Summary
نحن نصف إجراءات عزل البويضات المتنامية من بصيلات المبيض في المراحل المبكرة من التطور ، وكذلك إعداد نظام ثقافة في المختبر يمكن أن يدعم النمو والتمايز حتى المرحلة الكاملة النمو.
Abstract
يمثل الاحتياطي المحدود من البويضات الناضجة القابلة للتخصيب عائقاً رئيسياً أمام نجاح التكاثر المساعد في الثدييات. وبالنظر إلى أنه خلال فترة الحياة الإنجابية فقط حوالي 1٪ من البويضات في المبيض الناضجة والاباضة، وقد تم تطوير العديد من التقنيات لزيادة استغلال احتياطي المبيض لأعداد متزايدة من بصيلات غير مبيضة. وقد سمحت هذه التكنولوجيات بالتدخل في مجال المحافظة على الخصوبة، وبرامج الاختيار في الثروة الحيوانية، وحفظ الأنواع المهددة بالانقراض. ومع ذلك، فإن الإمكانات الهائلة لاحتياطي المبيض لا تزال غير مستغلة إلى حد كبير. ففي الأبقار، على سبيل المثال، بذلت بعض المحاولات لدعم الثقافة المختبرية للبويضات في مراحل نمو محددة، ولكن لم يتم بعد وضع بروتوكولات فعالة وموثوقة. هنا نحن وصف نظام الثقافة التي تستنسخ الظروف الفسيولوجية للمرحلة المسامية المقابلة، التي تعرف لتطوير في المختبر تزايد البويضات التي تم جمعها من بصيلات الأنطلية الأبقار في وقت مبكر إلى مرحلة نمت بالكامل، المقابلة لبصيلات النمل المتوسطة في الجسم الحي. تم استخدام مزيج من الهرمونات ومثبط phosphodiesterase 3 لمنع استئناف meiotic في وقت غير مناسب وتوجيه التمايز البويض.
Introduction
خلال فترة الحياة الإنجابية، يتم إطلاق جزء ضئيل فقط من البويضات الموجودة في المبيض الناضج، في قناة فالوب عند الإباضة، وتتوفر للتخصبات والتطور إلى جنين قابل للحياة1. من ناحية أخرى، فإن معظم البويضات داخل المبيض تخضع للضجر ولا يتم الإباضة أبداً. في المختبر إنتاج الجنين (IVP) التكنولوجيات قد حاولت زيادة استغلال احتياطي المبيض2,3. وقد سمحت هذه التكنولوجيات حتى الآن بالتدخل في مجال المحافظة على الخصوبة، وبرامج الاختيار في الثروة الحيوانية، وحفظ الأنواع المهددة بالانقراض. ومع ذلك، فإن معظم البروتوكولات تستخدم البويضات التي أكملت أساسا مرحلة النمو داخل بصيلات المبيض الأنتال، وبالتالي يشار إليها على أنها البويضات المزروعة بالكامل. في الماشية، حيث تستخدم تقنيات IVP على نطاق واسع، البويضات المزروعة بالكامل تصل إلى قطرها النهائي من حوالي 120 ميكرومتر ويتم جمعها من بصيلات التي تمتد من 2 إلى 8 ملم في القطر (بصيلات النمل المتوسط)1. عند العزل من بصيلات، والبويضات مثل في المختبر نضجت وتخصيب. ثم يتم استزراع الزيجوت حتى مرحلة الكيسة الأرومية ونقلها إما إلى مستلم أو إلى المبرد. في الماشية، وكذلك في العديد من الأنواع الأخرى، على الرغم من الإمكانات التي تقدمها IVP، لم يتحسن عدد الجنين في المختبر لكل بقرة بشكل كبير على مدى السنوات ال 40 الماضية. ويرجع ذلك جزئيا إلى العدد المحدود من البويضات المزروعة بالكامل التي تملأ المبيض في وقت معين والتي يمكن استردادها وإخضاعها لتقنيات IVP القياسية4،5،6.
البويضات المغلقة داخل بصيلات النملية المبكرة، أي تلك الجريبات التي تقل عن 2 مم في القطر، تمثل مصدراً محتملاً لاستخدامها في برامج الحفاظ على الخصوبة7 ، كما يحتوي المبيض تقريباً على 10 مرات أكثر من بصيلات الأنترال المبكرة من متوسطة8. ومع ذلك، هذه البويضات لا تزال في مرحلة النمو ولم تصل بعد المرحلة نمت بالكامل9. على هذا النحو، فإنها لا تزال نشطة النسخي، وإنتاج mRNAs التي سيتم تخزينها للخطوات التنموية في وقت لاحق، ولم تخضع بعد كل عملية التمايز المطلوبة لمنح البويضات مع القدرة على استئناف تلقائيا واستكمال meiosis أنا معزولة مرة واحدة من المقصورة الجريبي10،11. ولذلك، لا يمكن تقديمها مباشرة إلى بروتوكولات النضج في المختبر القياسي (IVM)، ولكنها تتطلب فترة إضافية من الثقافة تسمح لهم بإكمال مرحلة النمو والتمييز بشكل صحيح.
الانتقال من مرحلة النمو إلى مرحلة كاملة النمو، والتي تحدث في الماشية عندما يتطور الجريبات من أوائل النمل إلى المرحلة الأنرال المتوسطة، هي واحدة من الخطوات الحاسمة خلال التنمية البويضية. في الماشية، حاولت عدة دراسات لتكبيل هذه الأحداث في المختبر2،12،13،14،15،16،17،18،19. بيد أنه لم يتم حتى الآن وضع بروتوكولات موثوقة ولم يُبلّغ عن سوى نجاح محدود. وفقا للدراسات السابقة20, هذه البويضات المتنامية تشكل سكان متجانس. بالإضافة إلى كونها نشطة بشكل نسخي ، يتم تفريق chromatin في vesicle الجرثومي (GV) ، في تكوين يسمى GV02،21. وعلى العكس من ذلك، فإن عدد البويضات المزروعة بالكامل التي تم الحصول عليها من بصيلات النمل المتوسطة أكثر تجانساً، وهي حالة تعكسها درجات مختلفة من ضغط الكروماتين (GV1 وGV2 وGV3) التي يمكن ملاحظتها20. من بين هذه البيانات السابقة أظهرت أن GV2 وGV3 بويضات تتميز عموما من نوعية أفضل وأعلى كفاءة النمو الجنينية20,21,22,23,24.
بدءا من الملاحظات المذكورة أعلاه، هنا نحن وصف نظام ثقافة طويلة 5 أيام من البويضات (L-IVCO) التي تسمح للتمايز من البويضات معزولة كمجمعات الزلق cumulus-oocyte (COCs) من بصيلات الانطلية المبكرة. وقد تطورت هذه الاستراتيجية ثقافة من 10 سنوات دراسات طويلة أجريت في مختبرنا وجذور أرضها على تطوير سابقا 24-48 ساعة في ثقافة البويضات في المختبر (IVCO)2, نظم الخداج23,,25 والزنك خلال ثقافة البويض. مزيج من هرمون تحفيز بصيلات (FSH) و phosphodiesterase-3 (PDE3) المانع, قادرة على تعزيز cumulus-بويضة الاتصال2, منع استئناف meiotic في وقت غير مناسب2, ودعم نمو البويضات2 تم استخدامها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم جمع المبيضين من 4 إلى 8 سنوات من العمر هولشتاين الأبقار الحلوب تعافى في المسلخ المحلية (INALCA S.p.A. ، أوسبيداليتو لودجيانو ، LO ، IT 2270M CE ، إيطاليا).
1- إعداد وسائط الإعلام
ملاحظة: يجب أن تكون كافة الوسائط تحضير أربع ساعات على الأقل قبل الاستخدام. يتم احتضان الوسائط الاحتياطية بيكربونات الصوديوم في 38.5 درجة مئوية و 5٪ CO2 في الهواء، والرطوبة القصوى. يتم الحفاظ على وسائل الإعلام التي تعمل بالتخزين المؤقت للـ HEPES عند 38.5 درجة مئوية في فرن الحرارة.
- ثقافة طويلة في المختبر من البويضات (L-IVCO) المتوسطة
- إعداد 15 مل من المتوسط الأساسية للثقافة (M199-B): ملحق M199 مع 2 mM الجلوتامين، 0.4٪ الأحماض الدهنية الحرة الأحماض البوفين المصل الألبومين (BSA)، 0.2 mM بيروفات الصوديوم، 25 mM بيكربونات الصوديوم، 0.1 mM سيثيمين، 21.3 ميكروغرام / مل من الفينول الأحمر، 75 ميكروغرام / مل من كاناميسين و 4٪ بولي فينيلبييروجليدون (PVP؛ 360 ك الوزن الجزيئي).
- إعداد 3 مل من المتوسط عقد (M199-H): إلى M199-B إضافة 5 μM cilostamide وصبه في طبق بيتري 35 ملم.
- إعداد متوسط L-IVCO (M199-L): ملحق M199-B مع 0.15 ميكروغرام / مل زن كبريتات، 10-4 وحدة دولية / مل FSH، 10 نانوغرام / مل استراديول، 50 نانوغرام / مل التستوستيرون، 50 نانوغرام / مل البروجسترون و 5 ميكروم Cilostamide.
- ضع 200 ميكرولتر من M199-L المتوسطة في كل بئر من 96 لوحة مغلفة بشكل جيد. ملء الآبار في الحواف الأربعة من لوحة مع المياه الثقافة العقيمة للتعويض عن التبخر والحفاظ على الرطوبة المناسبة أثناء الثقافة.
- احتضان لوحة 96 بئر ومتوسطة M199-H في الحاضنة عند 38.5 درجة مئوية و 5٪ CO2 في الهواء، والرطوبة القصوى.
- تشريح المتوسطة
- إعداد وسيلة تشريح (M199-D): ملحق M199 مع 0.4٪ BSA الكسر الخامس، 0.164 mM البنسلين، 0.048 mM ستريبتوميسين، 1790 وحدة/ L الهيبارين. M199-D يمكن أن تكون مستعدة بكميات كبيرة، وصرفها في 20 مل aliquots وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 6 أشهر. عند الحاجة، دافئة وتكملة 1 aliquot.
- إعداد 20 مل من M199-D تكملة مع 5 μM cilostamide (M199-D cilostamide).
2. جمع المبيض ومعالجته
ملاحظة: تجري جميع الإجراءات في درجة حرارة الغرفة (26 درجة مئوية) ما لم يذكر خلاف ذلك.
- استرداد المبيضين في المسلخ من الأبقار.
- ضع المبيضين في ملح ملحي معقّم (NaCl, 9 g/L) في 26 – 28 درجة مئوية مضافة مع البنسلين 100 U/mL وstreptomycin 0.1 ملغ/مل.
- نقل الأعضاء إلى المختبر في المالحة المعقمة الدافئة في غضون 4 ساعات.
- اغسل المبيضين 4x في محلول ملحي معقمة يتم الحفاظ عليه عند 26 درجة مئوية.
- إزالة جميع بصيلات النمل المتوسطة إلى الكبيرة عن طريق التعرق جميع بصيلات أكثر من 2 ملم في القطر باستخدام إبرة 18 G متصلة بمضخة طموح مع ضغط فراغ تعيين في -28 مم زئبق ووضع المبيضين المستنشق في beaker مع المالحة العقيمة في 26 درجة مئوية.
ملاحظة: إزالة محتوى الجريبات > 2 ملم هي خطوة حاسمة لإزالة أكبر قدر ممكن من مصدر البويضات المزروعة بالكامل التي من شأنها أن "تلوث" التجربة. - تحت غطاء تدفق الفقار الأفقي، ضع مبيض واحد في ذلك الوقت على لوحة تقطيع ثلاثية الفلورو العقيمة. باستخدام شفرة جراحية رقم 22 مثبتة على مقبض مشرط، وقطع شرائح من قشرة المبيض (الجزء الخارجي من المبيض، الذي يحتوي على بصيلات)، 1.5 – 2 مم سميكة ومتوازية مع المحور الرئيسي للجهاز.
- ضع شرائح قشرة المبيض في طبق بيتري زجاجي معقمة مغطى بتشريح المتوسطة على طبق دافئ عند 38.5 درجة مئوية.
ملاحظة: من الآن فصاعدا يتم تنفيذ جميع الإجراءات في 38.5 درجة مئوية باستخدام لوحة دافئة.
3- اختيار الحويصلات وعزلها واسترجاعها
- ضع شريحة قشرة المبيض في طبق بيتري زجاجي 60 مم مع 2-3 مل من M199-D.
- باستخدام مجهر تشريح، حدد الجريبات بين 0.5 – 2 مم باستخدام العدسة المجهزة بالميك ميكرومتر.
- تحديد بصيلات صحية غير اترتيك تحت منظار الميكروسكوب. تقييم اتريسية بصيلات عن طريق مراقبة المعلمات المورفولوجية، مثل مظهر شفاف واضح جدا، مع COC الظلام داخل. تجاهل بصيلات الاترتيك ومعالجة جميع الآخرين.
- باستخدام شفرة جراحية رقم 22 مثبتة على مقبض مشرط إزالة أنسجة المبيض المحيطة بصيلات على جانب واحد حتى يتم كشف الجريبات على حافة واحدة.
- باستخدام إبرة 26G التي شنت على حقنة، وجعل بعناية شق في جدار المسام المكشوفة. هذا الإجراء سوف الافراج عن محتوى الجريبي، التي تتألف من COC، السائل الجريب وكتل من الخلايا.
- تحديد COC تحت المجهر وفحص سلامة الركام، وسلامة زونا pellucida والتجانس من السيتوبلازم. إذا تم استيفاء هذه المعايير، استلهم COC باستخدام ماصة P20.
- ضع COC المعزول في سيلوستاميد M199-D.
- مواصلة إجراء العزل لمدة 30 دقيقة.
4- اختيار اللجان المشتركة التي ستخضع للثقافة في المختبر
- تحت مجهر التشريح، حدد COCs صحية استناداً إلى المعايير في الخطوة 3.6.
- في طبق بيتري 60 مم، إعداد 16 قطرات من 20 ميكرولتر من سيلوستاميد M199-D ووضع واحد COC صحية لكل قطرة(الشكل 1A).
- باستخدام مجهر مقلوب تعلق على الكاميرا قياس قطر البويضة، باستثناء pellucida زونا، وذلك باستخدام البرنامج المقدمة مع الكاميرا.
- مع تصور واضح من البويضة، وجعل اثنين من القياسات عمودي باستثناء pellucida زونا (الشكل 1B).
- التأكد من ما إذا كان متوسط قياس البويضة اثنين، باستثناء pellucida زونا، هو ضمن نطاق 100 - 110 ميكرومتر. تجاهل COCs مع بويضة غير مدورة على شكل أو مع البويضات التي لا يمكن قياسها.
- نقل COCs المختارة في طبق 35 مم يحتوي على متوسط M199-H والاحتفاظ بها في الحاضنة عند 38.5 درجة مئوية و 5٪ CO2 في الهواء، والرطوبة القصوى حتى الخطوة 5.1.
- كرر الخطوتين 3 و4 حتى 4x. يجب ألا يتجاوز إجمالي وقت العمل 2 ساعة.
5. ثقافة طويلة في المختبر من البويضات (L-IVCO)
- نقل COC واحد في بئر في وسط بئر من 96 بئر لوحة ليتم إعدادها في الخطوة 1.1.5.
- احتضان لوحة لمدة 5 أيام في 38.5 درجة مئوية و 5٪ CO2 في الهواء، والرطوبة القصوى.
- كل يومين (يومين و 4) تحضير M199-L الطازجة كما هو موضح في الخطوة 1.
- تجديد نصف المتوسط عن طريق إزالة 100 ميكرولتر من المتوسط واستبدالها بـ 100 ميكرولتر من M199-L الطازجة. قم بإجراء التجديد المتوسط تحت منظار الميكروكروسكوب وتجنب تحريك الـ COCs إلى البئر.
6. تصنيف COC بعد الثقافة
- في نهاية L-IVCO، تحليل مورفولوجيا COCs تحت مجهر تشريح.
- تصنيف كما هو مبين في الشكل 2.
- تصنيف الفئة 1 إذا COCs إظهار الاستثمار خلية cumulus مضغوط مع أي علامة على التوسع cumulus وانحطاط الخلية.
- تصنيف الفئة 2 إذا COCs إظهار الاستثمار خلية cumulus المدمجة مع عدم وجود علامة على التوسع وانحطاط الخلايا والخلايا مع تشكيل يشبه antrum في كتلة cumulus.
- تصنيف الفئة 3 إذا COCs تظهر عدة طبقات من خلية الكومبلوس مع عدم وجود علامة على التوسع cumulus وبعض الخلايا المصنفة في الطبقة الخارجية من خلايا الكامولو ولا تشكيل يشبه النوب.
- تصنيف الفئة 4 إذا COCs يظهر فقدان وفير من الخلايا الركام تمتد لأكثر من 50٪ من سطح البويضة، وعلامات انحطاط الخلية والحطام الخلية.
7. تقييم التطور الميوتي بعد الثقافة
- بويضة البويضات
- ضع كل COC في بئر واحد من لوحة رباعية الآبار تحتوي على 400 ميكرولتر من 199D لكل بئر.
- تحت مجهر تشريح بلطف إزالة خلايا الركام ميكانيكيا عن طريق الأنابيب المتكررة باستخدام ماصة تعيين في 130-140 μL.
- مرة واحدة البويضات خالية من الاستثمار cumulus، ونقلها إلى بئر آخر يحتوي على 199D.
- كرر العملية حتى يتم اغراس جميع البويضات تماما.
- بويضة نووية
ملاحظة: من الآن فصاعدا يتم تنفيذ جميع الإجراءات في درجة حرارة الغرفة. الكواشف في درجة حرارة الغرفة.- إصلاح البويضات في paraformaldehyde 4٪ في المالحة العازلة الفوسفات (PBS) لمدة 1 ساعة.
تنبيه: ارتداء معدات الحماية الشخصية عند التعامل مع شبه الأشكال والتخلص من المواد الملوثة وفقًا للمبادئ التوجيهية للتخلص من النفايات الخطرة. - غسل البويضات 3x لمدة 5 دقائق كل في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ بولي فينيللكوهول (PVA).
ملاحظة: يمكن معالجة العينات على الفور أو تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة أقصاها أسبوع واحد. - ضع البويضات في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ تريتون X لمدة 10 دقيقة.
- غسل البويضات 3x لمدة 5 دقائق كل في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ PVA.
- وضع البويضات بشكل فريد في قطرات من 5 ميكرولتر من antifade المتوسطة تكمل مع 4'، 6-diamidino-2-فينيليندول (DAPI) dilactate (1 ميكروغرام / مل) على شريحة.
- ضع شريطين من الشريط على الوجهين على طول الجانبين الطويلين للشريحة، لتجنب التسطيح المفرط للبويضات عند وضع زلة الغطاء على القمة.
- ضع زلة الغطاء على القمة ، وجعلها تلتزم الشريط والاحتفاظ بها في الظلام أثناء معالجة جميع العينات.
- تحليل البويضات باستخدام المجهر epifluorescence التقليدية مجهزة مرشحات DAPI (الإثارة / الانبعاث: 358/461) لتقييم التقدم meiotic من البويضات.
- تصنيف البويضات وفقا لتقدمها meiotic: GV - البويضات مع درجات مختلفة من التكثيف الكروماتين داخل GV; MI – البويضات من GV كسر وصولا الى ميتافاسي I; ومنحط – البويضات التي لا يمكن تحديدها على أنها في أي من المراحل السابقة.
- إصلاح البويضات في paraformaldehyde 4٪ في المالحة العازلة الفوسفات (PBS) لمدة 1 ساعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في نهاية L-IVCO، تغير التشكل الإجمالي لCOCS وتم تحديد 4 فئات بناءً على مظهر خلايا الركام، كما هو موضح في الشكل 2. استنادا إلى المعايير المورفولوجية التي اعتمدت عادة لاختيار COCs صحية11,26,,27, الفئة 1, 2 و 3 واعتبرت صحية, في حين أن الفئة 4, التي أظهرت علامات واضحة على انحطاط مثل عدم وجود طبقات كاملة من خلايا الكامولو المحيطة البويضات, اعتبرت شديدة الشبه وغير مناسب للخضوع لإجراءات المصب في إعداد IVP المحتملين. وبشكل عام، تم تحليل 74 بويضة في 5 بويضات بيولوجية، منها 9.45% في الفئة 4 وتم التخلص منها من التقييم الإضافي.
وكما هو مبين في الشكل 3 والشكل 4،أظهر تقييم المرحلة النيائية في نهاية L-IVCO أن نسبة أعلى بكثير من البويضات (78.57 ± 4.43%) بقي القبض عليه في مرحلة غير ناضجة، مع الكروماتين لا تزال محاطة داخل GV (لذلك، يشار إليها أيضا باسم مرحلة GV)، دون انحطاط. وكان 59.43 في المائة من بينها في شكل GV2/3. واستأنفت نسبة صغيرة meiosis الوصول إلى المرحلة ميتافاس I (13.76 ± 5.85٪) أو منحط (7.67 ± 4.61٪). وعموما، تم تحليل 67 بويضة في 5 نسخ بيولوجية. بالإجمال يشير هذا معطيات أنّ ال L-IVCO ثقافة يساند الزّوّة حيوية بينما يمنع استئناف meiotic ل 5 أيام.
الشكل 1: مخطط الطبق المستخدم لقياس قطر البويضة والصورة التمثيلية لـ COC. (أ)تمثيل تخطيطي لطبق بيتري 60 مم مع 16 قطرات من 20 ميكرولتر من M199-D، كل واحد يحتوي على COC واحد. (B) صورة تمثيلية لـ COC مع المحور المستخدم لقياس القطر. لاحظ أن zona pellucida غير متضمن. مقياس شريط 50 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور تمثيلية لـ COCs في وقت جمعها وبعدها. (أ، ب، ج، د) يمثل الصف العلوي (مجموعة) COCs في وقت الاسترداد. (أ' ، ب ' ، ج ' ، دال ') نفس COC هو في الصورة 5 أيام في وقت لاحق، في نهاية L-IVCO وتصنف كما ذكرت في الخطوة 6.1. يمثل الصف السفلي (5 أيام) COCs المصنفة على النحو: الفئة 1، والتي تظهر استثمار خلية cumulus المدمجة مع عدم وجود علامة على التوسع وانحطاط الخلية (A')؛ الفئة 2، تظهر استثمار الخلايا الركامية المدمجة مع عدم وجود علامة على التوسع وانحطاط الخلية ومع تشكيل يشبه النوب (السهام) في كتلة الركام (B')؛ الفئة 3، تظهر عدة طبقات من خلية الكامولوليس مع عدم وجود علامة على توسع الركام وبعض الخلايا المصنفة في الطبقة الخارجية من خلايا الركام (C')؛ الفئة 4 ، تظهر فقدان وفير من خلايا الركام على أكثر من 50 ٪ من سطح البويضة وعلامات انحطاط الخلية ومخلفات الخلية (D'). مقياس شريط 40 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور تمثيلية للتقدم الميوتيك. يظهر الصف العلوي (تلطيخ الحمض النووي) الحمض النووي (الأزرق) من البويضات التمثيلية في (A)مرحلة GV0 و (B) تكوين يشبه GV2 ، (C) MI stage و (D) انحطاط البويضات ، (A) في وقت الجمع و ( B ، C، D) بعد 5 أيام من L-IVCO. الصف السفلي هو الصورة المقابلة في مجال مشرق من البويضة في الصف العلوي. يشير السهم إلى الأصوات العالمية. مقياس شريط 20 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: Mتطور eiotic من البويضات في نهاية الثقافة. يمثل الرسم البياني الشريطي توزيع البويضات في مرحلة GV وMI وبويضات البويضات المنحطة في نهاية L-IVCO. تم استبعاد البويضات المصنفة سابقًا في الفئة 4. تم تحليل البيانات من قبل ANOVA 1-way متبوعة باختبار المقارنة المتعددة لـ Tukey والقيم هي وسائل ± SEM (N =5; P<0.05). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نحن وصف نظام ثقافة لزبد البويضات المتنامية التي تعزز التنمية بويضات لمدة 5 أيام من خلال دعم قدرتها على البقاء ومنع استئناف meiotic. هذا الجانب الأخير هو من أهم أهمية للسماح للنمو المستمر والتمايز اللازمة لمنح البويضة مع الكفاءة التنموية meiotic والجنينية2,20, التي من شأنها أن تكون خلاف ذلك منعت من قبل استئناف سابق لأوانه من الانقسام meiotic.
عند تطوير هذا النظام الثقافي ، أخذنا في الاعتبار العديد من الخصائص للنمو الفسيولوجي والتمايز الذي يحدث في المسام. في هذا القسم نقدم لمحة عامة عن الجوانب الرئيسية التي نظرنا فيها عند وضع هذه الاستراتيجية.
أولا، زراعة البويضات في الأبقار في وقت مبكر المسام النملية يستغرق ما يقرب من 5 أيام للخضوع للانتقال من متزايد إلى مرحلة نمت بالكامل في vivo8،19. لذلك، تم زيادة طول الثقافة إلى 5 أيام بدلا من المحاولات السابقة التي أجريت في مختبرنا حيث تم استزراع البويضات لمدة تصل إلى 24 ساعة2.
عامل آخر أدرجناه في L-IVCO هو زيادة لزوجة الوسيطة التي يتم فيها استزراع COCs لمحاكاة اللزوجة الفسيولوجية للسوائل الجريبية. وقد تم إعادة إنشاء هذا بإضافة 4٪ PVP و, جنبا إلى جنب مع استخدام الكولاجين أنا سطح الثقافة المغلفة, أنها عززت تشكيل ثقافة مثل 3D, كما ذكرت الدراسات السابقة13.
Cilostamide، مثبط PDE3، تمت إضافته للحفاظ على البويضات meiotically القبض في مرحلة GV، ومنع استئناف meiotic قبل الأوان عن طريق الحفاظ على مستويات عالية من النيوكليوتيدات دوري داخل البويضات2،19،25،28،29. وتشير نتائجنا إلى أن العلاج لمدة 5 أيام مع cilostamide ليس له تأثير كبير على صحة COCs، حيث أن جزءا صغيرا فقط من المجمعات تدهورت، أيضا بالاتفاق مع النتائج التي حصل عليها علم وآخرون19.
إن إدراج كبريتات الزن، وتركيزه، يثبته النتائج الأخيرة التي تبين أن هذا العنصر النزر له دور في دعم التمايز والنشاط النسخي للبويضات البقرية المتنامية في الثقافة30.
وأخيرا، تم إدخال مزيج من الهرمونات لتقليد عن كثب الوسط الهرموني الفسيولوجي نموذجية من الجريب الأنتاللي المبكر31،32،33. على سبيل المثال استراديول قد عرفت أنشطة في دعم نمو البويضات16,17,19 والاتصالات بين الخلايا الحبيبية17, في حين تعزيز أيضا اكتساب الكفاءة الميوتيك34. وبالمثل، التستوستيرون، إلى جانب كونه مقدمة من استراديول، كما يحفز نمو الجريب والتنمية35، في حين تم إضافة البروجسترون أساسا لنشاطه المضاد للملوثات36.
الأهم من ذلك، والاتفاق مع دراستنا السابقة2، تم الاحتفاظ بتركيز FSH في التركيز الذي هو الفسيولوجية للمرحلة المتنامية. في الواقع، وانخفاض تركيز FSH يعزز التنمية البويض من خلال الحفاظ على الفجوة تقاطع الاتصالات بوساطة بين البويضة وخلايا cumulus رفيق ويعزز النشاط النسخي والتمايز البويضية دون تحفيز استئناف meiotic2.
في تجربتنا، واحدة من مفاتيح لنجاح L-IVCO هو اختيار مجموعة متجانسة من COCs صحية قادمة من بصيلات انطلي في وقت مبكر. وفقا للبيانات في الأدب، 80٪ من البويضات التي تم جمعها من بصيلات الأنترال في وقت مبكر تتميز الكروماتين التي تنظم في تكوين يطلق عليه GV020. ويمثل هذا التجانس ميزة للثقافة في المختبر، كما هو من حيث المبدأ يضمن أن الخلايا سوف تتصرف على نحو مماثل عندما تتعرض للبيئة الثقافية. مع هذا في الاعتبار، يجب أن يتم تنفيذ مجموعة COCs في محاولة لتقليل "التلوث" مع COCs القادمة من مراحل أقل أو أكثر متقدمة من التمايز. ومع ذلك ، يرجع ذلك إلى حقيقة أن معالجة شرائح القشرية تستغرق وقتا طويلا وينبغي أن يتم في وقت قصير نسبيا ، فإن خطوة الجمع / الاختيار ربما يمثل مرور الأكثر أهمية من L-IVCO. ولتحقيق ذلك، ينبغي أن تكون بعض الاعتبارات الرئيسية في الاعتبار.
على سبيل المثال، يحتاج الباحث/الفني إلى التدريب على التعرف على الجريبات التي بها علامات على وجود اجريس الجريب والتخلص منها. في هذه المرحلة، يمكن استخدام المعلمات المورفولوجية فقط للتعرف على بصيلات الاترفيك، مثل المظهر الشفاف الواضح جداً، ووجود COC الظلام داخل. جميع بصيلات أخرى، والتي لا يمكن تمييز علامات الحساسية بوضوح، ينبغي أن تفتح وينبغي إجراء مزيد من الاختيار على أساس مورفولوجيا COCs المعزولة لتحديد تلك صحية2،3،37،38،39. ويتحقق هذا مرة أخرى من خلال الملاحظات المورفولوجية مثل وجود ما لا يقل عن أربع طبقات من الخلايا الركامية ، شكل كروية بشكل صارخ ، أوليما سليمة ومتجانسة ومحنك ناعماooplasm 11،26،27.
COCs العزل والتلاعب تمثل تحديا التقنية إضافية، الأمر الذي يتطلب الموظفين المهرة والمعدات المناسبة للتشريح الدقيقة تحت stereomicroscope وتحديد دقيق لقطر البويضة. هذه الخطوة الأخيرة ضرورية لاختيار مجموعة موحدة من البويضات، وبالتالي استبعاد أي مصدر محتمل للتلوث مع COCs القادمة من مراحل جراب أخرى. لهذا السبب، من المهم التأكد من أن البويضات المغلقة في COCs المسترجعة لديها قطر يتراوح بين 100 و 110 ميكرومتر2،40.
بالإضافة إلى دعم قابلية صلاحية البويضة ومنع استئناف الظهارة، عززت L-IVCO انتقال تكوين الكروماتين من GV0 إلى GV2 وGV3 بشكل تدريجي أكثر تكثيفًا في 59٪ من البويضات. ولا سيما التكثيف الكروماتين داخل GV هو علامة على 'كسب' من الكفاءة الميوتيك والتنموية في الأساس جميع البويضات الثديية درس حتى الآن20. هذه النتيجة واعدة جدا، وخصوصا بالمقارنة مع لدينا 24 ساعة السابقة نظام IVCO. في تلك الدراسة، لم يتم الوصول إلى أعلى درجة من ضغط الكروماتين داخل GV و 22٪ من البويضات تم العثور على تكوين GV12، وهي مرحلة مرتبطة بالكفاءة النيوطية الكاملة ولكن لا تزال نادرة الكفاءة التنموية20. حتى في تلك الظروف، كانت البويضات المتنامية غير الكفؤة قادرة على النضج وإنتاج الأجنة، وإن كان ذلك بكميات محدودة. ولذلك فإن الزيادة المستمرة في مراحل GV2/3 التي لوحظت في L-IVCO تتوافق مع إمكانية أعلى لإنتاج أجنة قابلة للحياة. نحن في عملية اختبار هذه الفرضية تجريبيا من خلال تقديم COCs المستمدة من L-IVCO إلى الخطوات التالية من IVP (في مرحلة النضج، والتسميد، وثقافة الجنين حتى مرحلة الكيسة). وفي حالة تأكيد ذلك، ستطلق هذه المنظمة العنان لبعض الإمكانات غير المستغلة لاحتياطي المبيض، مع ما يترتب على ذلك من آثار هامة على عدة مجالات ذات أهمية للحفاظ على خصوبة الإناث. على سبيل المثال، فإنه سيزيد من مصدر الهاكات القابلة للتخصيب لاستخدامها في برامج الحفظ لمربي الجدارة الوراثية العالية. ومن التطبيقات الأخرى التي نتوقعها هو إنقاذ الأنواع المهددة بالانقراض من الحيوانات الوراثية، فضلا عن السلالات المحلية المهددة بالانقراض أو المعرضة لخطر التآكل الوراثي بسبب الانتشار الواسع الانتشار لسلالات السلالات الكوسومية. أخيرا وليس آخرا، L-IVCO يمثل أداة لجميع العلماء المهتمين في تشريح العمليات الخلوية والجزيئية التي تنظم تشكيل gamete المختصة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل من قبل Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 و UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well dishes | Nunclon | 179830 | |
| 96-well dish | Becton Dickinson Biosciences | 356649 | BioCoat™ Collagen I |
| Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) | Sigma | A8806 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Sigma | A3311 | |
| Cell culture water | Sigma | W3500 | |
| Cilostamide | Sigma | C7971 | |
| Cysteamine | Sigma | M9768 | |
| Digital camera | Nikon Corp | Camera DS-5M | |
| Disodium phosphate | Sigma | S5136 | |
| Estradiol | Sigma | E2758 | |
| Glutamax Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Gonal F | Merck Serono | ||
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Sigma | H3784 | |
| Vacuum pump | Cook-IVF | KMAR-5100 | |
| Incubator | Sanyo | ||
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma | K1377 | |
| Medium 199 | Sigma | M3769 | Powder for bicarbonate-buffered media |
| Medium 199 | Sigma | M2520 | Powder for HEPES-buffered media |
| Microscope | Nikon Corp | Nikon Diaphot | |
| Microscope | Nikon Corp | Eclipse E 600 | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicilin | Sigma | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma | P5530 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | P8137 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | P5288 | 360k molecular weight |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium choride | Sigma | P5886 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Testosterone | Sigma | 86500 | |
| Triton X | Sigma | T9284 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Water | Sigma | W3500 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | Z0251 |
References
- Lonergan, P., Fair, T.
- Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s). Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).
- McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Galli, C. Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective. Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).
- Luciano, A. M., Sirard, M. A. Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation. Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).
- Lonergan, P., Fair, T. In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts. Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).
- Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link. Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).
- Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).
- Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).
- Blondin, P., Sirard, M. A. Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).
- Harada, M., et al. Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine. Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles. Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).
- Taketsuru, H., et al. Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification. Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).
- Endo, M., et al. Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles. Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).
- Makita, M., Miyano, T. Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells. Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).
- Yamamoto, K., et al. Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro. Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).
- Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture. Theriogenology. 118, 110-118 (2018).
- Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence. Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).
- Lodde, V., et al. Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).
- Dieci, C., et al. Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production. Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).
- Soares, A. C. S., et al. Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle. Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).
- Soares, A. C. S., et al. Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds. Theriogenology. 141, 146-152 (2020).
- Franciosi, F., et al. Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes. Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization. Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).
- Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos. Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).
- Dieci, C., et al. The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer. Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).
- Shu, Y. M., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Lodde, V., et al. Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes. Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).
- Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).
- Kruip, T. A., Dieleman, S. J. Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and stage of the oestrus cycle. Theriogenology. 24 (4), 395-408 (1985).
- Sakaguchi, K., et al. Relationships between the antral follicle count, steroidogenesis, and secretion of follicle-stimulating hormone and anti-Mullerian hormone during follicular growth in cattle. Reproductive Biology and Endocrinology. 17 (1), 88 (2019).
- Makita, M., Miyano, T. Androgens promote the acquisition of maturation competence in bovine oocytes. Journal of Reproduction and Development. 61 (3), 211-217 (2015).
- Walters, K. A., Allan, C. M., Handelsman, D. J.
- Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium. Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).
- Gordon, I. Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , CABI Publishing. (2003).
- Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin. Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
