Este manuscrito descreve um método para o uso de microscopia de fluorescência unicelular para visualizar e quantificar a competição bacteriana na cocultura.
A competição interbacteriana pode impactar diretamente a estrutura e a função dos microbiomas. Este trabalho descreve uma abordagem de microscopia de fluorescência que pode ser usada para visualizar e quantificar interações competitivas entre diferentes cepas bacterianas no nível unicelular. O protocolo descrito aqui fornece métodos para abordagens avançadas na preparação de slides em microscópios de epifluorescência vertical e invertido, técnicas de imagem de células vivas e de lapso de tempo e análise quantitativa de imagens usando o software de código aberto FIJI. A abordagem neste manuscrito descreve a quantificação das interações competitivas entre as populações simbióticas vibrio fischeri medindo a mudança de área ao longo do tempo para duas cepas coincubatizadas que estão expressando diferentes proteínas fluorescentes de plasmídeos estáveis. Métodos alternativos são descritos para otimizar este protocolo em sistemas de modelos bacterianos que requerem diferentes condições de crescimento. Embora o ensaio descrito aqui use condições otimizadas para V. fischeri,essa abordagem é altamente reprodutível e pode ser facilmente adaptada para estudar a concorrência entre isolados culturais de diversos microbiomas.
Este artigo descreve um método para quantificar a competição bacteriana no nível unicelular usando microscopia de fluorescência. A estrutura e função das comunidades microbianas é muitas vezes moldada por interações competitivas entre micróbios, e em muitos casos caracterizar essas interações requer observar diferentes cepas bacterianas na coincubação1,2,3,4,5,6,7,8 . Tradicionalmente, a competição bacteriana é quantificada a nível populacional por meio da contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) de inibidores e cepas alvo antes e depois de um período de coincubação2,9. Os mecanismos de competição microbiana são amplamente distribuídos entre as bactérias e podem contar com difusão ou contato celular para inibir células-alvo10,11,12,13,14,15,16,17,18,19.
Embora as cepas bacterianas sejam frequentemente observadas na coincubação a nível populacional, este manuscrito descreve um ensaio para quantificação unicelular da competição bacteriana. Além disso, este trabalho inclui sugestões para adaptar o protocolo para o uso com outras espécies bacterianas. Embora as técnicas específicas deste artigo sejam utilizadas para estudar a competição intraespecífica dependente de contato entre cepas da bactéria simbiótica Vibrio fischeri20,21,22, elas podem ser adaptadas para a competição entre muitos organismos. Este artigo fornece instruções para a configuração de slides em microscópios eretos e invertidos, e toda a análise é descrita usando o software de código aberto FIJI23 para que o método possa ser usado pelos pesquisadores com acesso a diferentes configurações de imagem e programas de análise. Dada a importância de estudar a concorrência microbiana tanto no nível populacional quanto em células únicas, esse método será um recurso valioso para os pesquisadores quantificarem as interações competitivas, particularmente aquelas que não têm acesso a softwares de análise proprietários.
O protocolo descrito acima fornece uma poderosa ferramenta para quantificar e caracterizar a competição interbacteriana no nível de célula única. Este ensaio, que foi desenvolvido modificando nosso ensaio de competição baseado em CFU em placasde ágar 1,2, permitiu a visualização da competição unicelular entre isolados e sugestões de V. fischeri para otimizar o método para uma ampla gama de sistemas e configurações de microscopia. Embora o método descrito aqui tenha sido otimizado para o simbionte de órgãos leves V. fischeri,ele pode ser facilmente modificado para acomodar muitos micróbios diversos e culturais. É importante notar que mecanismos competitivos podem ser regulados por qualquer número de variáveis ambientais, incluindo temperatura, salinidade e viscosidade30,31,32,33,34. Trabalhos anteriores confirmaram que V. fischeri compete utilizando um sistema de secreção tipo VI dependente de contato que está ativo nas superfícies30, tornando as condições descritas neste ensaio adequadas para o estudo da competição entre as cepas de exemplo. Também é importante considerar a densidade inicial das células no slide ao quantificar a competição bacteriana. Dado que o contato entre células alvo e inibidoras é frequentemente necessário para que a matança ocorra, a cultura mista deve ser concentrada de tal forma que o contato celular-célula é maximizado e as células permanecem em um único plano na lâmina. As culturas celulares devem ser cultivadas para uma densidade óptica semelhante (fase de tronco médio) e, em seguida, concentradas para forçar o contato em vez de simplesmente cultivar culturas para uma densidade óptica maior devido às mudanças fisiológicas das células em diferentes fases de crescimento. Em outros sistemas, as condições de cultura e a configuração experimental podem precisar ser modificadas para garantir que o mecanismo competitivo esteja ativo e possa ser detectado na condição de coincubação.
As almofadas de agarose usadas neste ensaio proporcionam vários benefícios: elas fornecem estabilização para que as células não se movam livremente, e impedem que a cultura seque ao longo do experimento. Além disso, se os indutores químicos, como isopropílico-β-D-thiogalactoside (IPTG), são necessários para o experimento, eles podem ser facilmente adicionados à solução agarose. No entanto, é importante notar que a preparação de agarose provavelmente precisará ser ajustada para diferentes sistemas. No exemplo descrito acima, a almofada agarose foi preparada dissolvendo 2% de agarose (w/v) em 20 psu mPBS, que é a salinidade padrão usada no meio de crescimento V. fischeri. Além disso, em alguns casos, uma fonte de carbono pode precisar ser adicionada à almofada de agarose para que as células cresçam e concorram por experimentos mais longos. Nesse caso, o mPBS em almofadas de agarose pode ser substituído por qualquer meio de crescimento, embora os nutrientes no meio de crescimento possam vir com a troca de fluorescência de fundo adicional.
Sem um software proprietário de análise de imagem, pode ser muito difícil obter contagem individual de células quando o contato celular é alto, o que, como mostramos aqui, é necessário observar mortes dependentes de contato. Este ensaio foi projetado para fornecer um método alternativo de quantificação que não depende de contagem de células individuais. Em vez disso, a área celular total para cada canal de fluorescência é usada para quantificar a extensão da matança entre cepas coincubatizadas. Como este método se baseia em área em vez de contagens de células individuais, as configurações de limiar padrão são tipicamente suficientes para delinear a área total da célula. A precisão do limiar pode ser verificada dividindo a área total do objeto para um campo de visão representativo pelo tamanho médio da célula para o organismo modelo e comparando este número celular estimado com uma contagem manual de células para a mesma imagem.
Em co-empréstimos entre um inibidor e um alvo (não-assassino), prevê-se o crescimento líquido do inibidor. Como visto na Figura 4,o crescimento do inibidor pode ser significativamente maior nos tratamentos onde a matança é observada, em comparação com os tratamentos onde a matança não é observada, talvez porque os nutrientes liberados pelas células-alvo permitem que a cepa inibidora cresça mais rapidamente. No exemplo aqui mostrado, a morte por alvo líquido é observada porque a concorrência mediada pelo T6SS resulta em lise celular alvo onde o alvo é fisicamente eliminado. No entanto, é importante notar que nem todos os mecanismos competitivos resultam na eliminação física das células-alvo. Se uma meta é incapacitada por uma toxina que causa inibição do crescimento, o protocolo aqui descrito pode fazer com que a população-alvo visível se adeque estável ao longo do tempo, pois as células-alvo não crescem mais, mas também não crescem. Nesse caso, seria apropriado comparar os resultados deste ensaio com testes de acompanhamento para viabilidade celular alvo, como revestimento para unidades formadoras de colônias (UFC) ou por meio da realização de ensaios mortos vivos por manchas com iodeto de propídio ou SYTOX verde35,36.
Comparado aos ensaios de coincubação que dependem das contagens da UFC, este ensaio permite observar e quantificar a estrutura espacial da competição entre cepas e rastrear mudanças na morfologia celular alvo ao longo do tempo. Por exemplo, as células inibidoras que matam usando um T6SS são conhecidas por codificar proteínas de domínio lysM que degradam a parede celular alvo, resultando em arredondamento inicial celular e, em seguida, lise13, que observamos no exemplo mostrado na Figura 2A. Além disso, este protocolo pode ser usado para acompanhar a concorrência em alta resolução em escalas de tempo muito curtas. No exemplo aqui mostrado, observa-se uma diminuição significativa na área alvo após apenas duas horas em que as células estão lotadas e o contato celular-célula é forçado entre as cepas(Figura 4). A análise de imagem aqui descrita também poderia ser realizada por meio de microscopia confocal, o que permitiria estudar a concorrência bacteriana in vivo ou em biofilmes complexos, sem interromper a distribuição espacial de cepas coincubatadas.
Em resumo, o ensaio aqui descrito visa fornecer uma abordagem acessível e facilmente modificada para visualizar e quantificar a competição bacteriana no nível unicelular usando microscopia de fluorescência. Este método pode ser aplicado a diversos isolados bacterianos e pode ser usado para visualizar a competição bacteriana mesmo em ambientes complexos, como dentro de uma matriz hospedeira ou biofilm.
The authors have nothing to disclose.
A A.N.S foi apoiada pela bolsa NIGMS R35 GM137886 e a S.N.S foi apoiada pelo National Defense Science and Engineering Graduate Fellowship Program.
1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
10 uL single channel pipette | |||
1000 uL single channel pipette | |||
20 uL single channel pipette | |||
200 uL single channel pipette | |||
Agarose | Fisher | BP165-25 | Low melting agarose |
Calculator | |||
Cellvis 35 mm Dish | Fisher | NC0409658 | #1.5 cover glass bottom |
Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS) |
DAPI Nucleic Acid Stain | Fisher | EN62248 | optional (if not using stable plasmids) |
FIJI image analysis sofware | ImageJ | https://imagej.net/Fiji/Downloads | open-source software |
Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher | 12-545-81P | #1.5 cover glass; 12 mm diameter |
Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
Lens Cleaning Tissue Paper | Fisher | S24530 | |
Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
Petri Plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
Razor Blades | Fisher | S65921 | |
Semi-micro Cuvettes | VWR | 97000-586 | |
Spectrophotometer | |||
SYBR Green Nucleic Acid Stain | Fisher | S7563 | optional (if not using stable plasmids) |
Thermo Scientific Gold Seal Plain Microscope Slides | Fisher | 12-518-100B | |
Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Cover Glass | Fisher | 22-050-235 | #1.5 cover glass, 25 mm2 |
Type F Immersion Oil | Fisher | NC0297589 | |
Upright or inverted fluorescence microscope with camera and imaging software | Images in this article were acquired on a Nikon TI-2 inverted fluorescent microscope outfitted with an ORCA-Fusion Digital CMOS camera using NIS-Elements software. | ||
Vortex | |||
Water bath | Used to keep agarose warm prior to pipetting | ||
LBS media | |||
1M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
DI water | 950 mL | ||
Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
mPBS (marine PBS) | Phosphate buffered saline with marine salts added; used for making agarose pad | ||
10X PBS | Fisher | ICN1960454 | |
Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS1-160P | Adjust concentration to appropriate salinity; 20 psu used here |
Sterile Vacuum Filter Units | Fisher | SCGVU01RE | Used to filter-sterilize mPBS |
Vacuum pump | Used to filter-sterilize mPBS |