Summary
我们描述了在发育的早期阶段从卵巢卵泡分离生长的卵母细胞的过程，以及建立体外培养系统，该系统可以支持生长和分化，一次，一次，一次，一个发育阶段。
Abstract
成熟、可受精的卵母细胞的有限储备是哺乳动物辅助生殖成功的主要障碍。考虑到在生殖寿命期间，卵巢成熟和排卵中只有约1%的卵母细胞，已开发出若干技术，以增加卵巢储备对越来越多的非卵巢卵泡种群的利用。这些技术允许对生育保护、牲畜选择方案以及濒危物种的保护进行干预。然而，卵巢储备的巨大潜力在很大程度上仍未开发。例如，在奶牛中，已经尝试在特定的发育阶段支持卵母细胞的体外培养，但尚未制定有效和可靠的方案。在这里，我们描述了一个培养系统，它再现了相应卵泡阶段的生理条件，被定义为从牛早期蚁卵泡中收集到完全生长的卵母细胞，与体内的中蚂蚁卵泡相对应。激素和磷酸二酯酶3抑制剂的组合被用来防止不合时宜的美的恢复，并指导卵母细胞的分化。
Introduction
在生殖寿命期间，卵巢成熟中存在的卵母细胞中，只有极小部分在排卵管中排卵，并可用于受精和发育成可行的胚胎1。另一方面，卵巢内大多数卵母细胞都经过卵巢，从不排卵。体外胚胎生产（IVP）技术试图增加卵巢储备2，3,的利用。迄今为止，这些技术允许对生育保护、牲畜选择方案以及保护濒危物种进行干预。然而，大多数协议使用已基本完成在蚁卵巢卵泡内生长阶段的卵母细胞，因此被称为完全生长的卵母细胞。在广泛采用 IVP 技术的牛中，完全生长的卵母细胞的最终直径约为 120 μm，从直径为 2 至 8 mm 的卵泡（中等蚂蚁卵泡）1 中采集。与卵泡分离后，这种卵母细胞在体外成熟和受精。然后，酶被培养到囊肿阶段，或转移到接受者或冷冻保存。在牛和许多其他物种中，尽管 IVP 提供了潜力，但每头牛的体外胚胎数量过去 40 年并没有大有改善。这部分是由于在给定时间填充卵巢的完全生长的卵母细胞数量有限，可以检索并接受标准 IVP 技术4、,5、6。
封闭在早期蚁卵泡内的卵母细胞，即直径小于2毫米的卵泡，是生育保全计划7中的潜在来源，因为卵巢中大约含有比中蚂蚁8多10倍的早期蚁卵泡。然而，这些卵母细胞仍处于生长阶段，尚未达到完全生长阶段9。因此，他们仍然具有转录活性，产生mRNA，将储存为以后的发展步骤，尚未经历所需的所有分化过程，赋予卵母细胞的能力，自发地恢复和完成美病我曾经从卵泡舱10，11,分离。因此，它们不能直接提交到标准体外成熟 （IVM） 协议，但它们需要额外的培养期，以便它们能够完成生长阶段并正确区分。
从生长阶段到完全生长阶段的过渡，在牛中，当毛囊从早期的蚁体发展到中蚁体阶段时，是卵母细胞发育的关键步骤之一。在牛中，多项研究试图在体,外,,2、12、13、14、15、16、17、18、192,12,13,1416,1718中重新概括这些事件。15然而，迄今尚未制定可靠的议定书，只报告了有限的成功。根据先前的研究20，这些生长的卵母细胞构成一个同质种群。除了转录活性外，它们的染色质还分散在细菌囊泡（GV）中，其配置名为GV02，21。,21相反，从中等蚂蚁卵泡中获得的完全生长的卵母细胞的种群是更异质的，这种条件由不同程度的染色质压实（GV1、GV2和GV3）所反映，可以观察到20。其中，此前的数据表明，GV2和GV3卵母细胞总体具有较好的品质和较高的胚胎发育能力20、21、22、23、24。20,21,22,23,24
从上述观察开始，我们在此描述了一个5天长的卵母细胞培养系统（L-IVCO），它允许从早期的蚁卵泡中分离出分离为积细胞-卵母细胞复合物（COCs）的卵母细胞。这种培养策略是从我们实验室进行的10年长期研究演变而来的，其基础是先前开发的体外卵母细胞培养（IVCO）2，早产系统23，25,25和卵母细胞培养期间的锌补充。卵泡刺激激素（FSH）和磷酸二酯酶-3（PDE3）抑制剂的组合，能够增强积糖-卵母细胞传播2，防止不合时宜的美异恢复2，并支持卵母细胞生长2被使用。
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Protocol
在当地屠宰场（INALCA S.p.A.，奥斯佩达莱托·洛迪迪亚诺，LO，IT 2270M CE，意大利）回收的4至8岁的荷尔斯泰因奶牛。
1. 媒体准备
注：所有介质在使用前必须至少准备四小时。碳酸氢钠缓冲介质在38.5°C和5%CO2空气中孵育，最大湿度。2HEPES 缓冲介质在恒温烤箱中保持在 38.5 °C。
- 卵母细胞（L-IVCO）介质的长体外培养
- 准备15 mL的基本培养基（M199-B）：补充M199与2mM谷氨酰胺， 0.4% 无脂肪酸牛血清白蛋白 （BSA）， 0.2 mM 丙酮钠， 25 mM 碳酸氢钠， 0.1 mM 环胺， 21.3 μg/mL 苯酚红， 75 μg/mL 的卡纳米霉素和 4% 聚氯霉素 （PVP; 360 k 分子量）.
- 准备 3 mL 的保持介质 （M199-H）： 到 M199-B 加入 5 μM 西托米，倒入 35 mm 培养皿中。
- 准备L-IVCO介质（M199-L）：补充M199-B与0.15μg/mL Zn硫酸盐，10-4 IU/mL FSH，10纳克/mL雌二醇，50纳克/mL睾酮，50纳克/mL黄体酮和5μM西洛桑胺。
- 将 200 μL 的 M199-L 介质放在 96 涂层板的每个井中。用无菌培养水填充板四边的水井，以补偿蒸发，并在培养过程中保持适当的湿度。
- 在38.5°C和5%CO2 的空气中孵育96井板和M199-H培养基，最大湿度。
- 解剖介质
- 准备解剖介质（M199-D）：补充M199与0.4%BSA分数V，0.164 mM青霉素，0.048 mM链霉素，1790单位/L肝素。M199-D 可批量准备，以 20 mL 等分配方式分配，并在 4°C 中储存 6 个月。需要时，加热并补充1等分。
- 制备 20 mL 的 M199-D，并辅以 5 μM 西罗酰胺（M199-D 西罗酰胺）。
2. 卵巢收集和处理
注：除非另有说明，否则所有程序在室温 （26 °C） 下进行。
- 从奶牛身上恢复屠宰场的卵巢。
- 将卵巢放在无菌盐水（NaCl，9 g/L）中，加入青霉素100 U/mL和链霉素0.1mg/mL，在26~28°C。
- 在4小时内将器官用热无菌盐水运送到实验室。
- 在无菌盐水中清洗卵巢4倍，维持在26°C。
- 使用连接到真空压力设置为 -28 mmHg 的吸气泵的 18 G 针，将吸气卵巢放在无菌盐水为 26 °C 的烧杯中，清除所有直径超过 2 mm 的中大蚂蚁卵泡。
注：去除卵泡含量 > 2 mm 是尽可能去除完全生长的卵母细胞的来源的关键步骤，这些卵母细胞会"污染"实验。 - 在水平层流罩下，将一个卵巢放在无菌聚四氟乙烯切割板上。使用安装在手术刀手柄上的22号手术刀片，切割卵巢皮层（卵巢的外侧，包含卵泡）的切片，1.5 ~2毫米厚，与器官主轴平行。
- 将卵巢皮层片放在无菌玻璃培养皿中，在38.5°C的加热盘中用解剖介质覆盖。
注：从现在起，所有程序都使用加热板在38.5 °C下完成。
3. 卵泡的选择和隔离以及COC的检索
- 将一个卵巢皮层片放在一个 60 毫米玻璃培养皿中，其 M199-D 的 2-3 mL。
- 使用解剖显微镜，使用微米配备的目镜选择 0.5 ~ 2 mm 之间的卵泡。
- 在立体显微镜下识别健康、非抗性毛囊。通过观察形态参数（如非常清晰的半透明外观）评估卵泡，内部有深色 COC。丢弃阿克雷特毛囊，处理所有其他。
- 使用安装在手术刀手柄上的 22 号手术刀片去除一侧毛囊周围的卵巢组织，直到毛囊暴露在一侧。
- 使用安装在注射器上的 26G 针，小心地在暴露的毛囊壁上打一个缝。此操作将释放卵泡含量，包括COC、卵泡液和细胞团。
- 在显微镜下识别COC，并检查细胞质的积原完整性、佐纳佩图西达完整性和同质性。如果符合这些标准，则使用 P20 移液器吸气 COC。
- 将隔离的 COC 放在 M199-D 西罗塔米德中。
- 继续隔离过程 30 分钟。
4. 选择进行体外培养的COC
- 在解剖显微镜下，根据步骤3.6中的标准选择健康的COC。
- 在 60 mm 培养皿中，制备 16 滴 20 μL 的 M199-D 西洛酰胺，每滴放置一个健康的 COC（图 1A）。
- 使用连接到相机的倒置显微镜使用相机随附的软件测量卵母细胞直径（不包括 zona pellucida）。
- 通过卵母细胞的清晰可视化，进行两个垂直测量，不包括佐纳佩普图西达（图1B）。
- 确保两个卵母细胞的测量均值（不包括佐纳佩图西达）是否在 100 ~ 110 μm 的范围内。丢弃非圆形卵母细胞或无法测量的卵母细胞的 COC。
- 将选定的COC在含有M199-H介质的35毫米培养皿中转移，并在38.5°C和空气中的5%CO2下放在培养箱中 ，最大湿度，直到步骤5.1。
- 重复步骤 3 和 4 至 4 倍。总工作时间不得超过2小时。
5. 卵母细胞的长体外培养（L-IVCO）
- 在步骤 1.1.5 中，在 96 井板的井中心转移每井一个 COC。
- 在38.5°C和5%CO2空气中孵育板5 天，最大湿度。
- 每隔一天（第 2 天和第 4 天）准备新的 M199-L，如步骤 1 中所述。
- 通过去除 100 μL 的介质，用 100 μL 新鲜制备的 M199-L 更换，更新介质的一半。在立体显微镜下进行介质更新，避免将 COC 移动到井中。
6. 培养后 COC 分类
- 在L-IVCO结束时，在解剖显微镜下分析COC的形态。
- 分类如下图 2所示。
- 如果 COC 显示紧凑的积子细胞投资，且无积分膨胀和细胞退化的迹象，将其分类为 1 类。
- 如果 COC 显示紧凑的积子细胞投资，且无积分膨胀和细胞退化的迹象，且在积率质量中形成蚂蚁状，那么将其归类为 2 类。
- 如果 COC 显示几层积子细胞，没有积分膨胀的迹象，并且在积子细胞的外层中显示一些分解细胞，并且没有蚂蚁状的形成，那么将其分类为 3 类。
- 如果 COC 显示大量失去超过 50% 的卵母细胞表面的积细胞，以及细胞退化和细胞碎片的迹象，则归类为 4 类。
7. 文化后美的进展评价
- 卵母细胞变性
- 将每个 COC 放在一个四井板的单一井中，每井含有 400 μL 的 199D。
- 在解剖显微镜下，使用130-140μL的移液器，通过重复移液，以机械方式轻轻取出积液细胞。
- 一旦卵母细胞没有积水投资，将它们转移到另一个包含199D的井。
- 重复这个过程，直到所有的卵母细胞被完全变性。
- 卵母细胞核染色
注：从现在起，所有程序都在室温下执行。试剂处于室温下。- 将磷酸缓冲液（PBS）中对口甲醛4%中的卵母细胞固定1小时。
注意：在处理甲状甲醛时，请佩戴个人防护设备，并按照危险废物处置准则处置受污染的材料。 - 在含有 1% 聚维醇醇 （PVA） 的 PBS 中，每次清洗卵母细胞 3x 5 分钟。
注：样品可马上处理或储存在4°C，最多一周。 - 将卵母细胞放在含有0.1%三顿X的PBS中，10分钟。
- 在含有1%PVA的PBS中，将卵母细胞清洗3x5分钟。
- 将卵母细胞奇异地放在5μL的抗fade介质滴中，并辅以4'，6-6-2-苯酚（DAPI）扩张物（1μg/mL）在滑梯上。
- 沿幻灯片的长边放置两条双面胶带，以避免在将盖滑放在顶部时使卵母细胞过度扁平化。
- 将盖滑放在上面，使其粘附在胶带上，并在处理所有样品时保持黑暗。
- 使用配备DAPI过滤器（兴奋/发射：358×461）的传统荧光显微镜分析卵母细胞，以评估卵母细胞的美感进展。
- 根据卵母细胞的美感进展对卵母细胞进行分类：GV - GV 内不同程度染色质凝结的卵母细胞;MI = GV 的卵母细胞分解为元相 I;和退化 – 不能被确定为处于任何前一阶段的卵母细胞。
- 将磷酸缓冲液（PBS）中对口甲醛4%中的卵母细胞固定1小时。
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Representative Results
在L-IVCO结束时，COC的形态变化，根据积液细胞的外观确定了4个类，如图2所示。根据选择健康COCs11、26、27的通常形态标准，1、2和3类被判定为健康，而4类则表现出明显的退化迹象，如卵母细胞周围没有完整的积细胞层，被认为严重受损，不适合在未来的 IVP 设置中接受下游程序。11,26,27总的来说，对5个生物复制的74个卵母细胞进行了分析，其中9.45%为4类，在进一步评估中被丢弃。
如图 3 和图 4 所示，对 L-IVCO 末尾的美细胞阶段的评估显示，卵母细胞的百分比显著增加（78.57 ± 4.43%）在不成熟的阶段仍然被捕，染色质仍然封闭在GV内（因此，也称为GV阶段），而不会退化。其中59.43%为GV2/3配置。一小部分恢复性，达到元相一阶段（13.76±5.85%）或退化（7.67±4.61%）。总的来说，对5个生物复制体中的67个卵母细胞进行了分析。总之，这些数据表明L-IVCO培养支持卵母细胞的生存能力，同时防止5天美的恢复。
图1：用于测量细胞直径和COC代表性图像的培养皿轮廓。 （A） 60 mm 培养皿的示意图，其 16 滴为 20 μL 的 M199-D，每个培养皿包含单个 COC。（B） 具有用于测量直径的轴的 COC 的代表性图像。请注意，不包括佐纳佩普鲁西达。比例杆 50 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图 2：收集时和 L-IVCO 之后 COC 的代表性图像。 （A ， B ， C ， D）上行（集合）表示检索时 COC。（A'， B'， C'， D'）同一 COC 在 5 天后，在 L-IVCO 结束时拍摄，并归类为步骤 6.1 中报告。下行（5天）表示COC分类为：1类，显示紧凑的积细胞投资，无扩张和细胞退化的迹象（A'）;第 2 类，显示紧凑的积细胞投资，无膨胀和细胞退化迹象，在积水质量 （B'） 中具有蚂蚁状形成（箭头）;第3类，显示几层没有积膜扩张迹象的积膜细胞和积子细胞外层（C'）中的一些分类细胞;第4类，显示超过50%的卵母细胞表面的积细胞大量流失，以及细胞退化和细胞碎片（D'的迹象）。比例杆 40 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：美的进展的代表性图像。上排（DNA染色）显示代表性卵母细胞的DNA（蓝色）在（A）GV0级和（B）GV2样配置，（C）MI阶段和（D）退化卵母细胞，（A）在收集时和A（B，C，D）在L-IVCO的5天后。下一行是上行中卵母细胞明亮字段中的相应图像。箭头指示 GV。比例杆 20 μm.请单击此处查看此图的较大版本。
图4：细胞在培养结束时的M性异质进展。条形图表示 GV 和 MI 阶段的卵母细胞分布和 L-IVCO 末尾的退化卵母细胞的分布。先前在第4类中分类的卵母细胞被排除在外。数据通过一向 ANOVA 进行分析，然后由 Tukey 的多重比较测试进行分析，值± SEM （N=5;P<0.05）。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在这里，我们描述了一个培养卵母细胞的培养系统，通过支持卵母细胞的生存能力和防止卵母细胞的恢复，促进卵母细胞发育5天。后一个方面是最重要的，让持续生长和分化是必要的，使卵母细胞与小鼠和胚胎发育能力2,2，20，否则将阻止过早恢复的美的分裂。
在开发这种培养系统时，我们考虑了卵泡中生理生长和分化的几个特征。在本节中，我们概述了我们在制定此战略时考虑的主要方面。
首先，在牛早期蚁卵泡中生长的卵母细胞需要大约5天，才能在体内从,19生长阶段过渡到完全生长阶段。因此，培养的时间增加到5天，而不是之前在我们的实验室，其中卵母细胞被培养高达24小时2的尝试。
我们在 L-IVCO 中包含的另一个因素是培养 COC 以模拟卵泡流体的生理粘度的介质的粘度增加。这是通过添加4%PVP而重现的，并且，连同胶原蛋白一涂层培养表面的使用，它促进了3D像文化的形成，如以前的研究报告13。
Cilostamide， PDE3抑制剂， 被添加， 以保持卵母细胞在GV阶段被抑制， 防止早熟的美因恢复通过保持高水平的循环核苷酸在卵母细胞2，19，225，,28，,29.,我们的结果表明，用西罗酰胺进行5天的治疗对COCs的健康没有严重影响，因为只有一小部分复合物退化，也符合Alam等人19日获得的结果。
硫酸锌的含盐及其浓度，最近结果表明，这种微量元素在支持培养30中的牛生长的卵母细胞的分化和转录活性方面有一定的作用。
最后，引入激素组合，密切模仿早期蚁卵泡31、32、33,的,生理激素环境。例如，雌二醇已知活动支持卵母细胞生长16，17，19和粒细胞,17,19之间的连接17，同时也促进获得美的.能力34。同样，睾酮，除了是雌二醇的前体，也刺激卵泡生长发育35，而黄体酮主要是添加其抗凋亡活性36。
重要的是，符合我们之前的研究2，FSH的浓度保持在一个浓度，是生理的生长阶段。事实上，低FSH浓度通过维持卵母细胞和伴生积细胞之间的间隙结间交流来促进卵母细胞的发展，促进转录活性和卵母细胞分化，而不诱导卵母细胞复性2。
根据我们的经验，L-IVCO成功的关键之一是选择来自早期蚁泡的健康COC的均匀种群。根据文献中的数据，从早期蚁卵泡中收集的卵母细胞中，80%的特点是以一种结构（GV020）组织的染色质。这种同质性代表了体外培养的一个优势，因为它原则上确保细胞在暴露在培养环境中时的行为类似。有鉴于此，必须执行 COC 收集，以尽量减少来自较低或更高级的差别化阶段的 COC 的"污染"。但是，由于皮质切片的处理非常耗时，应在相对较短的时间进行，因此收集/选择步骤可能是 L-IVCO 最关键的通道。要做到这一点，一些关键的考虑应该是胡子在心中。
例如，研究人员/技术人员需要接受培训，以识别和丢弃有卵泡体体迹象的卵泡。在此阶段，只能使用形态参数来识别隐变毛囊，例如非常清晰的半透明外观，以及内部存在深色 COC。所有其他不能明确区分的毛囊，应打开，并应根据隔离的COC的,形态进行进一步选择，以确定健康的2，3，37，38，39。,337,38,39这再次通过形态学观察，如存在至少四层积细胞，严重球形，完整的眼球和均匀和精细的颗粒状乌普拉斯11，26，27。11,26,27
COC 的隔离和操作是一个额外的技术挑战，它需要熟练的人员和适当的设备，在立体显微镜下进行微解剖，并准确确定卵母细胞直径。最后一步对于选择统一的卵母细胞种群至关重要，从而排除了来自其他卵泡阶段的 COC 的任何可能的污染源。因此，确保被检索的COC中附着的卵母细胞的直径在100和110μm2，402之间是十分重要的。
除了支持卵母细胞的生存能力和防止卵母细胞的恢复，L-IVCO还促进了染色质配置在59%的卵母细胞中从GV0向逐渐更浓缩的GV2和GV3的过渡。值得注意的是，GV内的染色质凝结是迄今为止研究的所有哺乳动物卵母细胞中，美的和发育能力的"增益"的标志。这个结果是非常有希望的，特别是与之前我们之前的24小时IVCO系统相比。在这项研究中，GV内的最高染色质压实程度未达到，22%的卵母细胞被发现具有GV1配置2，这一阶段与完全的美感能力有关，但仍然缺乏发育能力20。即使在这些条件下，原本不称职的卵母细胞也能够成熟并产生胚胎，尽管数量有限。因此，在L-IVCO中观察到的GV2/3阶段的持续增加与产生可行胚胎的更高潜力相容。我们正在通过将从L-IVCO衍生的COC提交IVP的以下步骤（体外成熟、受精和胚胎培养到胚胎发育阶段）来实验验证这一假设。如果得到证实，L-IVCO将释放卵巢保护区的一些尚未开发的潜力，对女性生育保护感兴趣的几个领域产生重要影响。例如，它将增加可受精的野子的来源，用于高遗传价值育种者的保护计划。我们预见的另一个应用是，对博维德家族受威胁物种以及由于宇宙品种广泛扩散而濒临灭绝或面临遗传侵蚀风险的当地品种进行遗传抢救。最后，但并非最不重要的，L-IVCO是所有科学家的工具，他们有兴趣解剖调节能力游戏体形成的细胞和分子过程。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了伦巴第地区PSR INNOVA n.201801061529和联伊特派团n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well dishes | Nunclon | 179830 | |
| 96-well dish | Becton Dickinson Biosciences | 356649 | BioCoat™ Collagen I |
| Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) | Sigma | A8806 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Sigma | A3311 | |
| Cell culture water | Sigma | W3500 | |
| Cilostamide | Sigma | C7971 | |
| Cysteamine | Sigma | M9768 | |
| Digital camera | Nikon Corp | Camera DS-5M | |
| Disodium phosphate | Sigma | S5136 | |
| Estradiol | Sigma | E2758 | |
| Glutamax Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Gonal F | Merck Serono | ||
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Sigma | H3784 | |
| Vacuum pump | Cook-IVF | KMAR-5100 | |
| Incubator | Sanyo | ||
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma | K1377 | |
| Medium 199 | Sigma | M3769 | Powder for bicarbonate-buffered media |
| Medium 199 | Sigma | M2520 | Powder for HEPES-buffered media |
| Microscope | Nikon Corp | Nikon Diaphot | |
| Microscope | Nikon Corp | Eclipse E 600 | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicilin | Sigma | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma | P5530 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | P8137 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | P5288 | 360k molecular weight |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium choride | Sigma | P5886 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Testosterone | Sigma | 86500 | |
| Triton X | Sigma | T9284 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Water | Sigma | W3500 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | Z0251 |
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