Isolasjon og kultur av Chick Ciliary Ganglion Neurons
Summary
Chick ciliary ganglia (CG) er en del av det parasympatiske nervesystemet. Nevronale kulturer av kylling CG nevroner ble vist å være effektive cellemodeller i studiet av nervemuskel interaksjoner. Vi beskriver en detaljert protokoll for disseksjon, dissosiasjon og in vitro kultur av CG nevroner fra chick embryoer.
Abstract
Chick ciliary ganglia (CG) er en del av det parasympatiske nervesystemet og er ansvarlige for innervering av muskelvevet som er tilstede i øyet. Denne ganglion er sammensatt av en homogen populasjon av ciliary og choroidal nevroner som innervate striated og glatt muskelfibre, henholdsvis. Hver av disse nevronale typene regulerer spesifikke øyestrukturer og funksjoner. Gjennom årene, nevronale kulturer av chick ciliary ganglia ble vist å være effektive cellemodeller i studiet av muskel-nervesystem interaksjoner, som kommuniserer gjennom kolinerge synapser. Ciliary ganglion nevroner er, i sitt flertall, kolinerg. Denne cellemodellen har vist seg å være nyttig relativt til tidligere brukte heterogene cellemodeller som består av flere nevronale typer, foruten kolinerge. Anatomisk er ciliary ganglion lokalisert mellom optisk nerve (ON) og choroid fissur (CF). Her beskriver vi en detaljert prosedyre for disseksjon, dissosiasjon og in vitro kultur av ciliary ganglia nevroner fra kylling embryoer. Vi tilbyr en trinnvis protokoll for å oppnå svært rene og stabile cellulære kulturer av CG-nevroner, og fremhever viktige trinn i prosessen. Disse kulturene kan opprettholdes in vitro i 15 dager, og herved viser vi den normale utviklingen av CG-kulturer. Resultatene viser også at disse nevronene kan samhandle med muskelfibre gjennom nevromuskulerte kolinerge synapser.
Introduction
Ciliary ganglion (CG) nevroner tilhører det parasympatiske nervesystemet. Disse nevronene er kolinerge, å kunne etablere muskariiniske eller nikotiniske synapser1,2,3. Anatomisk ligger CG i den bakre delen av øyet mellom synsnerven (ON) og choroidfissur (CF) og består av rundt 6000 nevroner i tidlige embryonale stadier1,4. For den første uken i kulturen presenterer ciliary ganglion nevroner en multipolar morfologi. Etter en uke begynner de å gå over til en unipolar tilstand, med en neurite som strekker seg og danner axon5. I tillegg dør omtrent halvparten av CG-nevronene mellom 8th og 14th dag av chick embryo utvikling, gjennom en programmert prosess med celledød. Denne nedgangen i antall nevroner resulterer i en total populasjon av ciliary ganglion av rundt 3000 nevroner6,7,8. In vitro, det er ingen reduksjon i antall CG nevroner når dyrket med muskelceller9 og CG nevroner kan dyrkes i flere uker1,9.
Ciliary ganglion består av en homogen populasjon av ciliary nevroner og choroidal nevroner, som hver representerer halvparten av den nevronale befolkningen i CG, innervating muskelen i øyet. Disse to typer nevroner er strukturelt, anatomisk og funksjonelt distinkt. Ciliary nevroner innervate striated muskelfibre på iris og linse, som er ansvarlig for elev sammentrekning. Choroidal nevroner innervate glatt muskelen i choroid1,10,11,12.
Kulturer av kylling ciliary ganglion nevroner har vist seg å være nyttige verktøy for studiet av nevromuskulære synapser og synapseformasjon 1,5,9. Tatt i betraktning at nevromuskulære synapser er kolinerge13, ved hjelp av en nevronal populasjon som er kolinerge – CG nevroner – dukket opp som et potensielt alternativ til tidligere cellemodeller14. Disse modellene besto i en heterogen nevronal befolkning, der bare en liten del er kolinerg. Alternativt utvikler ciliary ganglion nevroner relativt rask in vitro, og etter ca 15 timer danner allerede synapser1. CG nevroner har blitt brukt som et modellsystem gjennom årene for forskjellige forskningsstudier, på grunn av sin relativt enkle isolasjon og manipulasjon. Disse programmene inkluderer optogenetiske studier, synapse utvikling, apoptose og nevromuskulære interaksjoner14,15.
Vi beskriver en detaljert prosedyre for disseksjon, dissosiasjon og in vitro kultur av ciliary ganglia nevroner fra embryonale dag 7 (E7) chick embryoer. Vi tilbyr en trinnvis protokoll for å oppnå svært rene og stabile cellulære kulturer av kolinerge nevroner. Vi fremhever også viktige trinn i protokollen som krever spesiell oppmerksomhet, og som vil forbedre kvaliteten på nevronale kulturer. Disse kulturene kan opprettholdes in vitro i minst 15 dager.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen demonstrerte vi hvordan vi skal forberede og kultur CG nevroner. Identifisering og disseksjon av ciliary ganglion kan være vanskelig for uerfarne brukere. Derfor presenterer vi en detaljert og trinnvis prosedyre for effektivt å dissekere E7 chick ciliary ganglia, dissosiere vevet og forberede nevronale kulturer som kan opprettholdes i minst 15 dager. Ciliary ganglion nevroner oppnådd med denne protokollen er også egnet for co-kultur med muskelceller.
Ciliary ganglia på…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av European Regional Development Fund (ERDF), gjennom Centro 2020 Regional Operational Programme under prosjekter CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE, CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS, og gjennom COMPETE 2020 – Operativt program for konkurranseevne og internasjonalisering og portugisiske nasjonale midler via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., under prosjekter UIDB/04539/2020, UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, og den enkelte gir SFRH/BD/141092/1 2018 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) og av Marie Curie Actions – IRG, 7.
Materials
| 5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) | Merck (Sigma Aldrich) | F0503 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody | Thermo Fisher Scientific | A11041 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11031 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A21235 | |
| B27 supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Chicken monoclonal neurofilament M | Merck (Sigma Aldrich) | AB5735 | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | VWR | 24371.297 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil | Invitrogen (Gibco) | 10270-106 | |
| HEPES, fine white crystals, for molecular biology | Fisher Scientific | 10397023 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Invitrogen (Gibco) | 26050-070 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| Mouse laminin I | Cultrex (R&D systems) | 3400-010-02 | |
| Mouse monoclonal b-III tubulin | Merck (Sigma Aldrich) | T8578 | |
| Mouse monoclonal SV2 | DSHB | AB2315387 | |
| Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) | Thermo Fisher Scientific | 11874235 | |
| Neurobasal medium without glutamine | Invitrogen (Gibco) | 21103-049 | |
| Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | |
| Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture | Merck (Sigma Aldrich) | P3532 | |
| Poly-D-Lysine | Merck (Sigma Aldrich) | P7886 | |
| Potassium chloride | Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) | 31248-1KG | |
| Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS | Panreac Applichem | 131509-1000 | |
| Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI | Invitrogen (Gibco) | P36935 | |
| Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk | Fisher Scientific | 10462200 | |
| Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | |
| Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Peprotech | 450-10 | |
| Sodium chloride for analysis, ACS, ISO | Panreac Applichem | 131659-1000 | |
| Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade | Panreac Applichem | 141677-1000 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM (100x) | Thermo Fisher | 11360039 | |
| Syringe without needle, 10 mL | Thermo Fisher | 11587292 | |
| Trypsin 1:250 powder | Invitrogen (Gibco) | 27250-018 |
References
- Betz, W. The Formation of Synapses between Chick Embryo Skeletal Muscle and Ciliary Ganglia Grown in vitro. Journal of Physiology. 254, 63-73 (1976).
- Fischbach, G. D. Synapse Formation between Dissociated Nerve and Muscle Cells in Low Density Cell Cultures. Developmental Biology. 28, 407-429 (1972).
- Bernstein, B. W. Dissection and Culturing of Chick Ciliary Ganglion Neurons: A System well Suited to Synaptic Study. Methods in Cell Biology. 71, 37-50 (2003).
- Marwitt, R., Pilar, G., Weakly, J. N. Characterization of Two Ganglion Cell Populations in Avian Ciliary Ganglia. Brain Research. 25, 317-334 (1971).
- Role, L. W., Fishbach, G. D. Changes in the Number of Chick Ciliary Ganglion. Neuron Processes with Time in Cell Culture. Journal of Cell Biology. 104, 363-370 (1987).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synaptic Transmission and Cell Death During Normal Ganglionic Development. Journal of Physiology. , 737-749 (1974).
- Koszinowski, S., et al. Bid Expression Network Controls Neuronal Cell Fate During Avian Ciliary Ganglion Development. Frontiers in Physiology. 9, 1-10 (2018).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synapse Formation During Embryogenesis on Ganglion Cells Lacking a Periphery. Journal of Physiology. 241, 715-736 (1974).
- Nishi, R., Berg, D. K. Dissociated Ciliary Ganglion Neurons in vitro: Survival and Synapse Formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5171-5175 (1977).
- Nishi, R., Berg, D. K. Two Components from Eye Tissue that Differentially Stimulate the Growth and Development of Ciliary Ganglion Neurons in Cell Culture. Journal of Neuroscience. 1, 505-513 (1981).
- Pilar, G., Vaughan, P. C. Electrophysiological Investigations of the Pigeon iris Neuromuscular Junctions. Comparative Biochemistry and Physiology B. 29, 51-72 (1969).
- Landmesser, L., Pilar, G. Selective Reinnervation of Two Cell Populations in the Adult Pigeon Ciliary Ganglion. Journal of Physiology. , 203-216 (1970).
- Pinto, M. J., Almeida, R. D. Puzzling Out Presynaptic Differentiation. Journal of Neurochemistry. 139, 921-942 (2016).
- Dryer, S. E. Functional Development of the Parasympathetic Neurons of the Avian Ciliary Ganglion: A Classic Model System for the Study of Neuronal Differentiation and Development. Progress in Neurobiology. 43, 281-322 (1994).
- Egawa, R., Yawo, H. Analysis of Neuro-Neuronal Synapses using Embryonic Chick Ciliary Ganglion via Single-Axon Tracing, Electrophysiology, and Optogenetic Techniques. Current Protocols in Neuroscience. 87, 1-22 (2019).
- Pinto, M. J., Pedro, J. R., Costa, R. O., Almeida, R. D. Visualizing K48 Ubiquitination during Presynaptic Formation by Ubiquitination-Induced Fluorescence Complementation (UiFC). Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 1-19 (2016).
- Martins, L. F., et al. Mesenchymal Stem Cells Secretome-Induced Axonal Outgrowth is Mediated by BDNF. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
- Nishi, R. Autonomic and Sensory Neuron. Methods in Cell Biology. , 249-263 (1996).
- Rojo, J. M., De Ojeda, G., Portolés, P. Inhibitory Mechanisms of 5-fluorodeoxyuridine on Mitogen-induced Blastogenesis of Lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 6, 61-65 (1984).
- Hui, C. W., Zhang, Y., Herrup, K. Non-Neuronal Cells are Required to Mediate the Effects of Neuroinflammation: Results from a Neuron-Enriched Culture System. PLoS One. 11, 1-17 (2016).
- Crain, S. M., Alfei, L., Peterson, E. R. Neuromuscular Transmission in Cultures of Adult Human and Rodent Skeletal Muscle After Innervation in vitro by Fetal Rodent Spinal Cord. Journal of Neurobiology. 1, 471-489 (1970).
- Kano, M., Shimada, Y. Innervation and Acetylcholine Sensitivity of Skeletal Muscle Cells Differentiated in vitro from Chick Embryo. Journal of Cellular Physiology. 78, 233-242 (1971).
- Robbins, N., Yonezawa, T. Developing Neuromuscular Juctions: First Sings of Chemical Transmission during Formation in Tissue Culture. Science. 80, 395-398 (1971).
- Squire, L. R. . Encyclopedia of Neuroscience. , (2010).
- Hooisma, J., Slaaf, D. W., Meeter, E., Stevens, W. F. The Innervation of Chick Striated Muscle Fibers by the Chick Ciliary Ganglion in Tissue Culture. Brain Research. 85, 79-85 (1975).
- Morrison, B. M. Neuromuscular Diseases. Seminars in Neurology. , 409-418 (2016).
- Davies, A. M. The Trigeminal System: An Advantageous Experimental Model for Studying Neuronal Development. Development. 103, 175-183 (1988).
