Denne protokollen beskriver tilnærminger for deteksjon og kvantisering av store aggregater og/eller organelleprofiler (~4 μm) produsert av C. elegans celler i form av membranbundne eksfoster. Vi beskriver stammer, vekstforhold, scoringskriterier, timing og mikroskopihensyn som trengs for å lette disseksjon av denne utvisningsmekanismen for rusk.
Toksisitet av feilfoldet proteiner og mitokondriedysfunksjon er avgjørende faktorer som fremmer aldersrelatert funksjonell nevronal nedgang og nevrodegenerativ sykdom på tvers av arter. Selv om disse nevrotoksiske utfordringene lenge har vært ansett å være celle-iboende, støtter betydelige bevis nå at feilfoldede humane sykdomsproteiner med opprinnelse i ett nevron kan vises i nærliggende celler, et fenomen foreslått å fremme patologi spredt i menneskelig nevrodegenerativ sykdom.
C. elegans voksne nevroner som uttrykker aggregering proteiner kan ekstrudere store (~ 4 μm) membran-omgitt vesikler som kan inkludere aggregerte protein, mitokondrier, og lysosomer. Disse store vesikler kalles “exophers” og er forskjellig fra eksosomer (som er ca 100x mindre og har forskjellig biogenese). Kaste ut cellulære rusk i eksofer kan oppstå ved en bevart mekanisme som utgjør en grunnleggende, men tidligere ukjent, gren av nevronal proteostase og mitokondrie kvalitetskontroll, relevant for prosesser der aggregater spredt i menneskelige nevrodegenerative sykdommer.
Mens exophers har blitt for det meste studert hos dyr som uttrykker høy kopi transgen mCherry innen berøring nevroner, disse protokollene er like nyttig i studiet av exophergenesis ved hjelp fluorescerende merket organeller eller andre proteiner av interesse i ulike klasser av nevroner.
Beskrevet her er de fysiske funksjonene i C. elegans exophers, strategier for deres deteksjon, identifikasjonskriterier, optimal timing for kvantifisering, og dyr vekst protokoller som kontrollerer for påkjenninger som kan modulere exopher produksjonsnivåer. Sammen bør detaljer om protokoller skissert her tjene til å etablere en standard for kvantitativ analyse av eksfosere på tvers av laboratorier. Dette dokumentet søker å tjene som en ressurs i feltet for laboratorier som søker å utarbeide molekylære mekanismer der eksfosere produseres og som eksfosere reageres på av nærliggende og fjerne celler.
De nevrotoksiske utfordringene til aggregater og dysfunksjonelle mitokondrier har lenge vært ansett å være celleinboende, men mer nylig har det blitt klart at feilfoldede humane sykdomsproteiner med opprinnelse i ett nevron også kan spre seg til nærliggende celler, og fremme patologi1. På samme måte kan pattedyr mitokondrier sendes ut av cellen i sin opprinnelige produksjon for transcellulær nedbrytning2 eller for redning av mitokondriepopulasjoner i utfordrede naboceller3. Vesikler av ulike størrelser har generelt blitt observert for å overføre cellulære materialer til nærliggende celler eller til flytende omgivelser4. Noen ekstruderte vesikler nærmer seg størrelsen på den gjennomsnittlige nevronale soma (gjennomsnittlig berøring neuron soma ~ 6 μm) og kan romme store aggregater og organeller.
Et slående eksempel på stor vesikkelekstrudering som kan bære proteinaggregater og organeller forekommer i C. elegans berøringsreseptornevroner som uttrykker en høy kopi nummer reporter konstruere koding en skadelig aggregering-utsatt, nedbrytningsresistent mCherry5. Profiler fra berøringsnevronene, kalt eksfoster, er ~ 4 μm gjennomsnittlig diameter, selektivt inkluderer mCherry eller andre aggregater, og leveres direkte inn i de nærliggende hypodermis, som normalt omgir berøringsreseptornevronene. Hypodermis forsøker lysosombasert nedbrytning, men noe ikke-fordøyelig innhold som mCherry aggregater kan ekstruderes av hypodermis inn i den væskefylte pseudocoelom av dyret, hvorfra mCherry kan tas opp av eksterne scavenger celler kalt koelomocytter for langsiktig lagring (Figur 1, Figur 2)5.
De store ekstruderte eksofag vesikler forlater cellen omgitt av berøringsreseptorplasmamembran og kan inneholde aggregerte humane sykdomsproteiner, mitokondrier og lysosomer. Prosessen med exopher produksjon synes å innebære sortering av potensielt giftige arter (for eksempel en aggregering-utsatt uttrykt mCherry er segregert fra løselige, uoffensive proteiner som GFP som forblir hovedsakelig i nevronal soma). På denne måten oppnås rettet utvisning av de truende enhetene av nevronen5. En proteostase utfordring, som stress indusert av autofagi knockdown, MG132-mediert proteasom hemming, eller transgenuttrykk av humane sykdomsproteiner som Huntington sykdom-assosiert utvidet polyglutamin Q128 eller Alzheimers sykdom-implisert fragment Aβ1-42, kan øke antall nevroner som produserer exophers5.
Som exophers har bare nylig blitt dokumentert, det som er kjent om deres biologi fortjener beskrivelse. Exophers ble oppdaget i, og er de mest godt studert i, C. elegans berøre reseptor nevroner. Det er seks C. elegans mechanosensory touch nevroner som har cellelegemer fordelt rundt kroppen (Figur 3A) og kalles mikrotubuli celler fordi deres ultrastruktur har karakteristiske 15 protofilament mikrotubuli. Berøringsreseptornevronene er de fremre AVM (fremre ventral mikrotubulinevron), ALMR og ALML (fremre laterale mikrotubulenevroner høyre og venstre), de mer sentrale PVM (bakre ventral mikrotubule neuron), og bakre PLMR og PLML (bakre laterale mikrotubule nevroner høyre og venstre) i halen. Interessant, de seks touch reseptor nevroner produsere exophers til forskjellige priser, til tross for å uttrykke samme støtende transgene (Figur 3C). Av de seks mechanosensoriske berøringsreseptornevronene gjennomgår ALMR-nevronen eksofergenese oftere enn de andre berøringsnevronene. Kvantitet av exopher tall fra berøring nevroner er dermed vanligvis etablert ved å fokusere på ALMR.
Exophergenesis er en dynamisk prosess som vanligvis begynner med hevelse i nevronal cytoplasma (Figur 1A-B). Cellulært innhold, organeller eller proteinaggregater samles til den ene siden av den nevronale soma, oftest mot den bakre enden av ALMR-nevronen (vekk fra den projiserende neuritt), danner et pre-exopher domene (PED) (Figur 1B). Den tidlige fremspringet observeres når PED begynner å projisere utover, og danner en gjenkjennelig utstående knopp. Den sene knoppen defineres når den bredeste diameteren til pre-exopher-domenet er ca. 1/3 større enn diameteren på innsnevringen av soma-exopher-halsen (figur 1C). Exophers kan kastes ut i nesten hvilken som helst retning fra soma, men de fleste exophers utgang bakre fra cellekroppen og forblir i omtrent samme fokalplan som den opprinnelige soma.
Eksopher kan bevege seg bort fra den opprinnelige soma som halsen på knoppen smalner inn i en tynn filament. Exophers kan forbli festet til soma via denne filament (Figur 1D, pil) og kan senere bli løsrevet. Cellulært innhold som kalsium, aggregater og mitokondrier kan overføres via denne filamentet til den vedlagte eksopher5, selv om hoveddelen av ekstrudert materiale settes inn i eksofagrommet av den massive spirende hendelsen. Exophers anses modne når det ikke er synlig tilkoblingsrør eller tynn filament og eksopher er helt atskilt fra sending soma (figur 1E).
Exophers produsert av C. elegans berøre nevroner umiddelbart møte hypodermis, vevet som omgir touch neuron. Oftest ser eksopher vesicle ut til å reise innenfor hypodermis bakre bakre mot halen, og kan være ganske fjernt fra soma før exopher innholdet vises målrettet for nedbrytning (for eksempel kan avstanden være ~ 100 μm bort fra soma (Figur 1F)). Den fluorescerende exopher vesicle bryter opp i mange mindre vesikler i hypodermis, tar på seg et utseende referert til som “stjerneklar natt” (Figur 1G og figur 2). I “stjerneklar natt” scenen, punktat fluorescerende materiale kan observeres spredt over hypodermal syncytium i mange mindre punkter av fluorescens i forhold til den opprinnelige ensomme exopher. Starry natt kan se punktat under lav forstørrelse og med høyere forstørrelse, kan se punktat og / eller nettverk i hypodermis. Det fluorescerende signalet fra stjernenatten er vanligvis dimmer enn eksopher og neuronally uttrykt fluorescens (Figur 2B-C). Spredningen av mCherry i mange punktat vesikler antas å innebære phagosome modning og fusjon med endosomal / lysosomalt nettverk av hypodermal celle. Noen eksofagmaterialer er sannsynligvis degradert i hypodermal lysosomalt nettverk, men gjenværende arter som er motstandsdyktige mot nedbrytning (for eksempel mCherry aggregater) kastes ut av hypodermis inn i pseudocoelom, et flytende rom som kan inneholde cellulært rusk. Det fluorescerende materialet blir senere tatt inn av eksterne scavenger celler kalt koelomocytter (Figur 2C), som kan konsentrere seg, lagre, og igjen forsøke nedbrytning av mCherry.
Fenomenet aggregert ekstrudering og overføring vises bevart over phyla, etter å ha blitt rapportert i genetiske modeller som C. elegans5,,6,,7 og D. melanogaster8,9 samt i flere pattedyr modeller. Eksoferlignende profiler er rapportert for pattedyrceller10, en observasjon som tyder på at konserverte mekanismer kan være til grunn for aggregert og organelle utvisning. Exopher produksjon kan dermed være en konservert mekanisme for cellulær rusk ledelse som utgjør en grunnleggende, men tidligere ukjent, gren av nevronal proteostase og mitokondrie kvalitetskontroll, som, når ubalansert, kan aktivt bidra til nevrodegenerativ sykdom. Identifisering av molekylene som er involvert i rusk diskriminering og sortering, transport til en distinkt subcellulær lokalitet, ekstrudering, dannelse / scission av den rørformede forbindelsen som forbinder soma og sen eksopher, og anerkjennelse av den store ekstruderte vesikkelen for ekstern nedbrytning av en nærliggende celle forblir for fremtidig arbeid. Studier på nematode- og flymodeller vil være kritisk viktige for å definere mekanismer for aggregert og organellsamling og overføring, ved hjelp av objektive genetiske tilnærminger og kraftige cellebiologiske verktøy som tilbys av disse modellene for å identifisere deltakende molekyler i fysiologisk sammenheng.
Kritiske første skritt i dechiffrere mekanismer operative i exopher biologi innebærer definere protokoller for reproduserbar in vivo exopher kvantifisering. C. elegans modellen gir en spesiell fordel for slike anstrengelser siden kroppen er gjennomsiktig og exophers kan lett observeres når de inneholder fluorescerende merkede proteiner eller organeller. Exophers har blitt rapportert å være generert av C. elegans dopaminerge nevroner PDE og CEP, ASE og ASER sensoriske nevroner, og fargestoff-fylling amphid nevroner5. Fordi eksfoser produsert av berøringsreseptornevroner er best preget, er fokuset her på bruk av berøringsnevroner for exopher-analyse. Men den grunnleggende tilnærmingen kan brukes til å måle exopher produksjon fra en hvilken som helst celle. Protokoller for å oppdage og kvantate exophers produsert av C. elegans berøring reseptor nevroner som transgent uttrykke mCherry protein er skissert, med vekt på last som kan overvåkes og timelige begrensninger i scoring. Denne artikkelen definerer tilnærminger mot in vivo exopher identifikasjon, og kvantifisering av miljømessige og genetiske forhold som modulerer exopher produksjon. Protokoller legger vekt på kritisk oppmerksomhet til konstante ikke-stressforhold for fastsettelse av baseline exopher produksjon og for sammenligninger på tvers av genotyper.
Karakteriseringen av in vivo molekylære mekanismer for aggregert og organelle eliminering i form av store eksfosere er i sin barndom. Spørsmål om betegnelsen av last for utvisning, polarisert samling av disse lastene i cellen, reguleringen av beslutningen om å generere eksfoster, maskineriet som formidler profiler, og samspillet mellom eksfosere med det nedbrytbare maskineriet i en nærliggende celle gjenstår å bli adressert. Videre er in vivo visualisering av rørformede forbindelser som kan passere biologiske materialer som inkluderer kalsium, aggregater og mitokondrier interessant og understudert biologi i seg selv. Spørsmål om hvorfor visse celler er mer utsatt for exopher produksjon enn andre også er uløst, men kan begynne å bli genetisk dissekert med tilnærmingene skissert i denne protokollen.
Beskrevet i detalj i denne protokollen er tilnærmingene til å oppnå reproduserbar scoring av exopher produksjon, med fokus på å skille exophers fra nærliggende celle somas, tidspunktet for analyser for å fange toppen av exopher produksjon, og streng kontroll over vekstforhold for å eliminere utilsiktede påkjenninger som kan modulere exopher nivåer. Både skillet mellom den store tidlige eksopher, eller “stjerneklar natt” spredning i de omkringliggende hypodermis kan kvantes som bevis på exopher produksjon. Når det er sagt, nevroner som uttrykker mCherry under basale forhold er oftest forbundet med 5-25% av nevroner av en bestemt type som produserer en exopher. Kontrollert innføring av stressforhold kan brukes for å øke exopher produksjonen til deteksjon så høyt som 90% av nevroner som produserer profiler, spesielt nyttig for genetiske eller farmakologiske skjermer for modifikatorer.
Ved human nevrodegenerativ sykdom kan store aggregater overføres fra syke nevroner til nærliggende celler for å fremme patologispredning. Eksopher mekanismen kan skje via en konservert mekanisme som brukes for aggregert ekstrudering over phyla. Definere in vivo molekyler som enten forbedre effektiviteten av denne prosessen (anses mer effektiv proteostase kontroll) eller blokkere det kan utnyttes til å påvirke utformingen av nye strategier for bekjempelse av flere nevrodegenerative sykdommer. Som sådan kan protokollen som er beskrevet her, brukes til klassiske genetiske mutageneseskjermer, genom-brede RNAi-skjermer som systematisk slår ned gener for å identifisere enhancers og suppressors, eller for narkotikaintervensjonsstudier som identifiserer kandidatfarmakologiske modifikatorer av denne prosessen. Tilnærmingen er grei, men noe arbeidskrevende. Exophers er så store at de kan sees med et høyforstørrelsesspisse mikroskop. Likevel er C. elegans nevroner relativt små og ser på deres organeller eller deres membraner krever høyere kraft konfokale bilder og er en langsom prosess. Alternativer for høyere gjennomstrømming kan innebære høyinnholdsavbildningsmetoder i multi-well plate-format.
Anvendelsen av en standardisert tilnærming til exopher scoring bør til grunne en samordnet genetisk disseksjon av prosessen der nevroner kan organisere og eliminere cellulær rusk.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner følgende NIH-tilskudd: R01AG047101 og R37AG56510. Medlemmer av Driscoll- og Grant-laboratoriene har bidratt mye til utvikling og finjustering av protokoller som er beskrevet, med strenge eksperimenter og sterk kommunikasjon.
95B Scientific CMOS camera | Photometrics Prime | ||
1,000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
9 cm sterile Petri dishes | Fisher Scientific | 11309283 | |
absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
cholesterol | Acros | 110190250 | |
dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
E. coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
FBS10 Standard microscope | Meyer Instruments | KSC 410-1-100-1 | FBS10 Standard with Plate Base, 100/100 Trinocular Head and Flip zoom |
glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
LDI – Laser Diode Illuminator | 89 North | ||
levamisole | Sigma Aldrich | 16595-80-5 | |
M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
Polystyrene microbeads | Sigma Aldrich | MFCD00131491 | |
RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
Reusable ringed cytology slides | ThermoFisher Scientific | 22037242 | |
SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP] | contract Driscoll lab | GFP expressed in touch neurons | |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
Triton-X | Thermofisher scientific | 28313 | |
Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
X-Light V2 Spinning Disk Confocal Unit | CrestOptics | ||
ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] | contract Driscoll lab | mCherry expressed in touch neurons | |
ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+] | contract Driscoll lab | Q128 expressed in touch neurons | |
ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP] | contract Driscoll lab | mitoROGFP expressed in touch neurons | |
ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP] | contract Driscoll lab | autophagy marker expressed in touch neurons | |
ZEISS Axio Vert.A1 | Zeiss |