen er ligetil, men noget besværlig. Exophers er så store, at de kan ses med en høj forstørrelse dissekere mikroskop. Stadig, C. elegans neuroner er relativt små og ser på deres organeller eller deres membraner kræver højere effekt konfokale billeder og er en langsom proces. Muligheder for højere overførselshastighed kan indebære billeddannelse i højt indhold i flertjæt pladeformat.
Anvendelsen af en standardiseret tilgang til exopher scoring bør ligge til grund for en samordnet genetisk dissektion af den proces, hvorigennem neuroner kan organisere og fjerne cellulære vragrester.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender følgende NIH tilskud: R01AG047101 og R37AG56510. Medlemmer af Driscoll og Grant labs har bidraget i udstrakt grad til udvikling og finjustering af beskrevne protokoller, med strenge eksperimenter og stærk kommunikation.
95B Scientific CMOS camera | Photometrics Prime | ||
1,000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
9 cm sterile Petri dishes | Fisher Scientific | 11309283 | |
absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
cholesterol | Acros | 110190250 | |
dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
E. coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
FBS10 Standard microscope | Meyer Instruments | KSC 410-1-100-1 | FBS10 Standard with Plate Base, 100/100 Trinocular Head and Flip zoom |
glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
LDI – Laser Diode Illuminator | 89 North | ||
levamisole | Sigma Aldrich | 16595-80-5 | |
M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
Polystyrene microbeads | Sigma Aldrich | MFCD00131491 | |
RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
Reusable ringed cytology slides | ThermoFisher Scientific | 22037242 | |
SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP] | contract Driscoll lab | GFP expressed in touch neurons | |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
Triton-X | Thermofisher scientific | 28313 | |
Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
X-Light V2 Spinning Disk Confocal Unit | CrestOptics | ||
ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] | contract Driscoll lab | mCherry expressed in touch neurons | |
ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+] | contract Driscoll lab | Q128 expressed in touch neurons | |
ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP] | contract Driscoll lab | mitoROGFP expressed in touch neurons | |
ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP] | contract Driscoll lab | autophagy marker expressed in touch neurons | |
ZEISS Axio Vert.A1 | Zeiss |