Мы описываем процедуры изоляции растущих яйцеклеток от фолликулов яичников на ранних стадиях развития, а также установку системы культуры in vitro, которая может поддерживать рост и дифференциацию до полностью выращенной стадии.
Ограниченный резерв зрелых, удобренных яйцеклеток представляет собой основной барьер для успеха вспомогательной репродукции у млекопитающих. Учитывая, что в период репродуктивной жизни только около 1% яйцеклеток в яичниках зрелых и овуляции, несколько методов были разработаны для увеличения эксплуатации яичников резерва для растущей популяции неовуляторных фолликулов. Такие технологии позволили проведить сохранение плодородия, программы отбора скота и сохранения исчезающих видов. Тем не менее, огромный потенциал резерва яичников по-прежнему в значительной степени неэксплуатируются. У коров, например, предпринимались некоторые попытки поддержать культуру экстракорпорального использования яйцеклеток на конкретных стадиях развития, однако эффективные и надежные протоколы еще не разработаны. Здесь мы описываем культурную систему, которая воспроизводит физиологические условия соответствующей фолликулярной стадии, определяемой для развития в пробирке растущих яйцеклеток, собранных из ранних антральных фолликулов крупного рогатого скота на полностью выращенную стадию, соответствующую среднему антральную фолликулу in vivo. Сочетание гормонов и ингибитора фосфодиэстеразы 3 было использовано для предотвращения несвоевременного мейотического возобновления и для руководства дифференциацией яйцеклеток.
Во время репродуктивной жизни, только минимальная доля яйцеклеток, которые присутствуют в яичнике зрелые, высвобождаются в фаллопиевых труб после овуляции, и доступны для оплодотворения и развиваться в жизнеспособный эмбрион1. С другой стороны, большинство яйцеклеток в яичнике проходят атрезию и никогда не овуляции. Технологии производства эмбрионов in vitro (IVP) пытались увеличить эксплуатацию резерва яичников2,,3. До сих пор такие технологии позволяли мероприятия по сохранению плодородия, программам отбора скота и сохранению исчезающих видов. Тем не менее, большинство протоколов использовать яйцеклетки, которые в основном завершили фазу роста в антрал яичников фолликула, и, следовательно, называются полностью выращенных яйцеклеток. В крупного рогатого скота, где технологии IVP широко используются, полностью выращенные яйцеклетки достигают конечного диаметра около 120 мкм и собираются из фолликулов, которые охватывают от 2 до 8 мм в диаметре (средние антрал фолликулы)1. После изоляции от фолликулов такие яйцеклетки созревают и оплодотворяются в пробирке. Зиготы затем культурны до стадии бластоцист и либо переданы получателю или криоконсервированы. У крупного рогатого скота, как и у многих других видов, несмотря на потенциал, предлагаемый IVP, количество эмбриона в пробирке на корову в значительной степени не улучшась в течение последних 40 лет. Отчасти это связано с ограниченным числом полностью выращенных яйцеклеток, которые населяют яичник в данный момент времени, которые могут быть извлечены и подвергнуты стандартным методам IVP4,,5,,6.
Ооциты, заключенные в ранние антрал фолликулы, т.е. те фолликулы диаметром менее 2 мм, представляют собой потенциальный источник, который будет использоваться впрограммах сохранения плодородия 7, так как яичник примерно содержит в 10 раз больше ранних антрал-фолликулов, чем среднийантрал 8. Тем не менее, эти яйцеклетки все еще находятся в фазе роста и еще не достигли полностью выращенной стадии9. Таким образом, они по-прежнему транскрипционно активны, производя mRNAs, которые будут храниться для более поздних шагов развития, и еще не прошли весь процесс дифференциации, необходимые для придать яйцеклетки с возможностью спонтанного возобновления и завершения мейоза я когда-то изолированы от фолликулярногоотсека 10,11. Поэтому они не могут быть непосредственно представлены к стандартным протоколам созревания in vitro (IVM), но они требуют дополнительного периода культуры, который позволил бы им завершить фазу роста и правильно дифференцировать.
Переход от выращивания к полностью выращенной стадии, которая у крупного рогатого скота происходит, когда фолликул развивается от ранней антраля к средней антральную стадию, является одним из важнейших шагов во время развития яйцеклеток. В крупного рогатого скота, несколько исследований пытались повторить эти события впробирке2,12,,13,,14,,15,,16,,17,,18,19. Однако до настоящего времени никаких надежных протоколов не разрабатывалось, и сообщалось лишь об ограниченном успехе. Согласно предыдущим исследованиям20, эти растущие яйцеклетки представляют собой однородную популяцию. Помимо транскрипционной активной, их хроматин рассеивается в зародышевой везикуле (GV), в конфигурации, которая называется GV02,21. И наоборот, популяция полностью выращенных яйцеклеток, полученных из средних антрал фолликулов, является более неоднородной, состояние, которое отражается в различных степенях уплотнения хроматина (GV1, GV2 и GV3), которыеможно наблюдать 20. Среди них, предыдущие данные показали, что GV2 и GV3 ооцитов в целом характеризуется лучшим качеством и более высокойэмбриональной компетенции развития 20,21,22,23,24.
Начиная с вышеуказанных наблюдений, здесь мы описываем 5-дней культурную систему ооцитов (L-IVCO), которая позволяет дифференцировать ооциты, изолированные как кумулятиво-ооцитные комплексы (COCs) от ранних антралальных фолликулов. Эта стратегия культуры развивалась из 10 лет исследований, проведенных в нашей лаборатории и корни его землю на ранее разработанных 24-48 часов в пробирке ооцитов культуры (IVCO)2,недоношенных систем 23,25 и цинк добавок во время культуры яйцеклеток . Использовалась комбинация фолликулостимулирующего гормона (ФФГ) и ингибитора фосфодиэстеразы-3 (PDE3), способного усилить кумулятивно-ооцитнуюсвязь 2, предотвратитьнесвоевременное межиоптическое возобновление 2,атакже поддержать рост яйцеклеток 2.
Здесь мы описываем культурную систему выращивания яйцеклеток, которая способствует развитию яйцеклеток в течение 5 дней, поддерживая их жизнеспособность и предотвращая мейотические возобновления. Этот последний аспект имеет первостепенное значение, чтобы обеспечить дальнейший рост…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Регион Ломбардия PSR INNOVA N.201801061529 и UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01
4-well dishes | Nunclon | 179830 | |
96-well dish | Becton Dickinson Biosciences | 356649 | BioCoat™ Collagen I |
Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) | Sigma | A8806 | |
Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Sigma | A3311 | |
Cell culture water | Sigma | W3500 | |
Cilostamide | Sigma | C7971 | |
Cysteamine | Sigma | M9768 | |
Digital camera | Nikon Corp | Camera DS-5M | |
Disodium phosphate | Sigma | S5136 | |
Estradiol | Sigma | E2758 | |
Glutamax Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
Gonal F | Merck Serono | ||
Heparin | Sigma | H3149 | |
Hepes | Sigma | H3784 | |
Vacuum pump | Cook-IVF | ||
Incubator | Sanyo | ||
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma | K1377 | |
Medium 199 | Sigma | M3769 | Powder for hepes-buffered TCM199 |
Medium 199 | Sigma | M2520 | Powder for M199-D |
Microscope | Nikon Corp | Nikon Diaphot | |
Microscope | Nikon Corp | Eclipse E 600 | |
Monopotassium phosphate | Sigma | P5655 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
Penicilin | Sigma | P3032 | |
Phenol Red | Sigma | P5530 | |
Polyvinyl alcohol | Sigma | P8137 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma | P5288 | 360k molecular weight |
Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sodium choride | Sigma | P5886 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | |
Streptomycin | Sigma | S9137 | |
Testosterone | Sigma | 86500 | |
Triton X | Sigma | T9284 | |
Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
Water | Sigma | W3500 | |
Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | Z0251 |