यह प्रोटोकॉल वयस्क जेब्राफिश में एक्यूट किडनी इंजरी (AKI) को नेफ्रोटॉक्सिक एजेंट के रूप में सिस्प्लैटिन का उपयोग करके प्रेरित करने की प्रक्रियाओं का वर्णन करता है। हमने तकनीक की प्रजनन क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए कदम और गुर्दे के ऊतकों में सूजन और सेल मृत्यु का विश्लेषण करने के लिए दो तकनीकों को विस्तृत किया, प्रवाह साइटोमेट्री और ट्यूनल, क्रमशः।
सिस्प्लैटिन आमतौर पर कीमोथेरेपी के रूप में प्रयोग किया जाता है। हालांकि कैंसर के इलाज वाले व्यक्तियों में इसका सकारात्मक प्रभाव पड़ता है, लेकिन सिस्प्लैटिन अपने कम आणविक वजन के कारण गुर्दे में आसानी से जमा हो सकता है। इस तरह के संचय ट्यूबलर कोशिकाओं की मौत का कारण बनता है और तीव्र गुर्दे की चोट (AKI) के विकास को प्रेरित कर सकता है, जो गुर्दे के कार्य, ऊतक क्षति और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ में त्वरित कमी की विशेषता है। यदि विशिष्ट खुराक में प्रशासित सिस्प्लैटिन पशु मॉडल में एक AKI प्रेरक के रूप में एक उपयोगी उपकरण हो सकता है। ज़ेब्राफ़िश गुर्दे के कार्य, गुर्दे के उत्थान और चोट का अध्ययन करने के लिए एक दिलचस्प मॉडल के रूप में दिखाई दिया है, क्योंकि गुर्दे की संरचनाएं स्तनधारियों के साथ कार्यात्मक समानताओं का संरक्षण करती हैं। सिस्प्लैटिन के साथ इंजेक्शन वयस्क जेब्राफिश से पता चलता है कि 24 घंटे के बाद इंजेक्शन (एचपीआई) के बाद जीवित रहने, गुर्दे की कोशिका मृत्यु और सूजन मार्कर में कमी आई है। इस मॉडल में इम्यून सेल्स घुसपैठ और सेल डेथ का आकलन फ्लो साइटोमेट्री और ट्यूनल परख से किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल इंट्रापेरिटोनियल सिस्प्लैटिन इंजेक्शन द्वारा वयस्क जेब्राफिश में AKI को प्रेरित करने की प्रक्रियाओं का वर्णन करता है और बाद में यह दर्शाता है कि प्रवाह साइटोमेट्री प्रसंस्करण और सेल डेथ ट्यूनल परख के लिए गुर्दे के ऊतकों को कैसे इकट्ठा किया जाए। ये तकनीकें सिस्प्लैटिन के प्रभावों को नेफ्रोटॉक्सिक एजेंट के रूप में समझने के लिए उपयोगी होंगी और वयस्क जेब्राफिश में AKI मॉडल के विस्तार में योगदान देंगी। इस मॉडल का उपयोग गुर्दे के उत्थान का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है, उन यौगिकों की तलाश में जो गुर्दे की क्षति का इलाज या रोकथाम करते हैं और AKI में सूजन का अध्ययन करते हैं। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले तरीकों से ऊतक क्षति और सूजन के लक्षण वर्णन में सुधार होगा, जो गुर्दे से जुड़े comorbidities में चिकित्सीय लक्ष्य हैं।
गुर्दे कई महत्वपूर्ण शारीरिक कार्यों के लिए जिम्मेदार हैं जो होमोसेस्टेसिस को बनाए रखते हैं, जैसे रक्त निस्पंदन, अतिरिक्त अवशेषों को हटाना, और आयन सांद्रता का विनियमन1। गुर्दे के ऊतकों की क्षति एक विषम गुर्दे की चोट (AKI) नामक एक विषम स्थिति का कारण बन सकती है, जिसे चिकित्सकीय रूप से ट्यूबलर एपिथेलियल कोशिकाओं, एंडोथेलियल सेल चोट और ल्यूकोसिटे घुसपैठ 2, 3के विनाश और मृत्यु के कारण गुर्दे के कार्य में तेजी से कमी के रूप में वर्णित कियाजाताहै। AKI एक ऐसी स्थिति है जो अस्पताल में प्रवेश के 8-16% में होने का अनुमानहै, 4,उच्च मृत्यु दर के साथ जो गहन चिकित्सा इकाई (आईसीयू) 5 में 20 से50%तक है। यह बीमारी अस्पताल में रहने और वित्तीयसंसाधनोंके पर्याप्त उपयोग से जुड़ी है । एटियोलॉजिक कारकों में निर्जलीकरण, सदमे, संक्रमण, सेप्सिस, हृदय रोग, और नेफ्रोटॉक्सिक दवाएं शामिल हैं6। नेफ्रोटॉक्सिसिटी को दवाओं द्वारा प्रेरित गुर्दे की चोट के रूप में परिभाषित किया गया है, जिससे एकी, ट्यूबुलोपैथी और ग्लोमेरूपैथी7के रूप में प्रभाव पड़ता है। नेफ्रोटॉक्सिकिटी आईसीयू के दो-तिहाई रोगियों को प्रभावित करती है, क्योंकि आईसीयू में निर्धारित दवाओं का लगभग 20% नेफ्रोटॉक्सिक8,9 मानाजाताहै, इसमें नॉनस्टेरॉयड एंटी-भड़काऊ दवाएं (NSAIDs), वैनकोमाइसिन और अमीनोग्लाइकोसाइड्स जैसी एंटीबायोटिक्स, और मेथोट्रेक्सेट और सिस्प्लैटिन7जैसे कीमोथ्यूटिक एजेंट शामिल हैं। सिस्प्लैटिन सबसे शक्तिशाली और आम कीमोथेरेपी दवाओं में से एक है, जो ठोस ट्यूमर के इलाज में उपयोग की जाती है, जैसे सिर और गर्दन, वृषण, अंडाशय, और मूत्राशय10। गुर्दे में, सिस्प्लैटिन को कार्बनिक cationic ट्रांसपोर्टर 2 (OCT-2) के माध्यम से समीपस्थ जटिल ट्यूब (पीसीटी) में आंतरिक किया जाता है और उच्च सांद्रता में डीएनए ट्रिगर सेल मौत के रास्ते7,10, 11,12से बांधता है। गुर्दे में इस दवा के जमा होने से मृत्यु और सूजन के साथ नेफ्रोटॉक्सिकिटी में योगदान होता है13. यह हानिकारक दुष्प्रभाव सिस्प्लैटिन उपचार से गुजर रहे कैंसर रोगियों के एक तिहाई के जीवन और पूर्वानुमान को अत्यधिक प्रभावित करता है, इसलिए आवश्यक है कि नए उपचारों का शोध जो कैंसर कोशिकाओं पर हत्या प्रभाव को खोने के बिना नेफ्रोटॉक्सिकिटी को कम कर सकता है10।
इस नेफ्रोटॉक्सिक प्रभाव के कारण, सिस्प्लैटिन का उपयोग आमतौर पर प्रयोगात्मक पशु मॉडल में अकी के प्रेरक के रूप में किया जाता है, जैसा कि आगे वर्णित है। कृंतक में, सिस्प्लैटिन द्वारा प्रेरित पहला एकी मॉडल 1 971 14 में सूचित किया गया था लेकिन वर्तमान में, सिस्प्लैटिन15के खुराक-निर्भर और संचयी प्रभावों का उपयोग करके कई अलग-अलग प्रोटोकॉल उभरे हैं। इस प्रकार, अनुप्रयोगों की खुराक और संख्या के आधार पर,गुर्दे की चोट की गंभीरता के विभिन्न ग्रेड16, 17,18, 19,20,21प्रेरित किए जा सकते हैं। सबसे लगातार विधि में सिस्प्लैटिन की एक खुराक का इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन होता है जिसके बाद निम्नलिखित दिनों में इच्छामृत्यु होती है। इस क्लासिक प्रोटोकॉल में, सिस्प्लैटिन की एक उच्च नेफ्रोटॉक्सिक खुराक (चूहों में 10-13 मिलीग्राम/किलो और चूहों में 3-8 मिलीग्राम/किलो) गंभीर हिस्टोलॉजिकल परिवर्तन लाती है, जैसे ब्रश सीमा और ट्यूबलर ल्यूमेन के अंदर सेल मलबे का नुकसान, सिस्प्लैटिन इंजेक्शन के कुछ दिन बाद । हिस्टोलॉजिकल परिवर्तनों की गंभीरता खुराक पर निर्भर है, और पुनर्जनन के लक्षण सिस्प्लैटिन इंजेक्शन16, 17के 7 दिन बाद देखे जातेहैं।
हालांकि कृंतक मॉडल अच्छी तरह से स्थापित हैं, हमने जेब्राफिश(डैनियो रेरियो)पर अपने अध्ययन को केंद्रित करते हुए एक और कशेरुकी की विशेषताओं का लाभ उठाने का फैसला किया। इस मछली को बड़े पैमाने पर मानव रोगों मॉडलिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है, क्योंकि इसके छोटे आकार, बाहरी निषेचन, उच्च प्रजनन दर, तेजी से विकास, भ्रूण और लार्वा की पारदर्शिता, कम रखरखाव लागत, स्तनधारियों के समान शरीर रचना (कुछ अपवादों के साथ), उच्च ऊतक उत्थान क्षमता, सामाजिक व्यवहार, मनुष्यों के साथ आनुवंशिक समानता का ७०% और मानव रोगों से जुड़े जीन22के साथ ८४% । स्ट्रीसिंगर एट अल23,24,25 ने जेब्राफिश के साथ अध्ययन शुरू किया जिसने कशेरुकी विकास के आनुवंशिक विश्लेषण के लिए इस मॉडल जीव का उपयोग करने की व्यावहारिकता की पुष्टि की। किडनी रिसर्च में जेब्राफिश न सिर्फ विकासात्मक अध्ययनों में बल्कि किडनी की स्थिति26से जुड़े नए जीन की तलाश में जेनेटिक टूल के रूप में भी सामने आई है । इसके अलावा, निशान गठन के बिना पुनर्जनन की क्षमता और उनके जीवन के माध्यम से नेफ्रॉन उत्पन्न करने की क्षमता, जिसे नियोनेफ्रोजेनेसिस कहा जाता है, जेब्राफिश को पुनर्जनन अनुसंधान27,28के लिए एक प्रमुख पशु मॉडल बनाते हैं। इसके अलावा, तीव्र और क्रोनिक किडनी इंजरी सहित विभिन्न गुर्दे की बीमारी के लिए प्रायोगिक मॉडलों की उपलब्धता, इस प्रयोगात्मक जीव26,29की बहुमुखी प्रतिभा को प्रदर्शित करता है। स्तनधारियों की तरह, जेब्राफिश के गुर्दे के जनक मध्यवर्ती मेसोडर्म से प्राप्त होते हैं। इस तरह के गुर्दे के जनक प्रोप्रोफस उत्पन्न करते हैं जो बाद में मेसोनेफ्रोस में विकसित होंगे, जिसे वयस्कता29,30तक एक परिपक्व अंग के रूप में बनाए रखा जाएगा।
वयस्क जेब्राफिश किडनी तैरने वाले मूत्राशय औररीढ़ 29के बीच शरीर की पृष्ठीय दीवार पर स्थित है। एक वेंट्रल व्यू से, जेब्राफिश को तीन क्षेत्रों(चित्रा 1A):सिर (एच), ट्रंक (टीआर), और पूंछ(टीए) 29में विभाजित किया जा सकता है। स्तनधारियों के समान, जेब्राफिश में गुर्दे की कार्यात्मक इकाइयों के रूप में नेफ्रॉन होते हैं, जिन्हें ट्यूबल सेगमेंट(चित्रा 1A): गुर्देके कॉर्पसकल (आरसी), समीपस्थ जटिल ट्यूबुल (पीसीटी), समीपस्थ सीधे ट्यूबल (पीएसटी), डिस्टल अर्ली (डीई), लेट डिस्टल (डीएल) और डक्ट (सीडी)29का संग्रह करने में विभाजित किया जाता है। ज़ेब्राफ़िश मानव नेफ्रॉन(चित्रा 1 बी)के साथ आनुवंशिक संरक्षण और संरचनात्मक समानताएं साझा करता है, लेकिन इसमें मध्यवर्ती ट्यूबल जैसे कुछ संरचनाओं का अभाव है, जिसे हेनले (एलएच)29,31के लूप के रूप में भी जाना जाता है। जेब्राफिश जैसी मीठे पानी की मछलियां आम तौर पर बहुत कम ऑस्मोलैरिटी वाले माध्यम से घिरी होती हैं, इस वजह से, वे हाइपरमोस्मोटिक हो जाती हैं और गहरे नाले, शुरुआती चरणों में त्वचा, और ओस्मोलैरिटी और पानी के उत्सर्जन को विनियमित करने के लिए गुर्दे पर निर्भर करती हैं32। प्रोप्रोफस द्वारा पृष्ठीय महाधमनी से रक्त का निस्पंदन 48 घंटे के बाद निषेचन (एचपीएफ)33, 34के आसपास शुरूहोताहै। जेब्राफिश की किडनी न केवल मेटाबॉलिक वेस्ट एक्साइटिंग ऑर्गन है बल्कि 4 दिन बाद फर्टिलाइजेशन (डीपीएफ) से वयस्कता तक हेमेटोपोइटिक ऑर्गन के तौर पर भी काम करती है और यह स्तनधारियों35में बोन मैरो के बराबर है। विकास के दौरान, हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल (एचएससी) गुर्दे को बीज देगा, आत्म-पुनर्निर्मित, और माइलॉयड, एरिथ्रोइड और लिम्फोइड सेल वंश उत्पन्न करेगा, प्रतिलेखन कारकों को बनाए रखेगा, अणुओं का संकेत देगा, और स्तनधारियों के साथ अत्यधिक संरक्षित आनुवंशिक कार्यक्रम36,37। अध्ययनों से पता चला है कि मानव प्रतिरक्षा प्रणाली की अधिकांश एरिथ्रोइड, थ्रोम्बोसाइटिक, माइलॉयड और लिम्फाइड कोशिकाएं जेब्राफिश37, 38में मौजूद हैं। इस जानवर की अनूठी विशेषताओं और मानव गुर्दे के साथ संरक्षित विशेषताओं ने गुर्दे के कार्य, चोट और उत्थान के शोध में इस मॉडल जीव को लाभप्रद बना दिया।
यद्यपि जेब्राफिश के गुर्दे का अच्छी तरह से अध्ययन किया जाता है और एकेआई के कुछ मॉडल पहले से ही लार्वा और वयस्क जेब्राफिश28में उपलब्ध हैं, इस प्रोटोकॉल की स्थापना के समय वयस्क जेब्राफिश में रासायनिक रूप से प्रेरित गैर-एंटीबायोटिक AKI मॉडल का कोई सबूत नहीं था। इसके अलावा, हमारी प्रयोगशाला पुनर्जनन और गुर्दे की क्षति का अध्ययन करने के लिए प्रोबायोटिक बैक्टीरिया और माइक्रोबायोटा-व्युत्पन्न यौगिकों का परीक्षण करने पर केंद्रित है, इस प्रकार हमने वयस्क मछलियों में एक नया सिस्प्लैटिन-प्रेरित AKI मॉडल बनाने में अपने प्रयासों को केंद्रित किया। इस पांडुलिपि में प्रस्तुत वीडियो लेख 120 यूजी सिस्प्लैटिन प्रति ग्राम पशु (120 माइक्रोग्राम/जी) (चित्रा 2 ए) के एक आईपी इंजेक्शन का उपयोग करके AKI प्रेरण के एक नए मॉडल के लिए प्रक्रियाओंको दर्शाता है। यह खुराक शुरू में मुरीन मॉडल में सिस्प्लैटिन द्वारा प्रेरित एकी के अध्ययन पर आधारित थी जो लगभग 10 मिलीग्राम/किलो (10 माइक्रोग्राम/जी के बराबर)14,15,16,17के आसपास चली गई, हालांकि, यह खुराक नेफ्रोटॉक्सिकिटी (डेटा नहीं दिखाए गए) से संबंधित गुर्दे की क्षति को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त नहीं थी। इस प्रकार, हमने इस अध्ययन(चित्रा 2B)में उपयोग किए जाने वाले लोगों को खुराक में वृद्धि की। हमारे काम गुर्दे के ऊतक क्षति 24 hpi के शामिल करने के साथ इंजेक्शन के बाद जीवित रहने की दर में सिस्प्लैटिन के एक खुराक पर निर्भर प्रभाव से पता चला के रूप में ट्यूबलर संरचना के नुकसान से दिखाया गया है, भड़काऊ घुसपैठ में वृद्धि हुई है, और सेल मौत की उच्च दर । यहां, हम सेल डेथ को मापने के लिए सेल घुसपैठ और ट्यूनल का विश्लेषण करने के लिए सिस्प्लैटिन-प्रेरित AKI के विकास का विश्लेषण करने के लिए दो तकनीकों का वर्णन करते हैं। फ्लो साइटोमेट्री एक ऐसी तकनीक है जो कोशिकाओं की भौतिक (आकार और दानेदारता) और रासायनिक (फ्लोरोसेंट यौगिकों) विशेषताओं को मापती है। साइटोमीटर के अंदर सेल सस्पेंशन एक म्यान तरल पदार्थ के माध्यम से चलता है जो कोशिकाओं को एक ही पंक्ति में व्यवस्थित करता है, जिससे उन्हें एक समय में लेजर बीम वन सेल(चित्रा 3 ए)से गुजरने की अनुमति देता है। प्रकाश बीम के सामने एक डिटेक्टर फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) को मापेगा, जो सेल आकार से संबंधित है, और साइड में डिटेक्टर साइड स्कैटर (एसएससी) को मापेंगे जो कोशिकाओं की दानेदारता से संबंधित है। अन्य डिटेक्टर कणों, फ्लोरोसेंट-प्रोटीन, या एंटीबॉडी लेबल वाली कोशिकाओं39,40से फ्लोरेसेंस को मापेंगे। चूंकि जेब्राफिश के लिए वाणिज्यिक एंटीबॉडी आजकल दुर्लभ हैं, पशु संवाददाताओं और फ्लोरोसेंट बायोमार्कर का उपयोग इस विश्लेषण में सुधार करने और विविधकोशिकाआबादी 41,42, 43की पहचान करने की अनुमतिदेताहै। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला एक अन्य उपकरण टर्मिनल डीऑक्सीन्यूक्लियोटिडिल ट्रांसफरेज (टीडीटी) डयूटीप निक एंड लेबलिंग (ट्यूनल) परख था। ट्यूनल परख एक देर से चरण एपोप्टोसिस डिटेक्शन विधि है जो खंडित डीएनए की पहचान करने के लिए टीडीटी की क्षमता पर निर्भर करती है और इसे फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ टैग किए गए डिऑक्सी न्यूक्लियोटाइड के साथ लेबल करती है जिसे बाद में माइक्रोस्कोपी44 (चित्रा 3 बी)द्वारा कल्पना और मात्रात्मक किया जा सकताहै। यह देखते हुए कि AKI की सबसे हड़ताली विशेषताओं में से एक ट्यूबलर किडनी कोशिकाओं3में एपोप्टोसिस का प्रेरण है, यह तकनीक बेहद लाभप्रद है क्योंकि इसका विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री और/या माइक्रोस्कोपी द्वारा किया जा सकता है ।
इस लेख में प्रस्तुत दृष्टिकोण AKI स्थिति के अवलोकन की अनुमति देता है और AKI विकारों का अध्ययन करने के लिए एक नया तीव्र मॉडल प्रदान करता है जो सिस्प्लैटिन से संबंधित AKI में नए चिकित्सीय लक्ष्यों के शोध के लिए उपयोगी हो सकता है।
गुर्दे की बीमारी की व्यापकता दुनिया भर में बढ़ती जा रही है, एक वैश्विक सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या बन गई है जो लाखों लोगों को प्रभावित करती है६३। गुर्दे के घायल व्यक्तियों के इलाज के लिए एक रास्ता ढूंढना सर्वोपरि महत्व का है और साथ ही उनके एटियोलॉजी और प्रगति के बारे में अधिक समझते हैं । कई अध्ययनों से गुर्दे की क्षति को समझने के लिए पशु मॉडल का उपयोग किया गया है । जेब्राफिश किडनी (चित्रा 1) का अध्ययन विकासात्मक जीव विज्ञान और चोट अनुसंधान में वर्षों से किया गया है क्योंकि इसकी आत्म-पुनर्जनन क्षमताओं और आनुवंशिक समानता29,64के कारण है । यहां, हम वयस्क जेब्राफिश में एक नया AKI मॉडल पेश करते हैं जो सिस्प्लैटिन के गुणों को नेफ्रोटॉक्सिक एजेंट के रूप में उपयोग करता है, जो 24 एचपीआई (चित्रा 2) के रूप में जल्द ही दिखाई देने वाले नुकसान के साथ एक तेज और तीव्र प्रतिक्रिया को पूरा करने के लिएकदमों का ब्यौरा देता है। इसके अलावा, यहां हम दो तकनीकों की व्याख्या करते हैं जो सिस्प्लैटिन इंजेक्शन, फ्लो साइटोमेट्री और ट्यूनल(चित्रा 3)के बाद ऊतक क्षति के मूल्यांकन में मदद करेंगे।
वयस्क जेब्राफिश में वर्तमान AKI मॉडल में जेंटामिसिन का आईपी इंजेक्शन शामिल है जो नेफ्रॉन और ट्यूबल विनाश में व्यापक क्षति को प्रेरित करता है, नियोनेफ्रोजनेसिस घटनाएं 5 दिन से शुरू होती हैं, और पुनर्जनन इंजेक्शन65के बाद 21 दिनों तक पूरा हो जाता है। दूसरी ओर, सेप्सिस से जुड़े एक्यूट किडनी इंजरी (एस-एकी) का एक मॉडल एडवर्ड्सिएला टार्डाके साथ संक्रमण द्वारा स्थापित किया गया था, क्योंकि इंसुलिन जैसे विकास कारक-बाध्यकारी प्रोटीन-7 (आईजीएफबीपी 7), मेटाल्लोप्रोटीन्स 2 (टीएमपी-2) के ऊतक अवरोधक, और गुर्दे की चोट अणु-1 (किम-1), लार्वा और जेब्रा666 मेंकाफी वृद्धि हुई है। ज़ेब्राफ़िश चिकित्सकीय एजेंटों की खोज के लिए एक उच्च-थ्रूपुट जानवर होने के लिए जाना जाता है और इसमें गुर्दे के कार्य और पुनर्जनन67का अध्ययन करने के लिए प्रोबायोटिक्स और माइक्रोबायोटा-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स का उपयोग शामिल है। हालांकि, उपलब्ध मॉडल सीधे इन उपचारों के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं। इस प्रकार, हमने वयस्क जेब्राफिश(चित्रा 4)में AKI को प्रेरित करने के लिए एक अलग विधि स्थापित की, जो सिस्प्लैटिन का उपयोग एक ज्ञात नेफ्रोटॉक्सिक एजेंट के रूप में करती है, जिसका मछली माइक्रोबायोटा पर प्रत्यक्ष ज्ञात प्रभाव नहीं होगा, जैसा कि एक एंटीबायोटिक होने के लिए जेंटामिसिन मॉडल होगा, या ई. टार्डाके साथ संक्रमण, एक सेप्सिस मॉडल होने के लिए। हालांकि, उसी समय जब हम अपने सिस्प्लैटिन प्रोटोकॉल विकसित कर रहे थे, एक अन्य समूह ने वयस्क जेब्राफिश में सिस्प्लैटिन के नेफ्रोटॉक्सिक प्रभावों का भी पता लगाया, खुराक को प्रति पशु6810-20-30 माइक्रोन तक सरल बनाया। यद्यपि उन्होंने जीवित रहने में सिस्प्लैटिन खुराक-निर्भर प्रभाव भी दिखाया, हम सभी मछलियों के लिए सिस्प्लैटिन की एक मात्रा का उपयोग करने में सावधानी की सलाह देते हैं, क्योंकि एक ही उम्र से जेब्राफिश में बहुत अलग आकार और वजन हो सकता है और यहपरिणाम 69,70में भिन्नता को प्रेरित कर सकता है। हमें लगता है कि जानवर के इसी वजन के लिए खुराक को समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है, जैसा कि चूहों और इस अध्ययन में किया जाता है।
वयस्क जेब्राफिश के साथ हमारे प्रयोगों में, सिस्प्लैटिन ने खुराक-प्रतिक्रिया प्रभाव दिखाया। यह सिस्प्लैटिन इंजेक्शन(चित्रा 5)के बाद जानवरों के जीवित रहने की दर की निगरानी करके कल्पना की गई थी। हमने सिस्प्लैटिन की खुराक की तीव्रता का अनुमान लगाने के तरीके के रूप में अस्तित्व का उपयोग किया और नेफ्रोटॉक्सिसिटी के उपाय के रूप में नहीं, क्योंकि निगरानी के समय कोई अन्य भौतिक संकेत दिखाई नहीं देता है। यह कृंतक के साथ तुलनीय हो सकता है, जिसमें गुर्दे की चोट की गंभीरता को सिस्प्लैटिन इंजेक्शन15की खुराक और आवृत्ति द्वारा संग्राहक किया जा सकता है, जो सिस्प्लैटिन71की उच्च सांद्रता के साथ घातक खुराक प्राप्त करता है। मृत भी सिस्प्लैटिन 72 के लार्वा मॉडल में अगले दिनों मेंदेखा जाताहै. चूंकि हमारा उद्देश्य कुछ दिनों में एक तीव्र चोट को प्रेरित करना था, इसलिए हमने सिस्प्लैटिन की 120 माइक्रोग्राम/जी खुराक का चयन किया जैसा कि इंजेक्शन के बाद गुर्दे की क्षति 24 घंटे का निरीक्षण करना संभव है, हालांकि, इसे अध्ययन के उद्देश्यों के आधार पर समायोजित किया जा सकता है।
मनुष्यों में, AKI चिकित्सकीय रूप से कम चमकदार निस्पंदन दर (जीएफआर), ऊंचा सीरम क्रिएटिनिन, और रक्त यूरिया नाइट्रोजन 3 द्वारा निदान कियाजाताहै। जेब्राफिश में, एकेआई मॉडल के प्रदर्शनों की सूची में कुछ आनुवंशिक-सशर्त मॉडल73, 74और कुछ दवा से संबंधित मॉडल65,72 शामिल हैं, लेकिन तकनीकी कठिनाइयों(जैसे, रक्त संग्रह) के कारण जेब्राफिश पर कुछ AKI कार्यात्मक मापदंडों को मापा नहीं जा सकता है, अधिकांश शोधअकी1,75 की विशेषताओं का निरीक्षण करने के लिए रूपात्मक और दृश्य तकनीकों को अपनाते हैं जैसे कि हमारे अध्ययन।
कृंतक में, सिस्प्लैटिन समीपस्थ और डिस्टल ट्यूबल में एपिथेलियल कोशिकाओं में प्रवेश करता है, कोशिका के अंदर मेटाबोलिक सक्रियण से गुजरता है और सेल ऑर्गेनेल्स पर अत्यधिक प्रतिक्रियाशील अभिनय हो जाता है और कोशिका संरचना में परिवर्तन को प्रेरित करता है। ये परिवर्तन बहुत अधिक मात्रा में एपोप्टोसिस और ऑटोफैगी और यहां तक कि परिगलन को प्रेरित कर सकते हैं। इस क्षति के जवाब में, कई साइटोकिन्स जारी किए जाते हैं और ल्यूकोसाइट्स को भर्ती किया जाता है जिससे सूजन होती है और अंग15की कार्यक्षमता प्रभावित होती है। यह यह आकलन करने के महत्व पर प्रकाश डालता है कि घायल गुर्दे में किस प्रकार की कोशिकाएं पाई जा सकती हैं, निवासियों या घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में। यहां हमने दिखाया कि आजकल उपलब्ध ट्रांसजेनिक प्रतिरक्षा रिपोर्टर लाइनों(टेबल 1)का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा इसका आकलन कैसे करें। सिस्प्लैटिन ने इंजेक्शन(चित्र 6)के बाद गुर्दे में न्यूट्रोफिल(एमपीओ: जीएफपी पॉजिटिव कोशिकाओं) का प्रतिशत बढ़ाया। जेब्राफिश के मामले में, गुर्दे एचएससी का आला है जो विभिन्न रक्त कोशिका प्रकारों को जन्म देता है। फिर भी, कई ग्रैनुलोसाइट्स और मैक्रोफेज सामान्य रूप से रक्त में घूम रहे हैं। हमारे उदाहरण में, हमने एमपीओ: जीएफपी ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग किया जो न्यूट्रोफिल52के माइलोप्रोक्सिडेस के प्रमोटर के तहत जीएफपी व्यक्त करता है। एमपीओ के मूल अध्ययन: जीएफपी ट्रांसजेनिक लाइन ने न्यूट्रोफिल परिपक्वता76 के विभिन्न राज्यों में माइलोप्रोक्सिडेस की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया लेकिन हमारी गेट रणनीति ग्रेनुलोसाइट अंश पर केंद्रित थी जिसमें रक्त52से आने वाली परिपक्व कोशिकाएं शामिल हैं, इस तरह से हमारे विश्लेषण में घुसपैठ कोशिकाएं शामिल हैं न कि निवासी कोशिकाएं। वांछित कोशिका आबादी को अलग करते समय इस पर विचार करना महत्वपूर्ण है।
जैसा कि ऊपर बताया गया है, एपोप्टोसिस सिस्प्लैटिन से संबंधित अकी का सबसे क्लासिक मार्कर है। यहां, हमने ट्यूनल परख द्वारा मृत कोशिकाओं के स्थानीयकरण के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया। सिस्प्लैटिन इंजेक्शन ने एपोटोटिक कोशिकाओं की संख्या 24 एचपीआई(चित्रा 7)में वृद्धि की। यह ऊतक से मृत कोशिकाओं को सीधे गिनती करके आसानी से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। फिर भी, सेल-विशिष्ट मृत्यु की पहचान के लिए वांछित कोशिका(जैसे, ट्यूबलर कोशिकाओं) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग, या ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइन के उपयोग का उपयोग इस तकनीक के साथ एक साथ किया जा सकता है। जब AKI के gentamicin प्रेरित मॉडल के साथ तुलना में, सिस्प्लैटिन एक अधिक गंभीर मॉडल प्रतीत होता है, क्योंकि जेंटामिसिन एपोप्टोसिस इंजेक्शन65के बाद तीसरे दिन अधिक था।
विभिन्न प्रकार के दुष्प्रभाव होने के बावजूद, सिस्प्लैटिन का उपयोग अभी भी कैंसर चिकित्सा में व्यापक रूप से किया जाता है, क्योंकि कार्सिनोमा, रोगाणु कोशिका ट्यूमर, लिंफोमास और सारकोमा77सहित विभिन्न प्रकार के कैंसर के खिलाफ इसकी प्रभावशीलता के कारण। नेफ्रोटॉक्सिकिटी सिस्प्लैटिन10के साथ उपचार में रोगियों के एक तिहाई में होती है, इस प्रकार रणनीतियों की खोज जो इस प्रभाव को कम कर सकती हैं और रेनोप्रोटेक्शन को बढ़ा सकती हैं। हमारा मानना है कि इस पांडुलिपि में प्रस्तुत तरीकों और तकनीकों से गुर्दे की चोट के तंत्र को स्पष्ट करने और चिकित्सीय लक्ष्यों को खोजने में मदद मिलेगी जो गुर्दे की जटिलताओं से पीड़ित व्यक्तियों के जीवन की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए आवश्यक हो सकते हैं, मुख्य रूप से सिस्प्लैटिन के उपयोग से संबंधित हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को फंडाकाओ डी एम्पारो à पेस्क्विसा डो एस्टाडो डी साओ पाउलो – एफएपीपी (2015/21644-9; 2017/05264-7 द्वारा समर्थित किया गया था; 2017/05687-5; 2018/20722-4), कॉन्सेल्हो नैसिनल डी डेसेवोल्विमेंटो सिएंटीफिको ई टेकनोलोलोगिको (सीएनपीक्यू) और कोर्डेनाकाओ डी एपेरफेइकोओमेंटो डी पेसोसोल डी एनीवेल सुपीरियर (केप्स), वित्तीय कोड 001। हम साओ पाउलो विश्वविद्यालय के जैव विज्ञान संस्थान में मारिया रीता डॉस सैंटोस ई पासोस-ब्यूनो और जेनेटिक्स और विकासवादी जीव विज्ञान विभाग की जेब्राफिश सुविधा की प्रयोगशाला में अपने सहयोगियों को धन्यवाद देते हैं। हम कृपया पांडुलिपि पर टिप्पणियों और सुझावों के लिए क्रिस्टियान नफाह डी सूजा ब्रेडा और थेरेसा रक़ील डी ओलिविएरा रामल्हो को धन्यवाद देते हैं । हम इस वीडियो की रिकॉर्डिंग, संस्करण और उत्पादन के लिए बायोमेडिकल साइंसेज संस्थान की मल्टीमीडिया टीम से मार्सिओ विल्लर मार्टिंस की बहुत सराहना करते हैं और धन्यवाद देते हैं।
1x PBS | Made by diluting 10 X PBS (prepared in lab) in distilled water | ||
31 G 1.0 cc insulin syringe | BD Plastipak | 990256 | Needle: BD Precision Glide 300110 |
3.5 L Fish tank | Tecniplast | Part of the aquactic system | |
6 well plate | Corning | 351146 | |
10 mM Tris/HCl | Prepared from solid Tris Base (Promega, H5135), adjusted to pH 7.4-8 with HCl (Merck, 1003171000) | ||
50 ml Falcon tube | Corning | 352070 | |
2-3% Agarose | Invitrogen | 16500-500 | Dissolve 2 or 3% agarose (w/v) in 1x PBS, warm until dissolve. |
2% FBS | Gibco | 12657-09 | Dilute 2% (w/v) directly in 1x PBS |
4% Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Dissolve 4% PFA (w/v) in warm 1x PBS, mix until dissolve in a hot plate in a fume hood. Aliquot and store at -20 °C |
50% Ethanol | Made by diluting 100% ethanol in distilled water | ||
70% Ethanol | Made by diluting 100% ethanol in distilled water | ||
90% Ethanol | Made by diluting 100% ethanol in distilled water | ||
100% Ethanol | Synth | 00A1115.01.BJ | |
100% Xylene | Synth | 00X1001.11.BJ | |
Cell strainer 40 µm | Corning | 431750 | |
Cisplatin | Blau Farmacêutica | 16020227 | C-PLATIN 1 mg/mL. Store at room temperature. |
Cork board sheet | Obtained from local stationary store | ||
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Stock solution 20 mg/ml dissolved in water |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Flow cytometry tubes | Corning | 352052 | |
Glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
Histology cassette | Ciencor | 2921 | |
Immuno stain chamber | Ciencor | EP-51-05022 | |
Incubator | NAPCO | 5400 | Set to 37 °C |
Insect pins | Papillon | Model micro15x20 | |
In Situ Cell Death Detection Kit | Roche Diagnostics | 12156792910 | |
Metal mold | Leica Biosystems | 3803081 | |
Micropipette 200-1000 µL | Eppendorf | Use 1 mL tips | |
MS-222 (Tricaine) | Fluka Analytical | A5040-25G | |
NaCl 0.9% | Synth | C1060.01.AG | Dissolve 0.9% NaCl (w/v) in distilled water |
Nail polish | Prefer transparent | ||
Neubauer chamber | Precicolor HGB | ||
Pasteur plastic pipet | United Scientific Supplies | P31201 | |
Paraplast | Sigma-Aldrich | P3558 | |
Petri dish | J.ProLab | 0307-1/6 | 60 and 100 mm |
Plastic spoon | Obtained from local store | ||
Proteinase K | New England BioLabs | P8102 | Diluite from stock 20 mg/ml |
Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Scalpel blade | Solidor | ||
Sponge | Obtained from local store | ||
Trypan Blue | Cromoline | 10621/07 | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Cytometer | BD Biosciences | FACSCanto II | |
Fluorescence Stereoscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
Fluorescence Microscope | Zeiss | AxioVert.A1 | |
Microtome | Leica | Jung Supercut | |
Scale | Ohaus Corporation | AR2140 |