यहां, हम एक ऑप्टिकल ट्रैप द्वारा प्रत्यक्ष बल माप के साथ तीन आयामी कारावास में अलग-थलग भ्रूण जेब्राफ़िश कोशिकाओं के इंट्रासेल्युलर यांत्रिक गुणों की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
एक बहुकोशिकीय जीव के विकास के दौरान, एक एकल निषेचित कोशिका विभाजित होती है और विविध कार्यों के साथ कई ऊतकों को जन्म देती है। ऊतक morphogenesis एकल सेल स्तर पर आणविक और संरचनात्मक परिवर्तनों के साथ हाथ में चला जाता है जिसके परिणामस्वरूप उपकोशिकीय यांत्रिक गुणों की विविधताएं होती हैं। नतीजतन, यहां तक कि एक ही सेल के भीतर, विभिन्न ऑर्गेनेल और डिब्बे यांत्रिक तनाव के लिए अलग-अलग विरोध करते हैं; और mechanotransduction pathways सक्रिय रूप से उनके यांत्रिक गुणों को विनियमित कर सकते हैं। ऊतक आला के माइक्रोएन्वायरमेंट के अनुकूल होने के लिए एक सेल की क्षमता इस प्रकार यांत्रिक तनावों को समझने और प्रतिक्रिया करने की क्षमता के कारण भाग में है। हमने हाल ही में एक नया मेकेनोसेंसेशन प्रतिमान प्रस्तावित किया है जिसमें परमाणु विरूपण और पोजिशनिंग एक सेल को भौतिक 3 डी वातावरण को मापने में सक्षम बनाता है और सेल के आकार में परिवर्तन को डिकोड करने के लिए प्रोप्रियोसेप्शन की भावना के साथ सेल को संपन्न करता है। इस लेख में, हम उन बलों और भौतिक गुणों को मापने के लिए एक नई विधि का वर्णन करते हैं जो जीवित कोशिकाओं के अंदर सेल नाभिक को आकार देते हैं, जो अनुयायी कोशिकाओं और यांत्रिक रूप से सीमित कोशिकाओं पर उदाहरण देते हैं। माप को कोशिकाओं के अंदर ऑप्टिकल ट्रैप के साथ गैर-आक्रामक रूप से किया जा सकता है, और बल सीधे प्रकाश गति के अंशांकन-मुक्त पहचान के माध्यम से सुलभ होते हैं। यह कोशिका सतह विरूपण से स्वतंत्र रूप से नाभिक के यांत्रिकी को मापने और बहिर्ग्रहणशील और इंटरोसेप्टिव मेचानोट्रांसडक्शन मार्गों के विच्छेदन की अनुमति देता है। महत्वपूर्ण रूप से, ट्रैपिंग प्रयोग को साइटोस्केलेटन, कैल्शियम आयनों या परमाणु आकृति विज्ञान के प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग करके सेलुलर प्रतिक्रिया और उपकोशिकीय गतिशीलता की जांच करने के लिए ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ जोड़ा जा सकता है। प्रस्तुत विधि लागू करने के लिए सीधी है, बल माप के लिए वाणिज्यिक समाधानों के साथ संगत है, और आसानी से अन्य उपकोशिकीय डिब्बों के यांत्रिकी की जांच करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया, तनाव-फाइबर और एंडोसोम।
ऊतक मॉर्फोजेनेसिस एक जटिल प्रक्रिया है जिसमें जैव रासायनिक संकेतों और भौतिक बलों को spatiotemporally समन्वित किया जाता है। विकासशील भ्रूण में, जैव रासायनिक सिग्नलिंग कारकों के ग्रेडिएंट भाग्य विनिर्देशन को निर्देशित करते हैं और सही ऊतक पैटर्निंग 1,2 सुनिश्चित करते हैं। एक ही समय में, आंतरिक और बाह्य बल भ्रूण 3,4 की वास्तुकला के निर्माण में एक भूमिका निभाते हैं। इस संदर्भ में सेल कॉर्टेक्स यांत्रिकी के प्रभाव का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है5,6। मॉर्फोजेनेसिस के दौरान मेचानो-रासायनिक प्रक्रियाओं के बीच तंग इंटरकनेक्शन एकल कोशिकाओं के गुणों पर निर्भर करता है ताकि वे अपने ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट में यांत्रिक बलों को समझ सकें और उनका जवाब दे सकें। कोशिकाएं, इस प्रकार बल-संवेदनशील उपकोशिकीय और आणविक तत्वों की उपस्थिति के माध्यम से यांत्रिक संकेतों को डीकोड करती हैं जो यांत्रिक जानकारी को सेल व्यवहार, सेल भाग्य और सेल यांत्रिकी को नियंत्रित करने वाले विशिष्ट सिग्नलिंग मार्गों में ट्रांसड्यूस करती हैं।
विकास प्रक्रियाओं की एक पहचान यह है कि कोशिकाएं बहुकोशिकीय संरचनाओं के निर्माण के लिए समूहों के रूप में व्यवस्थित होती हैं। इस प्रकार, एकल कोशिकाएं शायद ही कभी पुनर्व्यवस्थित होती हैं और अकेले चलती हैं, लेकिन एक तंग सोशियोटॉप में जुड़ी होती हैं जिसमें वे सामूहिक व्यवहार दिखाते हैं जैसे कि सुप्रासेलुलर माइग्रेशन 7, (संयुक्त राष्ट्र) जैमिंग संक्रमण8,9 या ब्लास्टोसिस्ट संघनन 10। कोशिकाओं के भीतर और उनके बीच उत्पन्न यांत्रिक बल सामूहिक सेल गतिशीलता 7,11 को निर्देश देने के लिए महत्वपूर्ण संकेतों के रूप में कार्य करते हैं। लेकिन यहां तक कि जब कोशिकाएं अकेले चलती हैं, जैसे कि पूर्वज कोशिकाएं जो ऊतक शीट या संकीर्ण ऊतक niches के बीच अपना रास्ता निचोड़ती हैं, तो वे तीन आयामी वातावरण को नेविगेट करते समय व्यापक अनिसोट्रोपिक यांत्रिक बलों का अनुभव करते हैं। कोशिकाओं पर इन यांत्रिक तनावों के सेलुलर व्यवहार पर गहरा परिणाम होता है12,13। कई तंत्रों की जांच की गई है जो नाभिक पर एक प्रमुख मेचानोट्रांसडक्शन तत्व 14,15 के रूप में अभिसरण करते हैं, एक घने 3 डी ऊतक वातावरण 15,16 के भीतर प्रवास के दौरान निष्क्रिय या सक्रिय यांत्रिक तत्व के रूप में।
हमने हाल ही में एक तंत्र प्रस्तावित किया है जो कोशिकाओं को एक लोचदार इंट्रासेल्युलर मेचानो-गेज 12 के रूप में नाभिक का उपयोग करके आकार विरूपण को मापने के लिए लैस करता है। नाभिक, एक कोशिका में सबसे बड़ा ऑर्गेनेल होने के नाते, बड़े विरूपण से गुजरता है जब कोशिकाएं ध्रुवीकरण करती हैं, माइग्रेट करती हैं, या यांत्रिक खिंचाव, कारावास, या आसमाटिक तनाव 16,17,18,19 के तहत अपने आकार को बदल देती हैं। हमने पाया कि नाभिक की इंट्रासेल्युलर स्थिति के साथ-साथ परमाणु लिफाफा खिंचाव कोशिकाओं को कोशिका विरूपण के परिमाण और प्रकार (जैसे सेल संपीड़न बनाम सेल सूजन) के बारे में जानकारी प्रदान करता है। नाभिक का खिंचाव आंतरिक परमाणु झिल्ली (आईएनएम) के एक खुलासे के साथ जुड़ा हुआ है, जो आईएनएम में कैल्शियम-निर्भर सीपीएलए 2 (साइटोसोलिक फॉस्फोलिपिस ए 2) लाइपेस गतिविधि को बढ़ावा देता है, जिसके बाद अराकिडोनिक एसिड (एए) की रिहाई और सेल कॉर्टेक्स में मायोसिन II की तेजी से सक्रियण होती है। यह कॉर्टिकल संकुचन 6 की दहलीज से ऊपर सेल संकुचन और अमीबोइड सेल माइग्रेशन में वृद्धि की ओर जाता है। सेल विरूपण के लिए mechanosensitive प्रतिक्रिया एक मिनट से भी कम समय में होती है और कारावास रिलीज पर प्रतिवर्ती होती है, यह सुझाव देते हुए कि नाभिक यांत्रिक तनाव की स्थिति में अनुकूली सेल व्यवहार को विनियमित करने वाले सेलुलर प्रोप्रियोसेप्शन के लिए एक तनाव गेज के रूप में कार्य करता है। इस mechanosensitive मार्ग को ज़ेब्राफ़िश भ्रूण से व्युत्पन्न पूर्वज स्टेम कोशिकाओं में सक्रिय दिखाया गया है, दोनों प्लुरिपोटेंट और वंश-प्रतिबद्ध कोशिकाओं में 12 और विभिन्न प्रजातियों और सेल लाइनों 20 में संरक्षित है।
एक सेल-मेचानोसेंसर के रूप में परमाणु गुणों के अलावा, परमाणु वास्तुकला और यांत्रिकी को विकास के दौरान और सेल भाग्य विनिर्देश 21 के जवाब में आंतरिक रूप से विनियमित किया जाता है, इसलिए सेलुलर मेचानो-संवेदनशीलता 22,23 को ट्यूनिंग किया जाता है। परिणाम परमाणु अनुपालन में एक परिवर्तन हो सकता है जो एक प्रवासी राज्य में एक पूर्वव्यापी से रूपात्मक परिवर्तन और संक्रमण की अनुमति देता है और इसके विपरीत।
सेल नाभिक यांत्रिकी को मापने के लिए कई तकनीकों को लागू किया गया है, जैसे कि परमाणु बल माइक्रोस्कोपी 24,25, माइक्रोपिपेट आकांक्षा 26,27, माइक्रोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकी 28, और माइक्रोनीडल29। हालांकि, इनमें से कई तकनीकें इस अर्थ में आक्रामक हैं कि पूरे सेल को विकृत किया जाना चाहिए, यांत्रिक विशेषताओं और नाभिक की बल-निर्भर प्रतिक्रियाओं के माप को सीमित करना। सेल की सतह और इसके मेकानोसेंसिटिव सेल कॉर्टेक्स 30 के एक साथ विरूपण को दरकिनार करने के लिए, विभिन्न संदर्भों 31,32 में अलग-थलग नाभिक का अध्ययन किया गया था। हालांकि, इस बात से इनकार नहीं किया जा सकता है कि परमाणु अलगाव यांत्रिक नाभिक गुणों और उनके विनियमन (संदर्भ 24 और स्वयं के अप्रकाशित अवलोकनों) में बदलाव के साथ जुड़ा हुआ है।
ऑप्टिकल चिमटी (ओटी) एक बहुमुखी तकनीक है जिसने सेल मेचानोबायोलॉजी में प्रयोगों की अधिकता की अनुमति दी है और हमारी समझ में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है कि आणविक मशीनें रासायनिक को यांत्रिक ऊर्जा में कैसे परिवर्तित करती हैं33,34। ऑप्टिकल चिमटी एक कसकर केंद्रित लेजर बीम का उपयोग ढांकता हुआ कणों पर ऑप्टिकल बलों को लागू करने के लिए करती है जिसमें आसपास के माध्यम 33 की तुलना में एक अपवर्तक सूचकांक अधिक होता है। इस तरह के बल सैकड़ों पिको-न्यूटन के क्रम के हो सकते हैं और इसके परिणामस्वरूप लेजर ट्रैप फोकस के भीतर कण का प्रभावी कारावास हो सकता है, जिससे तीन आयामों में फंसे हुए कण के हेरफेर को सक्षम किया जा सकता है। प्रकाश के उपयोग का एक महत्वपूर्ण लाभ है कि माप को जीवित कोशिकाओं के अंदर गैर-आक्रामक रूप से किया जा सकता है। ऑप्टिकल जोड़तोड़ आगे लेजर बीम के जाल फोकस तक सीमित हैं। इसलिए, हेरफेर आसपास के सेलुलर झिल्ली को उत्तेजित किए बिना किया जा सकता है और प्लाज्मा झिल्ली पर एक्टिन कॉर्टेक्स या मेकेनोसेंसिटिव प्रक्रियाओं को परेशान नहीं करता है, जैसे कि आयन चैनलों का बल-निर्भर सक्रियण।
ऑप्टिकल चिमटी दृष्टिकोण की कठिनाई शास्त्रीय दृष्टिकोण का उपयोग करके माइक्रोस्फीयर पर लागू बलों को ठीक से निर्धारित करना है जो समविभाजन प्रमेय के आधार पर अप्रत्यक्ष बल अंशांकन पर भरोसा करते हैं या लेजर-पावर निर्भर भागने के बल को मापने के लिए परिभाषित स्टोक्स-ड्रैग बलों के उपयोग पर भरोसा करते हैं। जबकि ये तरीके इन विट्रो प्रयोग में लागू करने के लिए सरल हैं, उन्हें आमतौर पर सेलुलर वातावरण में अनुवाद ति नहीं किया जा सकता है। इस क्षेत्र में कई रणनीतियों को पेश किया गया है जो एक प्रत्यक्ष बल अंशांकन पर भरोसा करते हैं, जो गति संरक्षण के पहले सिद्धांतों से व्युत्पन्न हैं36,37। अन्य बल स्पेक्ट्रोस्कोपी दृष्टिकोणों के विपरीत, बल माप को मनमाने ढंग से आकार के फंसे हुए कण 38,39 के साथ प्रकाश गति के स्थानीय इंटरचेंज से निकाला जाता है। हमारे प्रयोगात्मक सेट-अप में, ऑप्टिकल बलों से उत्पन्न प्रकाश संवेग में परिवर्तन को सीधे सीटू ट्रैप कैलिब्रेशन 40,41,42,43 की आवश्यकता के बिना मापा जाता है। इस प्रकार, माप एक चिपचिपा वातावरण में संभव हो जाते हैं जैसे कि सेल के इंटीरियर या यहां तक कि एक ऊतक के भीतर भी, और बलों को आसानी से पीएन स्तर तक मापा जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में, हम एक परख का वर्णन करने के लिए यंत्रवत् इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल या संरचनाओं में हेरफेर और मात्रात्मक रूप से एक ऑप्टिकल चिमटी सेट-अप द्वारा उनके यांत्रिक गुणों का आकलन. इस सेट-अप को एक कताई डिस्क फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप में एकीकृत किया जाता है जो सेलुलर व्यवहार या इंट्रासेल्युलर गतिशीलता के समानांतर इमेजिंग को सक्षम करता है। परख विशिष्ट सेलुलर डिब्बों के यांत्रिक गुणों के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है, जैसे कि नाभिक, जबकि एक साथ विरूपण के परिणामस्वरूप आणविक सिग्नलिंग मार्गों के संभावित मेकेनोरेस्पोन्स और सक्रियण का अध्ययन करता है। इसके अलावा, कोशिकाओं के भीतर इंजेक्ट किए गए माइक्रोबीड्स के ऑप्टिकल ट्रैपिंग नाभिक के आंतरिक अपवर्तक विपरीत ( एन ~ 1.35) बनाम साइटोप्लाज्म (एन ~ 1.38) की तुलना में पॉलीस्टीरीन मनका (एन = 1.59) के काफी अधिक अपवर्तक सूचकांक के लिए इंडेंटेशन बल में वृद्धि की अनुमति देता है। प्रस्तुत रणनीति को अन्य इंट्रासेल्युलर संरचनाओं और ऑर्गेनेल के अध्ययन के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है, साथ ही साथ सक्रिय माइक्रोरहोलॉजी से जुड़े अन्य दृष्टिकोण, एक ही / विभिन्न उप-सेलुलर संरचनाओं की एक साथ जांच करने के लिए कई ऑप्टिकल ट्रैप का उपयोग, और जीवित भ्रूण में सेल मेकेनोबायोलॉजी को लक्षित करने वाले माप।
इस प्रोटोकॉल में, हम जीवित कोशिकाओं के अंदर कोशिका नाभिक के यांत्रिक गुणों से पूछताछ करने के लिए एक अनूठी विधि का वर्णन करते हैं। अन्य बल स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीकों के लिए अलग, गैर-इनवेसिव ऑप्टिकल ट्रैपिंग ने हमें सेल परमाणु कठोरता से सेल झिल्ली और साइटोस्केलेटन के योगदान को कम करने की अनुमति दी। महत्वपूर्ण रूप से, ऑप्टिकल माइक्रोमैनिपुलेशन मल्टीमॉडल माइक्रोस्कोपी के साथ संगत है, जो प्रयोगकर्ता को सेल परमाणु मेचानोबायोलॉजी में शामिल विभिन्न प्रक्रियाओं का अध्ययन करने की अनुमति देगा। एक प्रतिनिधि परिणाम के रूप में, हमने कई सैकड़ों पिकोन्यूटन के आदेश के बलों द्वारा किए गए इंडेंटेशन पर नाभिक विरूपण को मापने के लिए डीएनए-होचस्ट स्टेनिंग का उपयोग किया।
इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित उदाहरणों से परे हमारी विधि के संभावित अनुप्रयोग
बाहरी बाधाओं के बिना जीवित कोशिकाओं के अंदर माप से मात्रात्मक यांत्रिक जानकारी निकालने की संभावना अभूतपूर्व अवसरों की अधिकता को सक्षम करती है जो अभी-अभी पता लगाना शुरू कर रहे हैं। इस प्रकार, हमारे ऑप्टिकल माइक्रोमैनिपुलेशन प्लेटफ़ॉर्म के प्रस्तुत प्रोटोकॉल को महान बहुमुखी प्रतिभा के साथ अधिक जटिल प्रयोगों तक बढ़ाया जा सकता है। Acousto-ऑप्टिक deflectors (AOD) विभिन्न सेल स्थानों में तुल्यकालिक बल माप के लिए कई ऑप्टिकल जाल उत्पन्न कर सकते हैं, साथ ही साथ एक विस्तृत आवृत्ति रेंज 51,61 में सक्रिय माइक्रोरहोलॉजी के लिए उपयोग किया जा सकता है। जैसा कि उल्लेख किया गया है, इंडेंटेशन पर बल प्रतिक्रिया अधिकतम फँसाने वाले बल को दूर कर सकती है, जिससे ऑप्टिकल ट्रैप से मनका का पलायन हो सकता है। इस मामले में, ऑप्टिकल बल को क्लैंप करने के लिए एओडी के साथ एक बल प्रतिक्रिया को कॉन्फ़िगर किया जा सकता है। कुल मिलाकर, कई माइक्रोरियोलॉजिकल दृष्टिकोण, जैसे कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित तनाव छूट, लेकिन सक्रिय माइक्रोरहोलॉजी या रेंगना अनुपालन भी, इस मंच के साथ प्रयोगात्मक रूप से प्राप्त किया जा सकता है और उपन्यास सॉफ़्टवेयर पैकेज61,62,63,64,65 द्वारा पूरी तरह से विश्लेषण किया जा सकता है। . इसके अलावा, बलों का अनुप्रयोग नाभिक तक सीमित नहीं है, लेकिन सिद्धांत रूप में विविध इंट्रासेल्युलर संरचनाओं को मापने के लिए और जटिल ऊतकों में किया जा सकता है जैसा कि बरकरार रक्त वाहिकाओं के अंदर बहने वाली लाल रक्त कोशिकाओं को फँसाने के लिए प्रदर्शित किया गया है66,67 या क्लोरोप्लास्ट और माइटोकॉन्ड्रिया को फँसाने और विकृत करने के लिए प्रदर्शित किया गया है68 . प्रकाश-संवेग अंशांकन फंसी हुई वस्तु के आकार और आकार से स्वतंत्र है, इसलिए मनमाने ढंग से आकार 38,39 के साथ किसी भी बल जांच पर प्रत्यक्ष बल माप को सक्षम करता है। इंजेक्ट किए गए माइक्रोस्फीयर के उपयोग ने हमें सेलुलर संरचनाओं के प्रत्यक्ष हेरफेर की तुलना में अपेक्षाकृत कम लेजर शक्ति के साथ नाभिक पर उच्च बलों को लागू करने की अनुमति दी69,70,71। हालांकि, एक उच्च पर्याप्त अपवर्तक सूचकांक अंतर को देखते हुए, कोई बाहरी रूप से लागू बल जांच आवश्यक नहीं है और इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल को इंजेक्ट किए गए मोतियों (अप्रकाशित टिप्पणियों और संदर्भ 70) के बिना सीधे हेरफेर किया जा सकता है।
अनुप्रयोगों का विस्तार करने के लिए हमारी विधि के संभावित संशोधनों
प्रयोग के आधार पर माइक्रोबीड्स के विभिन्न आकारों को इंजेक्ट किया जा सकता है, लेकिन सापेक्ष नियंत्रण किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, बाद के चरणों में कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए छोटे मोतियों को इंजेक्ट किया जा सकता है। यह ऑप्टिकल ट्रैप द्वारा लगाए जा सकने वाले अधिकतम बल को कम कर देगा (जैसे कि संदर्भ 55 में दिखाया गया है)। बड़े मोतियों को उच्च बलों को लागू करने के लिए इंजेक्ट किया जा सकता है, लेकिन ये उनके आकार या रुचि के चरण के आधार पर भ्रूण के विकास को प्रभावित कर सकते हैं। प्रयोगों में जहां माइक्रोबीड इंजेक्शन एक विकल्प नहीं है, साइटोप्लाज्म की तुलना में अपवर्तक सूचकांक अंतर प्रदर्शित करने वाले विभिन्न ऑर्गेनेल को अभी भी ऑप्टिकल रूप से हेरफेर किया जा सकता है, जिससे प्रकाश गति परिवर्तन 42 से औसत दर्जे के ऑप्टिकल बलों को जन्म मिलता है। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, इन विधियों को ड्रोसोफिला भ्रूण 70 में सेल-सेल जंक्शनों को विकृत करने के लिए बंबार्डेकर एट अल द्वारा नियोजित किया गया है। इसी तरह, सेल के नाभिक में आसपास के माध्यम 44 की तुलना में कम अपवर्तक सूचकांक होता है, जो मनका-मुक्त इंडेंटेशन (अप्रकाशित टिप्पणियों और संदर्भ 72) के लिए अनुमति देता है, भले ही कम फँसाने की ताकत के साथ। इस प्रकार, नाभिक को आसानी से नहीं फंसाया जा सकता है और जाल से बच जाता है।
स्पिन-लेपित पीडीएमएस स्पेसर एक सुविधाजनक और तेज विधि के माध्यम से गढ़ा गया है, लेकिन एक माइक्रो-/ नैनोफैब्रिकेशन सुविधा या इंजीनियरिंग प्रयोगशालाओं तक पहुंच के बिना प्रयोगशालाओं के लिए पहुंच से बाहर हो सकता है। इस प्रकार, स्पेसर को आसानी से प्रयोगशाला टेप या पैराफिल्म (चरण 4) से इकट्ठा किया जा सकता है। प्रोटोकॉल को माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के निर्माण द्वारा भी अनुकूलित किया जा सकता है जो एकल कोशिकाओं के वितरण को पूर्वनिर्धारित माप कुओं में या एक ही नमूने के भीतर कारावास प्रभाव का अनुमान लगाने के लिए एक परिभाषित ऊंचाई वाले कक्ष में स्वचालित करते हैं। हालांकि, इस तरह के माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को डिज़ाइन किया जाना चाहिए ताकि वे माइक्रोस्कोप उद्देश्य और ऑप्टिकल फोर्स सेंसर के संग्रह लेंस के बीच की जगह को फिट कर सकें, लगभग 2 मिमी (चरण 3 देखें)। ध्यान दें कि ऑप्टिकल बल सेंसर को उचित ऊंचाई पर तैनात किया जाना चाहिए ताकि डीफोकसिंग से कोई ऑप्टिकल विपथन फोटॉन संवेग माप को प्रभावित न करे।
अन्य संशोधनों में जैविक पत्रकारों का परिवर्तन शामिल हो सकता है। हमने पाया कि Hoechst प्रतिदीप्ति वर्णक्रमीय रूप से GFP चैनल में खून बहता है और हम इस प्रकार दो फ्लोरोसेंट चैनलों में एक साथ माप के लिए एक परमाणु मार्कर के रूप में mCherry-टैग हिस्टोन के साथ संयोजन का पक्ष लेते हैं। वैकल्पिक रूप से, परमाणु विरूपण को आसानी से आंतरिक परमाणु झिल्ली जैसे Lap2b-GFP (चित्रा 2) के लिए लक्षित लेबल के साथ ट्रैक किया जा सकता है।
सेल नाभिक पर इंडेंटेशन 2-3 माइक्रोन के क्रम का था, जिसे हम विवर्तन-सीमित कताई-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के छवि विश्लेषण द्वारा सटीक रूप से माप सकते थे। stiffer नाभिक या छोटे बलों के मामले के लिए, इंडेंटेशन इस दृष्टिकोण का उपयोग करके मुश्किल से औसत दर्जे का होगा। हालांकि, निरपेक्ष बल-कैलिब्रेटेड ऑप्टिकल चिमटी को नैनोमीटर सटीकता 51 के साथ बीएफपी इंटरफेरोमेट्री का उपयोग करके सीटू में फंसे मनके की स्थिति माप के लिए भी कैलिब्रेट किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, वोल्टेज सिग्नल और ऑप्टिकल फोर्स सेंसर को पैरामीटर β [nm / V] के माध्यम से फंसे हुए जांच की स्थिति में अनुवादित किया जा सकता है, जबकि अपरिवर्तनीय पैरामीटर α [pN / V] उपर्युक्त प्रकाश-संवेग अंशांकन 41 के माध्यम से बल मूल्यों की पैदावार करता है (विवरण के लिए नीचे देखें)।
समस्या निवारण
हमने पाया कि प्रयोग के दौरान निम्नलिखित चुनौतियां हो सकती हैं:
कोई स्थिर जाल नहीं बनता है और माइक्रोस्फीयर आसानी से बच जाता है
माइक्रोस्कोप उद्देश्य या एक misaligned सुधार कॉलर पर किसी भी गंदगी एक स्थिर जाल की विफलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। यदि कोई तात्कालिक समाधान नहीं मिलता है, तो उद्देश्य लेंस के बिंदु-प्रसार फ़ंक्शन को मापें। यदि ब्याज का नमूना ऑप्टिकल रूप से घने ऊतक के अंदर गहरा है, तो लेजर फोकस गंभीर ऑप्टिकल विपथन का अनुभव कर सकता है जिससे अस्थिर फँसाया जा सकता है (यह प्रभाव आमतौर पर अलग-थलग कोशिकाओं में नगण्य होता है लेकिन मोटे ऊतकों में अधिक स्पष्ट हो जाता है)। उच्च कठोरता के लिए, नाभिक का पुनर्स्थापना बल जाल के भागने के बल से अधिक हो सकता है, जैसे कि माइक्रोस्फीयर खो जाता है और इंडेंटेशन रूटीन विफल हो जाता है। प्रारंभ में, ऑप्टिकल ट्रैप के निकटस्थ परमाणु झिल्ली किनारे को शायद ही इंडेंट किया जाता है (चित्रा S2A)। जब ऐसा होता है, तो फँसाने वाला लेजर अब बल और ब्राउनियन गति से प्रभावित नहीं होता है, जो शून्य तक बल ड्रॉप और सिग्नल शोर (चित्रा S2B) की कमी की ओर जाता है। यदि ऐसा होता है, तो लेजर शक्ति को एक मजबूत जाल के लिए बढ़ाया जा सकता है, नाभिक में मनका को धक्का देने वाले ट्रेपोज़ॉइडल प्रक्षेपवक्र के आयाम को कम किया जा सकता है, या फंसे हुए माइक्रोबीड की प्रारंभिक स्थिति को नाभिक से आगे सेट किया जा सकता है।
उत्तेजना के दौरान कोशिका चल रही है
यदि कोशिकाएं पर्याप्त रूप से जुड़ी नहीं हैं, तो ऑप्टिकल ग्रेडिएंट ट्रैप इंट्रासेल्युलर इंडेंटेशन रूटीन का प्रदर्शन करते समय कोशिकाओं को स्थानांतरित कर देगा, जैसे कि नाभिक के बल और अंतर्निहित यांत्रिकी कलाकृतियों हैं। पूरे सेल के विस्थापन को रोकने के लिए, हम सतह पर सेल आसंजन अणुओं की एकाग्रता बढ़ाने की सलाह देते हैं, उदाहरण के लिए, कोना।
प्रारंभिक गति मुआवजा
यदि OTs प्लेटफ़ॉर्म (चरण 6.5) में एक प्रारंभिक संवेग मुआवजा रूटीन उपलब्ध नहीं है, तो एक कृत्रिम, बल-स्वतंत्र बेसलाइन सिग्नल को सही करने की आवश्यकता होती है। यह बल वक्र पर एक ढलान के रूप में दिखाई देता है, यहां तक कि कोई मनका फंस (चित्रा S1E) के साथ भी। सुधार करने के लिए, एक ही प्रक्षेपवक्र को एक मनका के बिना प्रदर्शन करने की आवश्यकता होती है, सेल के बाहर बिल्कुल उसी स्थिति में। इसके लिए, चरण नियंत्रण का उपयोग करके सेल को जाल से दूर ले जाएं। एक संदर्भ के रूप में, बल ऑफसेट हमारे सिस्टम में 200 mW पर FOV भर में 5 pN बदलता है; इस प्रकार, यह छोटे प्रक्षेपवक्रों के लिए नगण्य हो जाता है। वैकल्पिक रूप से, नमूने पर कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए एक पीजो स्कैन चरण का उपयोग किया जा सकता है, जिससे लेजर स्थिति स्थिर हो जाती है।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरण
भ्रूण पर अधिकतम वितरण सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्फियर को दाईं ओर, 1-सेल चरण में इंजेक्ट किया जाना चाहिए। मोतियों को फ्लोरोसेंट नहीं होना चाहिए ताकि इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोसेंट चैनलों में कोई प्रकाश लीक न हो। उदाहरण के लिए, यहां तक कि विशिष्ट लाल-फ्लोरोसेंट मोती भी नीले चैनल में स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं जो उनकी चमक के कारण होचस्ट स्टेनिंग के बाद सेल नाभिक को इमेजिंग के लिए उपयोग किया जाता है (उत्तेजना: 405 एनएम; उत्सर्जन: 445 एनएम)। सब्सट्रेट के लिए सेल का स्थिर लगाव इंडेंटेशन रूटीन के दौरान पार्श्व विस्थापन को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। यदि सेल दिनचर्या के दौरान चलता है, तो बलों को कम करके आंका जाता है। क्या यह अक्सर होता है, अनुलग्नक प्रोटोकॉल को ऑप्टिमाइज़ करें। ऊतक संस्कृति कोशिकाओं के लिए, अन्य सेल आसंजन प्रोटीन, जैसे कि फाइब्रोनेक्टिन, कोलेजन, या पॉली-एल-लाइसिन संतोषजनक लगाव (अप्रकाशित अवलोकन) का कारण बनते हैं। कारावास के दौरान, कोशिकाओं को अचानक और गंभीर यांत्रिक तनाव के अधीन किया जाता है। यह कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है और अक्सर प्रयोगकर्ता को फटी हुई कोशिकाओं का सामना करना पड़ेगा यदि प्रक्रिया सावधानीसे नहीं की जाती है। इसके अलावा, यदि कारावास की ऊंचाई बहुत छोटी है, तो सभी कोशिकाएं परमाणु आवरण टूटने या अपरिवर्तनीय क्षति से पीड़ित होंगी। इन्हें कम करने के लिए, ऊपरी कवरस्लिप को अधिक धीरे-धीरे कम करें और / या कवरस्लिप के बीच की दूरी को बढ़ाएं।
तकनीक की सीमाएं और उन्हें दूर करने के लिए सुझाव
तकनीक की एक स्पष्ट सीमा ऊतक के गहरे वर्गों में लेजर प्रकाश का प्रवेश है, जो विपथन और अस्थिर फँसाने की ओर जाता है। इस प्रकार, प्रवेश गहराई की एक निचली सीमा नमूने की स्पष्टता पर निर्भर करती है, विपथन सुधार जिसे नियोजित किया जा सकता है73 और लागू लेजर शक्ति। यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि एक उच्च लेजर शक्ति माइक्रोस्फीयर के आसपास के क्षेत्र में नमूने के थर्मल उत्तेजना की ओर ले जाती है। हालांकि, 1064 एनएम तरंग दैर्ध्य लेजर स्पॉट द्वारा उत्पन्न नमूने के हीटिंग को हमारे जैविक नमूनों पर प्रशंसनीय गर्मी से संबंधित तनाव से बचने के लिए कम से कम किया जाता है74।
एक अन्य सीमा अधिकतम बल है जिसे मापा जा सकता है। भले ही प्रत्यक्ष प्रकाश-संवेग का पता लगाने से ऑप्टिकल ट्रैप 40,41 के रैखिक प्रतिक्रिया शासन से परे बल माप को सक्षम बनाता है, अधिकतम लागू बल कुछ सौ पिकोनिउटन्स के क्रम में है। यह लेजर शक्ति और नरम जैविक सामग्री की परिणामी क्षति सीमा और अपवर्तक सूचकांक अंतर द्वारा सीमित है, जो आमतौर पर 0.1 या 0.344 से बड़ा नहीं होता है। बल का पता लगाने की सीमा को बढ़ाने के लिए कई तरीकों का प्रस्ताव किया गया है, उदाहरण के लिए, संरचित प्रकाश 75, एंटी-रिफ्लेक्टिव लेपित माइक्रोस्फियर76, उच्च-अपवर्तक सूचकांक कण77 या अत्यधिक डोप्ड क्वांटम डॉट्स 78 का उपयोग करके।
BFP इंटरफेरोमेट्री के माध्यम से नैनोमीटर-स्केल स्थिति माप के लिए OTs का उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि जाल के भीतर मनका की स्थिति Πx = β Sx है, जहां Sx सेंसर का वोल्टेज सिग्नल है, और β [μm / V] को विभिन्न प्रोटोकॉल 35,54 के बाद ऑन-द-फ्लाई कैलिब्रेट किया जा सकता है। ऑप्टिकल फोर्स सेंसर के लिए, यह साबित किया जा सकता है कि वोल्टेज-टू-फोर्स अपरिवर्तनीय रूपांतरण कारक α [पीएन / वी] सीधे β और जाल कठोरता से संबंधित है, k [pN / μm], α = k π 37) मनका विस्थापन के साथ प्रयोगों में जो ऑप्टिकल इमेजिंग से पता लगाने के लिए बहुत छोटे हैं, इस रणनीति का उपयोग छोटी स्थिति का पता लगाने के साथ बल माप को पूरक करने के लिए किया जा सकता है। एक उदाहरण यहां प्रस्तुत प्रयोगात्मक दिनचर्या का आवेदन है जो यहां बहुत कठोर नाभिक पर प्रस्तुत किया गया है, जिसके लिए उचित लेजर शक्तियों (200-500 mW) पर बल पर्याप्त रूप से इंडेंटेशन मूल्यों को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त नहीं हैं। उस मामले में, मनका को नाभिक के संपर्क में लाने की आवश्यकता होती है और माप (चरण 8.6) से पहले फँसाने की कठोरता को कैलिब्रेट किया जाना चाहिए। बल के एक कार्य के रूप में नाभिक के इंडेंटेशन डी को अप्रत्यक्ष रूप से इस रूप में निर्धारित किया जा सकता है:
d = xtrap – F/k
जहां xtrap जाल की स्थिति है। [पीएन / वी] α अपरिवर्तनीय प्रकाश-संवेग कारक से अलग, कारक β [μm / V] को प्रत्येक प्रयोग से पहले कैलिब्रेट करने की आवश्यकता होती है क्योंकि यह कई स्थानीय चरों पर निर्भर करता है जो फँसाने की गतिशीलता का निर्धारण करते हैं, जैसे कि कण आकार, ऑप्टिकल ट्रैप स्पॉट आकार, और सापेक्ष अपवर्तक सूचकांक।
The authors have nothing to disclose.
एमके योजना Nacional (PGC2018-097882-A-I00), FEDER (EQC2018-005048-P), Severo Ochoa कार्यक्रम के माध्यम से अर्थव्यवस्था और प्रतिस्पर्धा के स्पेनिश मंत्रालय से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है अनुसंधान और विकास में उत्कृष्टता के केंद्रों के लिए (CEX2019-000910-S; RYC-2016-21062), Fundació Privada Cellex, Fundació Mir-Puig से, और CERCA और अनुसंधान कार्यक्रम (2017 SGR 1012) के माध्यम से Generalitat de Catalunya से, ERC (MechanoSystems) और HFSP (CDA00023/2018) के माध्यम से वित्त पोषण के अलावा। वी.आर. EMBL साझेदारी के लिए स्पेनिश विज्ञान और नवाचार मंत्रालय से समर्थन को स्वीकार करता है, Centro de Excelencia Severo Ochoa, MINECO की योजना Nacional (BFU2017-86296-P, PID2020-117011GB-I00) और Generalitat de Catalunya (CERCA)। वी.वी. यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित ICFOstepstone पीएचडी कार्यक्रम से मैरी Skóodowska-Curie अनुदान समझौते 665884 के तहत समर्थन स्वीकार करता है। हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Arnau Farré को धन्यवाद देते हैं; 24 एचपीएफ भ्रूण की इमेजिंग और बढ़ते के साथ मदद के लिए मारिया मार्सल और; Zebrafish micronjections के साथ समर्थन के लिए Senda Jiménez-Delgado।
#1.5 22 mm cover glasses | Ted Pella | 260148 | |
#1.5 22×60 mm Coverglasses | Ted Pella | 260152 | |
#1.5H glass bottom dishes | Willco | GWST-5040 | |
10-um beads | Supelco | 72986 | |
1-mm glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0020 GC100F-15 | |
1-um polystyrene microbeads | Sigma | 89904 | |
1-um red-fluorescent beads | ThermoFisher | F8816 | |
Agar | ThermoFisher | 16500500 | |
Aqcuisition cameras sCMOS | Andor | Sona-4BV11-UNI | |
Auxiliary camera (Figure 3, AUX) | Blackfly, FLIR | BFS-U3-200S6M-C | |
Calbryte 520 | AAT Bioquest | 520 AM | |
Centrifuge | Eppendorf | 5453000011 | |
Concanavalin A | Sigma | C5275 | |
DMEM | Sigma | D2906 | |
DNA-Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
Double scotch tape | Biesse Adesivi | ||
E3 | 5 mM NaCl. 0.17 mM KCl. 0.33 mM CaCl2. 0.33 mM MgSO4 | ||
Eclipse Ti2 | Nikon | ||
Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
GPI-GFP | |||
H2A-mCh | |||
Image acquisition software | Fusion-Andor | ||
Immersion Oil | Cargille | Type B: 16484 | |
IR protection googles | Thorlabs | LG1 | |
Lap2b-eGFP | |||
Micro loader pipette | Eppendorf | GELoader | |
Microinjector | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
MicroManager 2.0 | |||
Micromiter slide | ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 divisions | ||
Mineral oil | Sigma | M3616 | |
Motorized stage | ASI | ||
Needle puller | Sutter instrument Co. | Model P-97 | |
Optical tweezers platform | Impetux Optics | Sensocell | |
OTs software (LightAce) | Impetux Optics | ||
PDMS | Sigma | Sylgard 184 | |
PDMS Curing agent | Sigma | Sylgard 184 | |
Post processing software (Matlab) | Mathworks | ||
RNAse free water | Thermofisher | AM9937 | |
Short-pass dichroic mirror (Figure 3, IR-F) | Semrock | FF01-950/SP-25 | |
Spin-coater | Specialty Coating Systems | Spincoat G3P-8 | |
Spinning-disk confocal microscope | Andor | DragonFly 502 | |
Stereomicroscope | Leica M80 | ||
Triangular microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU1 | |
Universal oven | Memmert | UNB 200 | |
Water immersion objective | Nikon | MRD07602 |