Dette manuskriptet beskriver en metode for bruk av encellet fluorescensmikroskopi for å visualisere og kvantifisere bakteriell konkurranse i kokultur.
Interbakteriell konkurranse kan direkte påvirke mikrobiomenes struktur og funksjon. Dette arbeidet beskriver en fluorescensmikroskopitilnærming som kan brukes til å visualisere og kvantifisere konkurranseinteraksjoner mellom ulike bakteriestammer på encellet nivå. Protokollen som er beskrevet her gir metoder for avanserte tilnærminger i lysbildeforberedelse på både oppreist og invertert epifluorescence mikroskoper, live-celle og tidsforløp bildeteknikker, og kvantitativ bildeanalyse ved hjelp av open source programvare FIJI. Tilnærmingen i dette manuskriptet skisserer kvantifiseringen av konkurranseinteraksjoner mellom symbiotiske Vibrio fischeri-populasjoner ved å måle endringen i området over tid for to myntkubaterte stammer som uttrykker forskjellige fluorescerende proteiner fra stabile plasmider. Alternative metoder er beskrevet for å optimalisere denne protokollen i bakterielle modellsystemer som krever forskjellige vekstforhold. Selv om analysen beskrevet her bruker forhold optimalisert for V. fischeri, er denne tilnærmingen svært reproduserbar og kan lett tilpasses for å studere konkurranse blant dyrkbare isolasjoner fra forskjellige mikrobiomer.
Denne artikkelen skisserer en metode for kvantifisering av bakteriell konkurranse på encellet nivå ved hjelp av fluorescensmikroskopi. Strukturen og funksjonen til mikrobielle samfunn er ofte formet av konkurranseinteraksjoner mellom mikrober, og i mange tilfeller krever karakterisering av disse interaksjonene å observere forskjellige bakteriestammer i coincubation1,2,3,4,5,6,7,8 . Tradisjonelt kvantifiseres bakteriekonkurransen på befolkningsnivå ved å telle kolonidannende enheter (CFUer) av inhibitor og målstammer før og etter en myntutdelingsperiode2,9. Mekanismer for mikrobiell konkurranse er bredt fordelt mellom bakterier og kan være avhengige av enten diffusjon eller cellecellekontakt for å hemme målcellene10,11,12,13,14,15,16,17,18,19.
Selv om bakteriestammer ofte observeres i myntkubering på befolkningsnivå, skisserer dette manuskriptet en analyse for encellet kvantifisering av bakteriell konkurranse. Videre inneholder dette arbeidet forslag til tilpasning av protokollen for bruk med andre bakteriearter. Mens de spesifikke teknikkene i denne artikkelen brukes til å studere kontaktavhengig intraspesifikk konkurranse mellom stammer av den symbiotiske bakterien Vibrio fischeri20,21,22, kan de tilpasses for konkurranse mellom mange organismer. Denne artikkelen inneholder instruksjoner for lysbildeoppsett på både oppreiste og inverterte mikroskoper, og all analyse er beskrevet ved hjelp av åpen kildekode-programvaren FIJI23, slik at metoden kan brukes av forskere med tilgang til forskjellige bildeoppsett og analyseprogrammer. Gitt viktigheten av å studere mikrobiell konkurranse både på befolknings- og encellet nivå, vil denne metoden være en verdifull ressurs for forskere å kvantifisere konkurranseinteraksjoner, spesielt de som ikke har tilgang til proprietær analyseprogramvare.
Protokollen beskrevet ovenfor gir et kraftig verktøy for kvantifisering og karakterisering av interbakteriell konkurranse på encellet nivå. Denne analysen, som ble utviklet ved å endre vår CFU-baserte konkurranseanalyse på agarplater1,2, tillatt for visualisering av encellet konkurranse blant V. fischeri isolerer og forslag er gitt for å optimalisere metoden for et bredt spekter av systemer og mikroskopioppsett. Selv om metoden beskrevet her ble optimalisert for lysorganet symbiont V. fischeri, kan den lett modifiseres for å imøtekomme mange forskjellige, dyrkbare mikrober. Det er viktig å merke seg at konkurransemekanismer kan reguleres av et hvilket som helst antall miljøvariabler, inkludert temperatur, saltholdighet og viskositet30,31,32,33,34. Tidligere arbeid har bekreftet at V. fischeri konkurrerer ved hjelp av et kontaktavhengig Type VI-sekresjonssystem som er aktivt på overflate30, noe som gjør forholdene beskrevet i denne analysen egnet for å studere konkurranse mellom eksempelstammene. Det er også viktig å vurdere den første tettheten av celler på lysbildet når du kvantifiserer bakteriell konkurranse. Gitt at kontakt mellom mål- og inhibitorceller ofte er nødvendig for at drap skal skje, bør den blandede kulturen konsentreres slik at cellecellekontakten maksimeres og cellene forblir i et enkelt plan på lysbildet. Cellekulturer bør dyrkes til en lignende optisk tetthet (midtloggfase) og deretter konsentreres for å tvinge kontakt i stedet for bare å vokse kulturer til en høyere optisk tetthet på grunn av de fysiologiske endringene i celler i forskjellige vekstfaser. I andre systemer kan det hende at kulturforhold og det eksperimentelle oppsettet må endres for å sikre at konkurransemekanismen er aktiv og kan oppdages i myntkuubasjonstilstanden.
Agaroseputene som brukes i denne analysen gir flere fordeler: de gir stabilisering slik at cellene ikke beveger seg fritt, og de forhindrer kulturen i å tørke ut i løpet av eksperimentet. I tillegg, hvis kjemiske indusere, som isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG), kreves for eksperimentet, kan de lett legges til agaroseløsningen. Det er imidlertid viktig å merke seg at agarosepreparatet sannsynligvis må justeres for forskjellige systemer. I eksemplet beskrevet ovenfor ble agaroseputen utarbeidet ved å oppløse 2% agarose (w / v) i 20 psu mPBS, som er standard saltholdighet som brukes i V. fischeri vekstmedium. Videre kan det i noen tilfeller hende at en karbonkilde må legges til agaroseputen for at cellene skal vokse og konkurrere om lengre eksperimenter. I et slikt tilfelle kan mPBS i agarose pads erstattes med ethvert vekstmedium, selv om næringsstoffene i vekstmediet kan komme med avveining av ekstra bakgrunnsfluorescens.
Uten proprietær bildeanalyseprogramvare kan det være svært vanskelig å få individuelle celletall når cellecellekontakten er høy, noe som vi viser her er nødvendig for å observere kontaktavhengig drap. Denne analysen ble utformet for å gi en alternativ metode for kvantifisering som ikke er avhengig av individuelle celleantall. I stedet brukes det totale celleområdet for hver fluorescenskanal til å kvantifisere omfanget av drap mellom myntkubaterte stammer. Fordi denne metoden er avhengig av område i stedet for individuelle celleantall, er standard terskelinnstillinger vanligvis tilstrekkelige til å skissere det totale celleområdet. Nøyaktigheten av terring kan verifiseres ved å dele det totale objektområdet for et representativt synsfelt med den gjennomsnittlige cellestørrelsen for modellorganismen og sammenligne dette estimerte cellenummeret med et manuelt celleantall for det samme bildet.
I mynter mellom en inhibitor og en målstamme (ikke-morderisk) forutses netto vekst av inhibitoren. Som sett i figur 4, kan hemmerveksten være betydelig høyere i behandlinger der drap observeres, sammenlignet med behandlinger der drap ikke observeres, kanskje fordi næringsstoffer frigjort av lysende målceller tillater inhibitorstammen å vokse raskere. I eksemplet som vises her, observeres netto måldød fordi T6SS-mediert konkurranse resulterer i målcellelys der målet er fysisk eliminert. Det er imidlertid viktig å merke seg at ikke alle konkurransemekanismer resulterer i fysisk eliminering av målceller. Hvis et mål er ufør av et giftstoff som forårsaker veksthemming, kan protokollen som er skissert her føre til at den synlige målpopulasjonen forblir stabil over tid, da målcellene ikke lenger vokser, men heller ikke lyser. I et slikt tilfelle vil det være hensiktsmessig å sammenligne resultatene av denne analysen med oppfølgingstester for målcelle levedyktighet, for eksempel plating for kolonidannende enheter (CFUer) eller ved å utføre levende døde analyser ved å fargelegge med propidiumjodid eller SYTOX grønn35,36.
Sammenlignet med myntkubasjonsanalyser som er avhengige av CFU-tellinger, gjør denne analysen det mulig å observere og kvantifisere konkurransestrukturen mellom stammer og sporendringer i målcellemorfologi over tid. For eksempel er inhibitorceller som dreper ved hjelp av en T6SS kjent for å kode LysM-domeneproteiner som forringer målcelleveggen, noe som resulterer i første celleavrunding og deretter lysis13, som vi observerte i eksemplet vist i figur 2A. Videre kan denne protokollen brukes til å spore konkurranse med høy oppløsning over svært korte tidsskalaer. I eksemplet som vises her, observeres en betydelig reduksjon i målområdet etter bare to timer når cellene er overfylte og cellecellekontakten tvinges mellom stammer (figur 4). Bildeanalysen beskrevet her kan også utføres ved hjelp av konfektmikroskopi, noe som vil gjøre det mulig å studere bakteriell konkurranse in vivo eller i komplekse biofilmer, uten å forstyrre den romlige fordelingen av myntkubaterte stammer.
Oppsummert har analysen beskrevet her som mål å gi en tilgjengelig og lett modifisert tilnærming for visualisering og kvantifisering av bakteriell konkurranse på encellet nivå ved hjelp av fluorescensmikroskopi. Denne metoden kan brukes på forskjellige bakterieisolasjoner og kan brukes til å visualisere bakteriell konkurranse selv i komplekse miljøer som i en verts- eller biofilmmatrise.
The authors have nothing to disclose.
A.N.S ble støttet av NIGMS grant R35 GM137886 og S.N.S ble støttet av National Defense Science and Engineering Graduate Fellowship Program.
1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
10 uL single channel pipette | |||
1000 uL single channel pipette | |||
20 uL single channel pipette | |||
200 uL single channel pipette | |||
Agarose | Fisher | BP165-25 | Low melting agarose |
Calculator | |||
Cellvis 35 mm Dish | Fisher | NC0409658 | #1.5 cover glass bottom |
Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS) |
DAPI Nucleic Acid Stain | Fisher | EN62248 | optional (if not using stable plasmids) |
FIJI image analysis sofware | ImageJ | https://imagej.net/Fiji/Downloads | open-source software |
Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher | 12-545-81P | #1.5 cover glass; 12 mm diameter |
Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
Lens Cleaning Tissue Paper | Fisher | S24530 | |
Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
Petri Plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
Razor Blades | Fisher | S65921 | |
Semi-micro Cuvettes | VWR | 97000-586 | |
Spectrophotometer | |||
SYBR Green Nucleic Acid Stain | Fisher | S7563 | optional (if not using stable plasmids) |
Thermo Scientific Gold Seal Plain Microscope Slides | Fisher | 12-518-100B | |
Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Cover Glass | Fisher | 22-050-235 | #1.5 cover glass, 25 mm2 |
Type F Immersion Oil | Fisher | NC0297589 | |
Upright or inverted fluorescence microscope with camera and imaging software | Images in this article were acquired on a Nikon TI-2 inverted fluorescent microscope outfitted with an ORCA-Fusion Digital CMOS camera using NIS-Elements software. | ||
Vortex | |||
Water bath | Used to keep agarose warm prior to pipetting | ||
LBS media | |||
1M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
DI water | 950 mL | ||
Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
mPBS (marine PBS) | Phosphate buffered saline with marine salts added; used for making agarose pad | ||
10X PBS | Fisher | ICN1960454 | |
Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS1-160P | Adjust concentration to appropriate salinity; 20 psu used here |
Sterile Vacuum Filter Units | Fisher | SCGVU01RE | Used to filter-sterilize mPBS |
Vacuum pump | Used to filter-sterilize mPBS |