Detta protokoll beskriver förfarandena för att inducera akut njurskada (AKI) hos vuxna zebrafiskar med cisplatin som ett nefrotoxiskt medel. Vi detaljerade stegen för att utvärdera reproducerbarheten av tekniken och två tekniker för att analysera inflammation och celldöd i njurvävnad, flöde cytometri respektive TUNEL, respektive.
Cisplatin används ofta som kemoterapi. Även om det har positiva effekter hos cancerbehandlade individer, kan cisplatin lätt ackumuleras i njuren på grund av dess låga molekylvikt. Sådan ackumulering orsakar tubulära cellers död och kan inducera utvecklingen av akut njurskada (AKI), som kännetecknas av en snabb minskning av njurfunktion, vävnadsskada och immuncellsinfiltration. Om cisplatin administreras i specifika doser kan det vara ett användbart verktyg som AKI-inducerare i djurmodeller. Zebrafisken har dykt upp som en intressant modell för att studera njurfunktion, njurregenerering och skada, eftersom njurstrukturer bevarar funktionella likheter med däggdjur. Vuxna zebrafisk injiceras med cisplatin visar minskad överlevnad, njurcellsdöd och ökade inflammationsmarkörer efter 24 h efter injektion (hpi). I denna modell kan immunceller infiltration och celldöd bedömas genom flödescytometri och TUNEL-analys. Detta protokoll beskriver förfarandena för att inducera AKI i vuxna zebrafisk genom intraperitoneal cisplatin injektion och därefter visar hur man samlar njurvävnad för flöde cytometry bearbetning och celldöd TUNEL analys. Dessa tekniker kommer att vara användbara för att förstå effekterna av cisplatin som ett nefrotoxiskt medel och kommer att bidra till expansionen av AKI-modeller hos vuxna zebrafiskar. Denna modell kan också användas för att studera njurregenerering, i sökandet efter föreningar som behandlar eller förebygger njurskador och för att studera inflammation i AKI. Dessutom kommer de metoder som används i detta protokoll att förbättra karakteriseringen av vävnadsskador och inflammation, som är terapeutiska mål i njurrelaterade komorbiditeter.
Njurarna är ansvariga för flera viktiga fysiologiska funktioner som upprätthåller homeostas, såsom blodfiltrering, avlägsnande av överskott av rester och reglering av jonkoncentrationer1. Skador på njurvävnad kan leda till ett heterogent tillstånd som kallas akut njurskada (AKI), som kliniskt beskrivs som en snabb minskning av njurfunktionen orsakad av förstörelse och död av rörformiga epitelceller, endotelcellsskada och leukocytinfiltration 2,3. AKI är ett tillstånd som beräknas inträffa i 8-16% av sjukhusinläggningarna4, med en hög dödlighet som sträcker sig från 20 till 50% på intensivvårdsavdelningen (IVA)5. Denna sjukdom är förknippad med ökad sjukhusvistelse och betydande användning av ekonomiska resurser5. Åldersfaktorer inkluderar uttorkning, chock, infektioner, sepsis, hjärt-kärlsjukdom och nefrotoxiska läkemedel6. Nefrotoxicitet definieras som en njurskada som induceras av droger, vilket orsakar effekter som AKI, tubulopathies och glomerulopathies7. Nefrotoxicitet drabbar två tredjedelar av IVA-patienterna, eftersom cirka 20% av de läkemedel som föreskrivs på IVA anses nefrotoxiska8,9, detta inkluderar icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel (NSAID), antibiotika som vankomycin och aminoglykosider och kemoterapeutiska medel som metotrexat och cisplatin7. Cisplatin är en av de mest potenta och vanliga kemoterapiläkemedel, som används vid behandling av solida tumörer, såsom huvud och hals, testikel, äggstock och urinblåsa10. I njuren internaliseras cisplatin i det proximala invecklade röret (PCT) genom den organiska katjontransportören 2 (OCT-2) och i höga koncentrationer binder till DNA som utlöser celldödsvägarna7,10,11,12. Ackumuleringen av detta läkemedel i njuren bidrar till nefrotoxicitet med död och inflammation13. Denna skadliga biverkning påverkar enormt livet och prognosen för en tredjedel av cancerpatienter som genomgår cisplatinbehandling, så är absolut nödvändigt forskningen om nya terapier som kan sänka nefrotoxiciteten utan att förlora dödande effekt på cancerceller10.
På grund av denna nefrotoxiska effekt används cisplatin ofta som induktor för AKI i experimentella djurmodeller, som beskrivs framåt. Hos gnagare rapporterades den första AKI-modellen inducerad av cisplatin 197114, men för närvarande har många olika protokoll dykt upp med hjälp av dosberoende och kumulativa effekter av cisplatin15. Därmed, beroende på doseringen och antalet applikationer, olika grader av svårighetsgraden av njurskada kan induceras16,17,18,19,20,21. Den vanligaste metoden består av en intraperitoneal (dvs. injektion av en dos cisplatin följt av dödshjälp under de följande dagarna. I detta klassiska protokoll inducerar en enda hög nefrotoxisk dos cisplatin (10-13 mg/kg hos möss och/eller 3-8 mg/kg hos råttor) allvarliga histologiska förändringar, såsom förlust av penselkant och cellskräp inuti den rörformiga lumen, några dagar efter cisplatininjektionen. Svårighetsgraden av histologiska förändringar är dosberoende, och tecken på regenerering observeras 7 dagar efter cisplatininjektion16,17.
Även om gnagaremodeller är väletablerade, bestämde vi oss för att dra nytta av egenskaperna hos ett annat ryggradsdjur och fokuserade våra studier på zebrafisken (Danio rerio). Denna fisk har använts i stor utsträckning för modellering av mänskliga sjukdomar, på grund av dess lilla storlek, yttre befruktning, höga reproduktionshastigheter, snabb utveckling, transparens av embryon och larver, låg underhållskostnad, liknande anatomi som däggdjur (med vissa undantag), hög vävnadsregenereringskapacitet, socialt beteende, 70% av genetisk likhet med människor och 84% med mänskliga sjukdomar associerade gener22. Streisinger et al.23,24,25 startade studierna med zebrafisk som bekräftade genomförbarheten av att använda denna modellorganism för genetisk analys av ryggradsdjursutveckling. Inom njurforskningen har zebrafisken dykt upp inte bara i utvecklingsstudier utan också som ett genetiskt verktyg i sökandet efter nya gener kopplade till njurförhållanden26. Dessutom gör regenereringens kapacitet utan ärrbildning och förmågan att generera nephrons genom sitt liv, kallad neoneropogenes, zebrafisken till en viktig djurmodell för regenereringsforskning27,28. Dessutom visar tillgången till experimentella modeller för olika njursjukdomar, inklusive akut och kronisk njurskada, mångsidigheten hos denna experimentella organism26,29. Liksom hos däggdjur härleds zebrafiskens njure avkommare från mellanmsodermen. Sådana njure stamceller genererar pronephros som senare kommer att utvecklas till mesonephros, som kommer att upprätthållas som ett moget organ fram till vuxen ålder29,30.
Den vuxna zebrafisk njuren ligger på kroppens ryggvägg, mellan simblåsan och ryggraden29. Ur ventral vy kan zebrafisken segmenteras i tre regioner (Figur 1A): huvud (H), stam (Tr) och svans (Ta)29. Samma som däggdjur har zebrafisken nephrons som funktionella enheter av njuren, som är indelade i tubulesegment (Figur 1A): njurkorpuskel (RC), proximal invecklad tubule (PCT), proximal rak tubule (PST), distala tidigt (DE), sen distala (DL) och samlande kanal (CD)29. Zebrafisk delar genetisk bevarande och strukturella likheter med mänskliga nephrons(figur 1B) men saknar vissa konformationer som mellantunnan, även känd som slingan av Henle (LH)29,31. Sötvattenfiskar som zebrafisk är normalt omgivna av ett medium med mycket låg osmolaritet, på grund av detta tenderar de att vara hyperosmotiska och beror på gälarna, huden i tidiga skeden och njuren för att reglera osmolaritet och vattenutsöndring32. Filtreringen av blod från dorsala aorta av pronephros börjar cirka 48 h efter befruktning (hpf)33,34. Zebrafiskens njure är inte bara ett utsöndringsorgan för metaboliskt avfall utan fungerar också som ett hematopoetiskt organ från 4 dagar efter befruktning (dpf) till vuxen ålder och det motsvarar benmärgen hos däggdjur35. Under utvecklingen kommer hematopoetiska stamceller (HSCs) att så njure, självrenovera och generera myeloiska, erytopoid- och lymfoida cellstammar, upprätthålla transkriptionsfaktorer, signalera molekyler och mycket bevarade genetiska program med däggdjur36,37. Studier har visat att de flesta erytrooida, trombocytiska, myeloiska och lymfoida celler i det mänskliga immunsystemet finns i zebrafisk37,38. De unika egenskaperna hos detta djur och de bevarade funktionerna med den mänskliga njuren gjorde denna modellorganism fördelaktig i forskningen om njurfunktion, skada och regenerering.
Även om zebrafiskens njure är väl studerade och vissa modeller av AKI redan finns tillgängliga i larva och vuxna zebrafisk28, vid tidpunkten för upprättandet av detta protokoll fanns det inga bevis för en kemiskt inducerad icke-antibiotisk AKI-modell hos vuxna zebrafiskar. Utöver detta fokuserar vårt laboratorium på att testa probiotiska bakterier och mikrobiota-härledda föreningar för att studera regenerering och njurskador, vilket innebär att vi koncentrerade våra ansträngningar för att skapa en ny cisplatininducerad AKI-modell hos vuxna fiskar. Videoartikeln som presenteras i detta manuskript visar förfarandena för en ny modell av AKI-induktion med en i.p. injektion av 120 ug cisplatin per g djur (120 μg/g) (Figur 2A). Denna dos baserades ursprungligen på studier av AKI inducerad av cisplatin i murinmodeller som gick runt 10 mg/kg (motsvarande 10 μg/g)14,15,16,17, men denna dos var inte tillräcklig för att inducera njurskador relaterade till nefrotoxicitet (data som inte visas). Således ökade vi dosen till de som används i denna studie (Figur 2B). Vårt arbete visade en dosberoende effekt av cisplatin i överlevnad efter injektion med induktion av njurvävnad skada 24 hpi som visas av förlust av tubular struktur, ökad inflammatorisk infiltrate och hög grad av celldöd. Här beskriver vi två tekniker för att analysera utvecklingen av cisplatin-inducerad AKI: flöde cytometri, att analysera cell infiltration, och TUNEL, att mäta celldöd. Flödescytometri är en teknik som mäter cellernas fysiska (storlek och granularitet) och kemiska (fluorescerande föreningar). Inuti cytometern löper cellupphängningen genom en mantelvätska som organiserar cellerna i en enda linje, så att de kan passera genom en laserstråle en cell i taget (figur 3A). En detektor framför ljusstrålen mäter FSC (Forward Scatter), som korrelerar med cellstorlek, och detektorer åt sidan mäter sidospridningen (SSC) som korrelerar med cellernas granularitet. Andra detektorer mäter fluorescensen från partiklar, fluorescerande proteiner eller antikroppsmärkta celler39,40. Eftersom kommersiella antikroppar för zebrafisk är knappa nuförtiden, tillåter användningen av djurreportrar och fluorescerande biomarkörer att förbättra denna analys och identifiera olikacellpopulationer 41,42,43. Ett annat verktyg som användes i detta protokoll var Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick End Labeling (TUNEL) analys. TUNEL-analysen är en metod för att upptäcka apoptos i sent skede som förlitar sig på TdT:s förmåga att identifiera fragmenterat DNA och märka det med deoxynukleotider märkta med en fluorescerande markör som senare kan visualiseras och kvantifieras medmikroskopi 44 (figur 3B). Med tanke på att en av de mest slående egenskaperna hos AKI är induktion av apoptos i rörformiganjurceller 3, är denna teknik extremt fördelaktig eftersom den kan analyseras av flödescytometri och / eller mikroskopi.
De metoder som presenteras i denna artikel gör det möjligt att observation av AKI-status och erbjuda en ny akut modell för att studera AKI-störningar som kan vara användbara för forskning av nya terapeutiska mål i cisplatin-relaterade AKI.
Förekomsten av njursjukdom har fortsatt att öka över hela världen och blivit ett globalt folkhälsoproblem som påverkar miljontals människor63. Att hitta ett sätt att behandla njurskadade individer är av största vikt samt förstå mer om deras etiologi och progression. Flera studier har använt djurmodeller för att förstå njurskador. Zebrafisk njuren (Figur 1) har studerats i flera år i utvecklingsbiologi och skadeforskning på grund av dess självgenererande kapacitet och genetiska likhet29,64. Här presenterar vi en ny AKI-modell i vuxna zebrafiskar med cisplatins egenskaper som ett nefrotoxiskt medel, som beskriver stegen för att uppnå en snabb och akut reaktion med synliga skador så snart som 24 hpi (Figur 2). Dessutom förklarar vi här två tekniker som hjälper till att utvärdera vävnadsskadan efter cisplatininjektionen, flödescytometri och TUNEL (Figur 3).
Nuvarande AKI-modeller hos vuxna zebrafisk inkluderar i.p. injektion av gentamicin som inducerar omfattande skador i nephron och tubule förstörelse, neonephrogenesis händelser börjar från dag 5, och regenerering avslutas med 21 dagar efter injektion65. Å andra sidan fastställdes en modell av sepsis-associerade akut njurskada (S-AKI) av infektionen med Edwardsiella tarda, eftersom avsevärt ökade uttrycket av AKI-markörer, såsom insulinliknande tillväxtfaktorbindande protein-7 (IGFBP7), vävnadshämmare av metalloproteinaser 2 (TIMP-2) och njurskada molekyl-1 (KIM-1), i larver och vuxnazebrafiskar 66. Zebrafisken är känd för att vara ett höggenomströmningsdjur för sökning av terapeutiska medel och detta inkluderar användning av probiotika och mikrobiota-härledda metaboliter för att studera njurfunktion och regenerering67. De tillgängliga modellerna kan dock direkt påverka resultatet av dessa behandlingar. Således etablerade vi en annan metod för att inducera AKI hos vuxna zebrafiskar (Figur 4), med cisplatin som ett känt nefrotoxiskt medel som inte skulle ha direkta kända effekter på fiskens mikrobiota, liksom gentamicinmodellen för att vara ett antibiotikum, eller infektionen med E. tarda, för att vara en sepsismodell. Men samtidigt som vi utvecklade vårt cisplatinprotokoll undersökte en annan grupp också de nefrotoxiska effekterna av cisplatin hos vuxna zebrafiskar, vilket förenklade dosen till 10-20-30 μg per djur68. Även om de också visade cisplatin dosberoende effekt i överlevnad, rekommenderar vi försiktighet vid användning av en enda mängd cisplatin för alla fiskar, eftersom zebrafisk från samma ålder kan ha mycket olika storlekar och vikt och detta kan inducera variationer i resultaten69,70. Vi tycker att det är viktigt att justera dosen till djurets motsvarande vikt, som görs hos möss och denna studie.
I våra experiment med vuxna zebrafiskar visade cisplatin en dos-respons effekt. Detta visualiserades genom övervakning av djurens överlevnad efter cisplatininjektion (figur 5). Vi använde överlevnad som ett sätt att uppskatta intensiteten i dosen av cisplatin och inte som ett mått på nefrotoxicitet, eftersom inget annat fysiskt tecken är synligt under övervakningstiden. Detta kan vara jämförbart med gnagare, där svårighetsgraden av njurskadan kan moduleras genom doseringen och frekvensen av cisplatininjektion15, vilket uppnår dödliga doser med högre koncentrationer av cisplatin71. Död ses också under de följande dagarna i larvmodellen av cisplatin72. Eftersom vårt mål var att inducera en akut skada på några dagar, valde vi 120 μg/g dos cisplatin som möjligt för att observera njurskador 24 h efter injektionen, men detta kan justeras beroende på studiens mål.
Hos människor diagnostiseras AKI kliniskt av minskad glomerular filtreringshastighet (GFR), förhöjt serum kreatinin och blod urea kväve3. I zebrafisk innehåller repertoaren av AKI-modeller några genetiska villkorligamodeller 73,74 och vissa läkemedelsrelaterade modeller65,72, men eftersom några av AKI-funktionella parametrar inte kan mätas på zebrafisk på grund av tekniska svårigheter(t.ex. blodsamling), antar de flesta forskning morfologiska och visuella tekniker för att observera funktionerna i AKI1,75 som vår studie.
Hos gnagare kommer cisplatin in i epitelcellerna i de proximala och distala tubulerna, inuti cellen genomgår metabolisk aktivering och blir mycket reaktivt på cellorganeller och inducerar förändringar i cellstrukturen. Dessa förändringar kan inducera apoptos och autofagi och till och med nekros, vid mycket höga doser. Som svar på denna skada frigörs många cytokiner och leukocyter rekryteras vilket leder till inflammation och påverkar organets funktionalitet15. Detta belyser vikten av att bedöma vilken typ av celler som finns i den skadade njuren, som invånare eller infiltrerade immunceller. Här visade vi hur man bedömer detta genom flödescytometri, med hjälp av de transgena immunreporterlinjer som finns tillgängliga nuförtiden (Tabell 1). Cisplatin ökade andelen neutrofiler(mpo:GFP-positiva celler) i njuren 24 timmar efter injektionen (figur 6). När det gäller zebrafisken är njuren nischen av HSCs som ger upphov till olika blodcellstyper. Ändå cirkulerar många granulocyter och makrofager normalt i blodet. I vårt exempel använde vi mpo: GFP transgen linje som uttrycker GFP under promotorn av myeloperoxidas av neutrofiler52. Originalstudier av mpo:GFP transgen linje visade uttryck för myeloperoxidase i olika tillstånd av neutrofil mognad76 men vår gate strategi fokuserade på granulocyt fraktionen som består av mogna celler som kommer från blodet52, på så sätt vår analys inkluderar infiltrerade celler och inte bosatta celler. Detta är viktigt att tänka på när man isolerar önskad cellpopulation.
Som förklarats ovan är apoptos den mest klassiska markören för cisplatin-relaterade AKI. Här demonstrerade vi ett enkelt protokoll för lokalisering av döda celler genom TUNEL-analysen. Cisplatininjektion ökade antalet apoptotiska celler 24 hpi (figur 7). Detta kan lätt kvantifieras genom att direkt räkna de döda cellerna från vävnaden. För identifiering av cellspecifik död kan dock användning av antikroppar mot önskad cell(t.ex. rörceller) eller användning av en transgen reporterlinje användas tillsammans med denna teknik. Jämfört med den gentamicin-inducerade modellen av AKI, cisplatin verkar vara en allvarligare modell, eftersom gentamicin apoptos var högre den tredje dagen efter injektion65.
Trots att ha en mängd olika biverkningar, cisplatin används fortfarande i stor utsträckning i cancer terapi, på grund av dess effektivitet mot olika typer av cancer, inklusive carcinom, könsceller tumörer, lymfom, och sarkom77. Nefrotoxicitet förekommer hos en tredjedel av patienterna i behandling med cisplatin10, vilket innebär att sökandet efter strategier som kan minska denna effekt och öka avrotningen är absolut nödvändigt. Vi tror att de metoder och tekniker som presenteras i detta manuskript kommer att bidra till att belysa mekanismer för njurskada och hitta terapeutiska mål som kan vara avgörande för att förbättra livskvaliteten för individer som lider av njurkomplikationer, främst de som är relaterade till användningen av cisplatin.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (2015/21644-9; 2017/05264-7; 2017/05687-5; 2018/20722-4), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) och Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), finansiell kod 001. Vi tackar våra medarbetare vid Laboratoriet för Maria Rita dos Santos e Passos-Bueno’s och Zebrafish Facility of the Genetics and Evolutionary Biology Department, vid Bioscience Institute vid Universitetet i São Paulo. Vi tackar Cristiane Naffah de Souza Breda och Theresa Raquel de Oliveira Ramalho för kommentarerna och förslagen om manuskriptet. Vi uppskattar och tackar Marcio Villar Martins, från multimediateamet vid Institute of Biomedical Sciences, för inspelningen, utgåvan och produktionen av denna video.
1x PBS | Made by diluting 10 X PBS (prepared in lab) in distilled water | ||
31 G 1.0 cc insulin syringe | BD Plastipak | 990256 | Needle: BD Precision Glide 300110 |
3.5 L Fish tank | Tecniplast | Part of the aquactic system | |
6 well plate | Corning | 351146 | |
10 mM Tris/HCl | Prepared from solid Tris Base (Promega, H5135), adjusted to pH 7.4-8 with HCl (Merck, 1003171000) | ||
50 ml Falcon tube | Corning | 352070 | |
2-3% Agarose | Invitrogen | 16500-500 | Dissolve 2 or 3% agarose (w/v) in 1x PBS, warm until dissolve. |
2% FBS | Gibco | 12657-09 | Dilute 2% (w/v) directly in 1x PBS |
4% Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Dissolve 4% PFA (w/v) in warm 1x PBS, mix until dissolve in a hot plate in a fume hood. Aliquot and store at -20 °C |
50% Ethanol | Made by diluting 100% ethanol in distilled water | ||
70% Ethanol | Made by diluting 100% ethanol in distilled water | ||
90% Ethanol | Made by diluting 100% ethanol in distilled water | ||
100% Ethanol | Synth | 00A1115.01.BJ | |
100% Xylene | Synth | 00X1001.11.BJ | |
Cell strainer 40 µm | Corning | 431750 | |
Cisplatin | Blau Farmacêutica | 16020227 | C-PLATIN 1 mg/mL. Store at room temperature. |
Cork board sheet | Obtained from local stationary store | ||
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Stock solution 20 mg/ml dissolved in water |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Flow cytometry tubes | Corning | 352052 | |
Glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
Histology cassette | Ciencor | 2921 | |
Immuno stain chamber | Ciencor | EP-51-05022 | |
Incubator | NAPCO | 5400 | Set to 37 °C |
Insect pins | Papillon | Model micro15x20 | |
In Situ Cell Death Detection Kit | Roche Diagnostics | 12156792910 | |
Metal mold | Leica Biosystems | 3803081 | |
Micropipette 200-1000 µL | Eppendorf | Use 1 mL tips | |
MS-222 (Tricaine) | Fluka Analytical | A5040-25G | |
NaCl 0.9% | Synth | C1060.01.AG | Dissolve 0.9% NaCl (w/v) in distilled water |
Nail polish | Prefer transparent | ||
Neubauer chamber | Precicolor HGB | ||
Pasteur plastic pipet | United Scientific Supplies | P31201 | |
Paraplast | Sigma-Aldrich | P3558 | |
Petri dish | J.ProLab | 0307-1/6 | 60 and 100 mm |
Plastic spoon | Obtained from local store | ||
Proteinase K | New England BioLabs | P8102 | Diluite from stock 20 mg/ml |
Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Scalpel blade | Solidor | ||
Sponge | Obtained from local store | ||
Trypan Blue | Cromoline | 10621/07 | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Cytometer | BD Biosciences | FACSCanto II | |
Fluorescence Stereoscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
Fluorescence Microscope | Zeiss | AxioVert.A1 | |
Microtome | Leica | Jung Supercut | |
Scale | Ohaus Corporation | AR2140 |