Detta manuskript beskriver en metod för att använda encellig fluorescensmikroskopi för att visualisera och kvantifiera bakteriekonkurrens i kokultur.
Interbacterial konkurrens kan direkt påverka strukturen och funktionen hos mikrobiom. Detta arbete beskriver en fluorescensmikroskopimetod som kan användas för att visualisera och kvantifiera konkurrensinteraktioner mellan olika bakteriestammar på encellsnivå. Protokollet som beskrivs här innehåller metoder för avancerade metoder vid bildberedning på både upprätt och inverterade epifluorescensmikroskop, live-cell- och timelapse-bildtekniker och kvantitativ bildanalys med hjälp av open source-programvaran FIJI. Tillvägagångssättet i detta manuskript beskriver kvantifieringen av konkurrensinteraktioner mellan symbiotiska Vibrio fischeri-populationer genom att mäta förändringen i området över tid för två myntbuberade stammar som uttrycker olika fluorescerande proteiner från stabila plasmider. Alternativa metoder beskrivs för att optimera detta protokoll i bakteriella modellsystem som kräver olika tillväxtförhållanden. Även om den analys som beskrivs här använder villkor optimerade för V. fischeri, är detta tillvägagångssätt mycket reproducerbart och kan enkelt anpassas för att studera konkurrens bland odlingsbara isolat från olika mikrobiom.
Denna artikel beskriver en metod för kvantifiering av bakteriell konkurrens på encellsnivå med fluorescensmikroskopi. Strukturen och funktionen hos mikrobiella samhällen formas ofta av konkurrensinteraktioner mellan mikrober, och i många fall kräver karakterisering av dessa interaktioner att observera olika bakteriestammar i coincubation1,2,3,4,5,6,7,8 . Traditionellt kvantifieras bakteriekonkurrens på befolkningsnivå genom att räkna kolonibildande enheter (CFUs) av inhibitor- och målstammar före och efter en coincubation period2,9. Mekanismer för mikrobiell konkurrens är brett fördelade mellan bakterier och kan förlita sig på antingen diffusion eller cellcellskontakt för att hämmamålcellerna 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19.
Även om bakteriestammar ofta observeras i coincubation på befolkningsnivå, beskriver detta manuskript en analys för encells kvantifiering av bakteriell konkurrens. Vidare innehåller detta arbete förslag på hur protokollet för användning med andra bakteriearter ska anpassas. Medan de specifika teknikerna i denna artikel används för att studera kontaktberoende intraspecifik konkurrens mellan stammar av den symbiotiska bakterien Vibrio fischeri20,21,22, kan de anpassas för konkurrens mellan många organismer. Den här artikeln innehåller instruktioner för bildinställningar på både upprätt och inverterade mikroskop, och all analys beskrivs med hjälp av programvaran FIJI23 med öppen källkod så att metoden kan användas av forskare med tillgång till olika bildinställningar och analysprogram. Med tanke på vikten av att studera mikrobiell konkurrens på både befolkningsnivå och encellsnivå kommer denna metod att vara en värdefull resurs för forskare att kvantifiera konkurrensinteraktioner, särskilt de som inte har tillgång till egenutvecklad analysprogramvara.
Protokollet som beskrivs ovan ger ett kraftfullt verktyg för att kvantifiera och karakterisera interbacterial konkurrens på encellsnivå. Denna analys, som utvecklades genom att modifiera vår CFU-baserade konkurrensanalys påagarplattor 1,2, tillät visualisering av encellskonkurrens bland V. fischeri-isolat och förslag tillhandahålls för att optimera metoden för ett brett spektrum av system och mikroskopiinställningar. Även om metoden som beskrivs här var optimerad för ljusorgan symbiont V. fischeri, kan den lätt modifieras för att rymma många olika, odlingsbara mikrober. Det är viktigt att notera att konkurrenskraftiga mekanismer kan regleras av valfritt antal miljövariabler, inklusive temperatur, salthalt och viskositet30,31,32,33,34. Tidigare arbete har bekräftat att V. fischeri tävlar med hjälp av ett kontaktberoende typ VI-utsöndringssystem som är aktivt påytor 30, vilket gör de villkor som beskrivs i denna analys lämpliga för att studera konkurrens mellan exempelstammarna. Det är också viktigt att överväga den ursprungliga densiteten hos celler på glidningen när man kvantifierar bakteriekonkurrens. Med tanke på att kontakt mellan mål- och hämmarceller ofta krävs för att dödande bör den blandade kulturen koncentreras så att cellcellskontakten maximeras och cellerna förblir i ett enda plan på bilden. Cellkulturer bör odlas till en liknande optisk densitet (mitten av loggfasen) och sedan koncentreras för att tvinga kontakt snarare än att bara växa kulturer till en högre optisk densitet på grund av de fysiologiska förändringarna av celler i olika tillväxtfaser. I andra system kan odlingsförhållanden och försöksinställningar behöva ändras för att säkerställa att konkurrensmekanismen är aktiv och kan detekteras i myntkubationstillstånd.
Agarose pads som används i denna analys ger flera fördelar: de ger stabilisering så att celler inte rör sig fritt, och de hindrar kulturen från att torka ut under experimentet. Dessutom, om kemiska inducerare, såsom isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG), krävs för experimentet, kan de enkelt läggas till agaroslösningen. Det är dock viktigt att notera att agaroseberedningen sannolikt kommer att behöva justeras för olika system. I exemplet som beskrivs ovan, agarose pad förbereddes genom att lösa upp 2% agarose (w/v) i 20 psu mPBS, vilket är standard salthalt som används i V. fischeri tillväxt medium. Dessutom kan i vissa fall en kolkälla behöva läggas till agarosplattan för att cellerna ska kunna växa och konkurrera om längre experiment. I sådana fall kan mPBS i agarose pads ersättas med något tillväxtmedium, även om näringsämnena i tillväxtmedium kan komma med kompromissen av ytterligare bakgrund fluorescens.
Utan egenutvecklad bildanalysprogramvara kan det vara mycket svårt att få enskilda cellantal när cellcellskontakten är hög, vilket som vi visar här krävs för att observera kontaktberoende dödande. Denna analys utformades för att tillhandahålla en alternativ metod för kvantifiering som inte förlitar sig på enskilda cellantal. Istället används den totala cellytan för varje fluorescenskanal för att kvantifiera omfattningen av avlivning mellan myntkuberade stammar. Eftersom den här metoden förlitar sig på områdes- snarare än enskilda cellantal är standardtröskelinställningar vanligtvis tillräckliga för att beskriva det totala cellområdet. Tröskelvärdets noggrannhet kan verifieras genom att dividera den totala objektytan för ett representativt synfält med den genomsnittliga cellstorleken för modellorganismen och jämföra detta uppskattade cellnummer med ett manuellt cellantal för samma bild.
I coincubations mellan en hämmare och en mål (icke-mördare) stam, nettotillväxt av inhibitoren förutspås. Som ses i figur 4kan inhibitortillväxten vara betydligt högre i behandlingar där avlivning observeras, jämfört med behandlingar där avlivning inte observeras, kanske för att näringsämnen som frigörs genom lysande målceller gör att inhibitorstammen kan växa snabbare. I exemplet som visas här observeras nettomåldöd eftersom T6SS-medierad konkurrens resulterar i målcellslys där målet fysiskt elimineras. Det är dock viktigt att notera att inte alla konkurrensmekanismer leder till fysisk eliminering av målceller. Om ett mål är oförmöget av ett toxin som orsakar tillväxthämning, kan protokollet som beskrivs här resultera i att den synliga målpopulationen förblir stabil över tiden eftersom målcellerna inte längre växer men inte heller lysar. I ett sådant fall skulle det vara lämpligt att jämföra resultaten av denna analys med uppföljningstester för målcellens livskraft, såsom plätering för kolonibildande enheter (CFUs) eller genom att utföra levande döda analyser genom färgning med propidiumid eller SYTOX grön35,36.
Jämfört med myntkubationsmedel som förlitar sig på CFU-räkningar, gör denna analys det möjligt att observera och kvantifiera den rumsliga strukturen av konkurrens mellan stammar och spårförändringar i målcellsmorfologi över tid. Till exempel är hämmarceller som dödar med hjälp av en T6SS kända för att koda LysM-domänproteiner som försämrar målcellväggen, vilket resulterar i inledande cellavrundning och sedanlysis 13, som vi observerade i exemplet som visas i figur 2A. Dessutom kan detta protokoll användas för att spåra konkurrens med hög upplösning över mycket korta tidsskalor. I exemplet som visas här observeras en betydande minskning av målområdet efter bara två timmar när celler är trångbodda och cellcellskontakt tvingas mellan stammar (figur 4). Den bildanalys som beskrivs här skulle också kunna utföras med konfokal mikroskopi, vilket skulle göra det möjligt att studera bakteriell konkurrens in vivo eller i komplexa biofilmer, utan att störa den rumsliga fördelningen av myntbuberade stammar.
Sammanfattningsvis syftar den analys som beskrivs här till att ge ett tillgängligt och lätt modifierat tillvägagångssätt för att visualisera och kvantifiera bakteriell konkurrens på encellsnivå med fluorescensmikroskopi. Denna metod kan tillämpas på olika bakterieisolat och kan användas för att visualisera bakteriell konkurrens även i komplexa miljöer som inom en värd- eller biofilmmatris.
The authors have nothing to disclose.
A.N.S stöddes av NIGMS-stipendiet R35 GM137886 och S.N.S stöddes av National Defense Science and Engineering Graduate Fellowship Program.
1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
10 uL single channel pipette | |||
1000 uL single channel pipette | |||
20 uL single channel pipette | |||
200 uL single channel pipette | |||
Agarose | Fisher | BP165-25 | Low melting agarose |
Calculator | |||
Cellvis 35 mm Dish | Fisher | NC0409658 | #1.5 cover glass bottom |
Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS) |
DAPI Nucleic Acid Stain | Fisher | EN62248 | optional (if not using stable plasmids) |
FIJI image analysis sofware | ImageJ | https://imagej.net/Fiji/Downloads | open-source software |
Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher | 12-545-81P | #1.5 cover glass; 12 mm diameter |
Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
Lens Cleaning Tissue Paper | Fisher | S24530 | |
Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
Petri Plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
Razor Blades | Fisher | S65921 | |
Semi-micro Cuvettes | VWR | 97000-586 | |
Spectrophotometer | |||
SYBR Green Nucleic Acid Stain | Fisher | S7563 | optional (if not using stable plasmids) |
Thermo Scientific Gold Seal Plain Microscope Slides | Fisher | 12-518-100B | |
Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Cover Glass | Fisher | 22-050-235 | #1.5 cover glass, 25 mm2 |
Type F Immersion Oil | Fisher | NC0297589 | |
Upright or inverted fluorescence microscope with camera and imaging software | Images in this article were acquired on a Nikon TI-2 inverted fluorescent microscope outfitted with an ORCA-Fusion Digital CMOS camera using NIS-Elements software. | ||
Vortex | |||
Water bath | Used to keep agarose warm prior to pipetting | ||
LBS media | |||
1M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
DI water | 950 mL | ||
Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
mPBS (marine PBS) | Phosphate buffered saline with marine salts added; used for making agarose pad | ||
10X PBS | Fisher | ICN1960454 | |
Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS1-160P | Adjust concentration to appropriate salinity; 20 psu used here |
Sterile Vacuum Filter Units | Fisher | SCGVU01RE | Used to filter-sterilize mPBS |
Vacuum pump | Used to filter-sterilize mPBS |