Direkta kraftmätningar av subcellulär mekanik i inneslutning med optiska pincett

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att undersöka de intracellulära mekaniska egenskaperna hos isolerade embryonala zebrafiskceller i tredimensionell inneslutning med direkt kraftmätning av en optisk fälla.

Abstract

Under utvecklingen av en multicellulär organism delar en enda befruktad cell och ger upphov till flera vävnader med olika funktioner. Vävnadsmorfogenes går i hand med molekylära och strukturella förändringar på encellsnivå som resulterar i variationer av subcellulära mekaniska egenskaper. Som en följd av detta, även inom samma cell, motstår olika organeller och fack annorlunda än mekaniska påfrestningar; och mekanotransduktionsvägar kan aktivt reglera sina mekaniska egenskaper. En cells förmåga att anpassa sig till mikromiljön av vävnadsnisch beror således delvis på förmågan att känna och reagera på mekaniska påfrestningar. Vi föreslog nyligen ett nytt mekanosensationsparadigm där nukleär deformation och positionering gör det möjligt för en cell att mäta den fysiska 3D-miljön och ger cellen en känsla av proprioception för att avkoda förändringar i cellform. I den här artikeln beskriver vi en ny metod för att mäta de krafter och materialegenskaper som formar cellkärnan inuti levande celler, exemplifierade på vidhäftande celler och mekaniskt begränsade celler. Mätningarna kan utföras icke-invasivt med optiska fällor inuti celler, och krafterna är direkt tillgängliga genom kalibreringsfri detektering av ljusmomentum. Detta gör det möjligt att mäta kärnans mekanik oberoende av cellytans deformationer och möjliggöra dissekering av exteroceptiva och interoceptiva mekanotransduktionsvägar. Viktigt är att fångstexperimentet kan kombineras med optisk mikroskopi för att undersöka cellulär respons och subcellulär dynamik med hjälp av fluorescensavbildning av cytoskeletonen, kalciumjoner eller nukleär morfologi. Den presenterade metoden är enkel att tillämpa, kompatibel med kommersiella lösningar för kraftmätningar, och kan enkelt utökas för att undersöka mekaniken hos andra subcellulära fack, t.ex. mitokondrier, stressfibrer och endosomer.

Introduction

Vävnadsmorfogenes är en komplex process där biokemiska signaler och fysiska krafter samordnas spatiotemporally. I det framväxande embryot dikterar gradienter av biokemiska signalfaktorer ödesspecifikationen och säkerställer korrekt ^{vävnadsmönster1,2}. Samtidigt spelar inneboende och extrinsiska krafter en roll i uppbyggnaden av ^{embryots arkitektur3,4}. Cellbarkens påverkan i detta sammanhang har studerats ^{utförligt5,6}. Den täta sammankopplingen mellan mekanokemiska processer under morfogenes förlitar sig på egenskaperna hos enskilda celler för att känna av och reagera på mekaniska krafter i deras vävnadsmikromiljön. Celler avkodar därmed mekaniska signaler via närvaron av kraftkänsliga subcellulära och molekylära element som omvandlar mekanisk information till specifika signalvägar som styr cellbeteende, cellöde och cellmekanik.

Ett kännetecken för utvecklingsprocesser är att celler organiserar sig som grupper för att bygga multicellulära strukturer. Som sådan omorganiserar och rör sig enstaka celler sällan ensamma men är associerade i en snäv sociotop där de visar kollektivt beteende som supracellulär ^migration7, (un)jamming ^{övergångar8,9} eller blastocyst komprimering10. Mekaniska krafter som genereras inom och mellan celler fungerar som viktiga ledtrådar för att instruera kollektiv ^{celldynamik7,11}. Men även när celler rör sig ensamma, såsom stamceller som klämmer sig mellan vävnadsark eller smala vävnadsnischer, upplever de omfattande anisotropa mekaniska krafter när de navigerar i en tredimensionell miljö. Dessa mekaniska påfrestningar på celler har djupgående konsekvenser för cellulärt ^{beteende12,13}. Flera mekanismer har undersökts som konvergerar på kärnan som ett stort mekanotransduktionselement14,15, som passivt eller aktivt mekaniskt element under migrering inom en tät 3D-vävnadsmiljö15,16.

Vi föreslog nyligen en mekanism som utrustar celler för att mäta formdeformationer med kärnan som en elastisk intracellulär mekano-gauge12. Kärnan, som är den största organellen i en cell, genomgår stora deformationer när celler polariserar, migrerar eller ändrar sin form under mekanisk sträckning, inneslutning eller osmotisk stress16,17,18,19. Vi fann att nukleära kuvert sträcker sig tillsammans med den intracellulära positionering av kärnan ger cellerna information om omfattningen och typen av cell deformation (såsom cell komprimering kontra cell svullnad). Sträckning av kärnan är associerad med en utfällning av det inre kärnmembranet (INM), som främjar kalciumberoende cPLA2 (cytosolic phospholipase A2) lipas aktivitet vid INM följt av frisättning av Arakidonsyra (AA) och snabb aktivering av myosin II vid cellbarken. Detta leder till ökad cellkontraktilitet och amöboid cellmigrering över en tröskel för när ^{contractility6}. Det mekanosensitiva svaret på cell deformation uppstår på mindre än en minut och är reversibel vid inneslutning release, vilket tyder på att kärnan fungerar som en stammätare för cellulära proprioception som reglerar adaptiva cell beteende under mekaniska stressförhållanden. Denna mekanosensitiva väg har visat sig vara aktiv i stamceller från zebrafiskembryon, både i pluripotenta och härstamningsbegångna ^celler12 och bevaras i olika arter och ^cellinjer20.

Förutom de nukleära egenskaperna som cell-mekanosensor regleras kärnarkitektur och mekanik i sig under utvecklingen och som svar på cell fate ^{specification21}, vilket gör cellulär mekanokänslighet22,23. Konsekvensen kan bli en förändring av kärnefterlevnaden som möjliggör morfologiska förändringar och övergångar från en premiär till en migrationsstat och vice ^versa8.

Flera tekniker för att mäta cellkärnmekanik har tillämpats, såsom atomkraftmikroskopi24,25, mikropipette aspiration26,27, mikrofluidisk ^teknik28 och mikroneedles29. Många av dessa tekniker är dock invasiva i den meningen att hela cellen måste deformeras, vilket begränsar mätningen av mekaniska egenskaper och kraftberoende svar från själva kärnan. För att kringgå samtidig deformation av cellytan och dess mekanosensitiva cell ^cortex30 studerades isolerade kärnor i olika ^{sammanhang31,32}. Det kan dock inte uteslutas att kärnisolering är förknippat med en förändring av mekaniska kärnegenskaper och deras reglering (^referens24 och egna opublicerade observationer).

Optisk pincett (OTs) är en mångsidig teknik som har tillåtit en mängd experiment inom cellmekanobiologi och har varit avgörande för vår förståelse av hur molekylära maskiner omvandlar kemiska till mekanisk ^energi33,34. Optiska pincett använder en tätt fokuserad laserstråle för att utöva optiska krafter på dielektriska partiklar som har ett brytningsindex högre än det omgivande ^mediet33. Sådana krafter kan vara i storleksordningen hundratals pico-Newtons och resultera i effektiv inneslutning av partikeln inom laserfällans fokus, vilket möjliggör manipulering av den fångade partikeln i tre dimensioner. Användningen av ljus har en viktig fördel genom att mätningen kan utföras icke-invasivt inuti levande celler. Optiska manipuleringar är ytterligare begränsade till laserstrålens fallfokus. Därför kan manipuleringen utföras utan att stimulera de omgivande cellmembranen och stör inte aktinbarken eller mekanosensitiva processer vid plasmamembranet, såsom tvångsberoende aktivering av jonkanaler.

Svårigheten med den optiska pincettmetoden är att exakt bestämma de krafter som appliceras på mikrosfären med hjälp av klassiska metoder som förlitar sig på indirekt kraftkalibrering baserad på equipartition-satsen eller användningen av definierade Stokes-dragkrafter för att mäta en lasereffektberoende ^flyktkraft35. Medan dessa metoder är enkla att genomföra i ett in vitro-experiment, kan de vanligtvis inte översättas till en cellulär miljö. Flera strategier har införts i fältet som bygger på en direkt kraftkalibrering, som härrör från de första principerna för ^{momentumbevarande36,37}. Till skillnad från andra kraftspektroskopimetoder härleds kraftmätningar från ett lokalt utbyte av ljusmomentum med den godtyckligt formade fångade ^{partikeln38,39}. I vår experimentella uppsättning mäts förändringar i ljusmomentum som uppstår från optiska krafter direkt utan behov av in situ trap kalibrering40,41,42,43. Således blir mätningarna möjliga i en trögflytt miljö som cellens inre eller till och med inom en vävnad, och krafter kan lätt kvantifieras ner till pN-nivån.

I detta protokoll beskriver vi en analys för att mekaniskt manipulera intracellulära organeller eller strukturer och kvantitativt bedöma deras mekaniska egenskaper genom en optisk pincettuppsättning. Denna uppsättning är integrerad i ett snurrande disk fluorescerande mikroskop som möjliggör parallell avbildning av cellulärt beteende eller intracellulär dynamik. Analysen möjliggör karakterisering av de mekaniska egenskaperna hos specifika cellulära fack, såsom kärnan, samtidigt som man studerar möjliga mekanorespons och aktivering av molekylära signalvägar som ett resultat av själva deformationen. Dessutom möjliggör optisk fångst av injicerade mikrober i celler en ökning av indragskraften tack vare ett betydligt högre brytningsindex för polystyrenpärlor (n = 1,59) jämfört med kärnans inneboende brytningskontrast44 (n ~ 1,35) jämfört med cytoplasma (n ~ 1,38). Den presenterade strategin kan enkelt anpassas till studier av andra intracellulära strukturer och organeller, liksom andra metoder som involverar aktiv mikrorheologi, användning av flera optiska fällor för att undersöka samma/ olika subcellulära strukturer samtidigt och mätningar riktade mot cellmekanobiologi i det levande embryot.

Protocol

Alla protokoll som används har godkänts av Institutional Animal Care and Use Ethic Committee (PRBB-IACUEC) och genomförts i enlighet med nationella och europeiska bestämmelser. Alla experiment utfördes i enlighet med principerna i 3R. Zebrafish (Danio rerio) bibehölls som tidigare beskrivits.

1. Beredning av isolerade primära embryonala zebrafisk stamceller

1. Mikropipett och agarosberedning
   OBS: För ett komplett zebrafiske embryo microinjection protokoll, se ^referens45.
   1. Med en mikropipettedragare, dra en 1,0 mm glaskapillär för att få två ^nålar45. Förvara de oanvända nålarna i en 150 mm Petriskål fäst vid en lekkudde eller i en labbbandsring inifrån och ut för att skydda den tunna spetsen från skador under transporten.
   2. Smält 1% ultrapure agarose i E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM _CaCl2, 0,33 mM _MgSO4) i en standard mikrovågsugn i kök / labb för 10 s. Värm blandningen upprepade gånger under korta tidsperioder (några sekunder) tills agarosen smälter.
   3. När agarosen är helt smält, låt den svalna kort och häll den sedan i en 10 cm Petriskål. Tillsätt långsamt den triangulära mikroinjektionsformen (se Materialtabell) på toppen av agaroset och undvik utseende av bubblor. Tryck inte formen, se till att den stannar på agarosytan.
   4. När agarosen stelnar helt, ta bort den triangulära formen mycket långsamt genom att utöva en mild kraft för att undvika eventuella brott i agarosen. Plattan kan förvaras upp och ner vid 4 °C i 2-4 veckor.
   5. 30 min före mikroinjektionen, ta ut plattan ur kylskåpet och tillsätt E3 förvarnad till 28 °C för att låta den stabiliseras vid rumstemperatur.
2. Beredning av injektionsblandning
   1. För att förbereda injektionsblandningen, späd 1 μm mikrober (polystyren, icke-fluorescerande) i 1:5-förhållande i RNase fritt vatten.
   2. Förbereda mRNA för övergående uttryck av fluorescerande markörer eller uttryck av rekombinanta genkonstruktioner och/eller saminjektion av morpholino vid önskad koncentration.
      OBS: En typisk injektionsblandning för saminjektion av mikrober tillsammans med 100 pg mRNA per embryo för att märka, till exempel är kärnan med H2A-mCherry: 1 μL pärlor + 1 μL mRNA (lagerkoncentrationen är 1 μg / μL) + 2,5 μL RNA fritt vatten + 0,5 μL fenolrött (stocklösning 0, 0, 000 fenolrött (stocklösning 0, 0, 0, 5 μL fenolrött (stocklösning 0, 0, 0, 5 μL fenolrött (stocklösning 0, 0, 5 μL fenolrött (stocklösning 0, 0, 0, 000 fenolrött (stocklösning 0, 0, 5 μL fenolrött (stocklösning 0, 0, 0, 5 μL fenolrött (stocklösning 0, 0, 5 μL fenolrött (stocklösning 0, 0, 5 μL fenolrött (stocklösning 0, 0, 0, 5 μL fenolrött (stocklösning 0, 0, 5 μL fenolrött (stocklösning 0, 0, 5 μL fenolrött (stocklösning 0, 0, 5 μL fenolrött (stocklösning 0, 0, 0, 000 fenolrött (stocklösning 0, 0, 0, 000 fenolrött (stocklösning 0, 0, 000 fenolrött (stocklösning 0, 0, 000 fenolrött (stocklösning 0, 0, 000 fenolrött (stocklösning 0, fall är också synligt för en erfaren experimenterare). RNA-injektion kan också vara användbart för att välja injicerade embryon. Fluorescerande mikrober kan injiceras, istället för icke-fluorescerande, för att visualisera dem.
3. Mikroinjektion nålbelastning och kalibrering
   1. Slå på mikroinjektorn med alternativet Time-Gated . Denna inställning är mycket viktig för att kalibrera injektionsvolymen ordentligt. Ställ in gatingtiden på cirka 500 ms.
   2. Ladda 3 μL av injektionsblandningen i nålen med hjälp av en mikrolastarpipeett.
   3. För in nålen i mikromanipulatorn och täta ordentligt. Kontrollera om mikromanipulatorn är i ett bra läge och har tillräckligt med frihet för att röra sig i x-y-riktning på injektionsplattan.
   4. Mät droppstorleken med hjälp av en mikrometerrutschbana (5 mm/100 divisioner) med en droppe mineralolja ^ovanpå45 och skjut ut en droppe injektionsblandningen direkt i mineraloljan.
   5. Beskär nålen med vassa tångar i brant vinkel för att generera en skarp spets. Justera droppstorleken till 0,1 mm, motsvarande 0,5 nL injicerat material.
      OBS: Om denna volym överskrids genom att skära nålen, rekommenderas att kalibreringsförfarandet görs om med en ny nål. Mikroinjektorns gatingtid kan justeras något för att matcha droppvolymen. Korta gatingtider motsvarar dock en stor nåldiameter, vilket potentiellt skadar embryona.
4. Mikroinjektion av zebrafiskembryon i encellsstadium
   1. Samla zebrafiskembryon kort efter befruktning för mikroinjektion av pärlblandningen direkt i embryot med en cell (zygot) innan den första celldelningen inträffar.
      OBS: Detta säkerställer korrekt fördelning av mikrosfärer och ett tillräckligt högt utbyte av isolerade blastomerer med minst en mikrosfär per cell i senare utvecklingsstadier där experiment utförs (blastula-gastrula-stadium). Indenteringsexperiment kan fortfarande utföras om det finns två sfärer i cellen, men celler som inte har några pärlor bör uteslutas (även om indrag utan sfärer är möjligt). AB wildtype stammar användes i detta protokoll, men alla andra stammar, t.ex. TL kan användas.
   2. Placera embryon i encellssteg (zygot) i en förvarnad triangulär formad 1% agarosform, som visas i figur 1A, med hjälp av en pasteurpipeett av plast.
   3. Ta bort extra medium med samma pipett för att undvika att embryona flyter runt. Tryck försiktigt embryona i den triangulära formen via en borste. Håll lite utrymme mellan embryona för att underlätta rätt orientering (figur 1B).
   4. Justera försiktigt embryona med en borste så att embryona är orienterade i sidled, med en cell av zygoten tydligt synlig, som visas i figur 1B. En idealisk orientering för mikroinjektion uppnås när embryots enda cell är vänd mot nålriktningen (injektion via embryots djurpol) eller på motsatt sätt mot äggulacellen (injektion via embryots vegetala pol), som visas i figur 1C.
   5. Håll skålen med ena handen och använd den andra handen för att placera nålspetsen med hjälp av mikromanipulatorstyrenheten. Sänk nålspetsen mot embryona.
   6. Genomborra chorion och gå in i encellsembryon med nålen medan du övervakar proceduren genom stereomikroscopet. Se till att nålen placeras korrekt och, efter injektion, rätt placering av den injicerade droppen enligt figur 1C.
   7. Upprepa för alla embryon: flytta nålen upp, skjut skålen med embryona tills nästa embryo är centrerat, sänk nålen och injicera den.
   8. När hela uppsättningen embryon injiceras, ta bort embryona från agarosformen / Petri-skålen genom att spola lite E3 och lägg dem i en ny Petri-maträtt med en pasteurpipeett av plast. Det rekommenderas att tillräckligt med media placeras på injektionsplattan för att undvika uttorkning av embryon under mikroinjektionsförfarandet.
   9. Upprepa proceduren tills önskat antal embryon injiceras. Embryona måste vara i ett cellstadium för att säkerställa maximal och homogen spridning av pärlorna.
      OBS: Denna procedur är optimerad för tidiga blastula embryon och sannolikt behöver optimeras om olika utvecklingsstadier ska undersökas.
   10. Placera de injicerade embryona i en inkubator vid 28–31 °C i cirka 4 timmar eller till önskat stadium (figur 1D) innan du fortsätter med protokollet för primärcellskultur.
       OBS: Låt embryona utvecklas bortom blastulastadiet (eller önskad mättidpunkt) för att säkerställa överlevnad och utesluta toxicitetsartefakter. Vid larvstadier, montera sövda larver med trikain i 0,75% agaros och avbilda fördelningen av mikrosfärer i olika vävnader. För att göra en stamlösning, blanda: 400 mg trikainpulver i 97,9 ml destillerat vatten, cirka 2,1 ml 1 M TRIS-bas (pH 9) och justera till pH 7. Denna lösning kan förvaras vid 4 °C. För att använda trikain som bedövningsmedel, späd 4,2 ml lagerlösning i 100 ml äggmedium (eller önskat medium); I detta fall användes E3. Mer information finns i ^reference46 .

2. Encellig beredning och färgning

1. Placera sfärstegembryon (4 hpf, timmar efter befruktning) i en glasfat med hjälp av en pasteurpipeett av plast. Välj embryon som är positiva för signalen från de injicerade pärlorna och som uttrycker det fluorescerande proteinet vid mRNA-injektion. Vissa embryon kan uppvisa högpärla kluster och kan uteslutas.
   1. Dechorionate embryona manuellt med tång. Överför cirka 10-15 embryon till 1,5 ml reaktionsbehållare med en pasteurpipeett av glas.
      OBS: När embryona dechorioneras fäster de på plasten, och användning av glas krävs. Som ett alternativ till glasplattan kan en petriskål i plast med ett tunt lager av 1% agaros användas. Manuell dechorionation bör föredras framför enzymatisk Pronase-behandling för att förhindra proteolytiska skador på cellytans proteiner och potentiella förändringar i mekaniska cell- och vävnadsegenskaper, vilket förhindrar förlängda ^{återhämtningstider47}.
2. Ta bort E3-mediet och tillsätt 500 μL förvärmt _{CO2-oberoende} vävnadsodlingsmedium (DMEM-F12; med L-glutamin och 15 mM HEPES, utan natriumbikarbonat och fenolrött kompletterat med 10 enheter penicillin och 10 mg/l streptomycin).
   OBS: Använd inte _CO2-beroende medium om inte en mikroskopinkubator används. Användning av t.ex. RPMI vid karbonatbuffrade förhållanden orsakar förändringar i mediets pH-värde och kan påverka cellens överlevnad. En annan viktig aspekt är att undvika kulturmedier som innehåller serum. Serum kan innehålla Lysophosphatidic acid (LPA), en potent aktivator av Rho/ROCK-vägen, som kan kontrollera cellulär kontraktilitet och motilitet i ^stamceller6. Osmolariteten hos mediet bör bibehållas vid 300 mOsm för att undvika osmotiska utmaningar som kan störa kärnmorfologi eller ^mekanik12.
3. Separera celler manuellt genom att försiktigt skaka röret. Se till att innehållet i röret blir grumligt utan några stora bitar synliga för ögat. Undvik bildandet av bubblor för att minimera skador och förlust av celler.
4. Centrifugera vid 200 x g i 3 min. Pelleten måste vara väl synlig.
5. Ta bort supernatanten och följ ett av stegen nedan.
   1. Om ingen färgning behövs, tillsätt 500 μL DMEM. Använd försiktigt en 200 μL pipett genom att rikta en flytande jet på pelleten. Använd inte överdriven skjuvkraft på cellerna. Skumning indikerar skador på cellerna.
   2. För märkning av kärnan med DNA-färgämnen som Hoechst, blanda 0,5 μL DNA-Hoechst (lager 2 mg/ml) i 1 000 μL DMEM för att erhålla 1 μg/ml slutlig koncentration. Tillsätt 500 μL av denna färgningslösning till cellerna och återanvänd försiktigt. Inkubera i 7 min i mörkret.
   3. För att färga cellerna med en fluorescerande kemisk kalciumindikator Calbryte-520, tillsätt Calbryte-520 till en 5 μM-koncentration i DMEM. Inkubera i 20 minuter i mörkret.
      OBS: De protokoll som anges i steg 2.5.2 och 2.5.3 har optimerats för dessa specifika produkter. Andra färgningar kan utföras med hjälp av de protokoll som anges av tillverkaren.
6. Centrifugera igen med samma inställningar som i steg 2.4; avlägsna supernatanten och försiktigt återanvända cellerna (för att undvika bildandet av kluster) i 50 μL DMEM för prover i suspension eller 20 μL DMEM för celler i inneslutning.

3. Beredning av optiska svällningskammare med polydimethylsiloxan (PDMS) avstånd

OBS: Optiska kraftmätningar baserade på ljusmomentisdetektering kräver att allt ljus som kommer från de optiska fällorna ^fångas40. För robustheten hos den invarianta kalibreringsfaktorn α (pN/V) måste ljusfördelningen vid den optiska kraftsensorns bakre fokalplan (BFP) vara korrekt korrespondens med fotonens momentum. Detta bestämmer avståndet från uppsamlingslinsens yta till fångstplanet till ca 2 mm, vilket är den maximala höjden på de optiska fångstkamrarna.

1. PDMS spinnbeläggning av #1,5 glasbottenfat.
   OBS: Följande recept tillhandahålls för cirka 40 rätter. Den resulterande mikrochambern kommer att ha olika höjder beroende på om experiment ska utföras på suspenderade eller slutna celler (figur 1D).
   1. Blanda 9 ml av baspolymeren PDMS och 1 ml PDMS härdningsämne i ett koniskt rör på 50 ml. Blanda de två produkterna aktivt för att säkerställa korrekt distribution av härdningsmedlet.
   2. Avgasa blandningen för att undvika bubblor med en vakuumpump. Introducera koniska röret i en vakuumflaska och evakuera kammaren. Vänta tills inga bubblor finns i blandningen.
      OBS: Öppna vakuumet långsamt för att förhindra skumbildning och spill av PDMS ut ur falkröret.
   3. Placera glasbottenskålen på spin-coater chuck (bild 2A). Var försiktig så att du inte skrapar, tar fingeravtryck eller smutsar ner skålen. Skydda spin-coater boxen från PDMS läckor med aluminiumfolie.
   4. För OT-kammare för experiment på celler i suspension, tillsätt cirka 250 μL PDMS-blandning i mitten av bottenskålen och snurra den vid 750 varv/min i 1 min. Höjden på PDMS-skiktet kommer att vara 50 μm ^ungefär48.
   5. För OT-kammare för experiment på begränsade celler, tillsätt en liten droppe PDMS (cirka 50 μL) och snurra det vid 4 000 varv/min i 5 minuter. Höjden på PDMS-skiktet kommer att vara 10 μm ungefär. Ett detaljerat protokoll om hur du skaffar olika PDMS-tjocklekar finns i ^referens48.
   6. Härda de PDMS-belagda glasbottenfaten vid 70 °C i 1 timme.
   7. Skär en 1 x 1 cm kvadrat på PDMS-skiktet med en skalpell och skala av den med pincett (figur 2C). Vid begränsade celler, tvätta PDMS-skräp med isopropanol.
2. Kammarbeläggning för experiment med lätt fästa celler i suspension
   1. Tillsätt 100 μL Concanavalin A (ConA) vid 0,5 mg/ml för att täcka hela ytan av den fyrkantiga håligheten och låt den inkubera i 30 min.
      OBS: ConA är ett lektin som binder till cellytans sockerarter och kopplar ihop enskilda celler på täckglasytan.
   2. Ta bort ConA-droppen och skölj ytan försiktigt med DMEM-medium utan att repa den ConA-behandlade ytan.
   3. Tillsätt 30 μL av det tidigare förberedda provet (steg 2.6) i brunnen och återanvänd försiktigt för att bli av med eventuella cellkluster.
   4. Stäng hålrummet genom att försiktigt placera ett 22 x 22 mm #1,5 täckglas ovanpå PDMS-fälgarna (undvik att låta det falla abrupt, använd tång om möjligt, figur 2B,C).
      OBS: Eventuell täcktjocklek skulle fungera för det övre glashöljet (uppsamlingslinsen har ett arbetsavstånd på 2 mm).
3. Kammarberedning för experiment med celler i inneslutning
   1. Lägg en 10 μL droppe lösning som innehåller celler (steg 2.6) i den fyrkantiga håligheten (figur 2B).
   2. Smöra provet mycket försiktigt med ett 22 x 22 mm täckglas så att droppen sprider sig i hela området och inga bubblor observeras. Återigen är det bekvämt att använda tång, som visas i figur 2C, för att förhindra att täckglaset faller plötsligt.

4. Alternativa alternativ för OT-kammaravstånd

OBS: Dessa steg kan följas om det inte finns någon mikrotillverkningsverkstad eller spinnlack.

1. Kammarberedning för experiment med celler i suspension
   OBS: Om det inte finns någon spinnlack kan en distans tillverkas med normal, dubbelsidig scotch tejp (cirka 100 μm i höjd).
   1. Skär en bit dubbelsidig scotch tejp med ett cirka 10 cm x 10 cm fyrkantigt hål i mitten (samma dimensioner som i PDMS, figur 2B).
   2. Ta bort ett av tejpens skyddande lager genom att skala av det och placera den oskyddade sidan av tejpen i mitten av en #1,5 H glasbottenskål. Tryck försiktigt för att få all yta fastsatt på glaset samtidigt som du undviker luftbubblor och ta sedan bort tejpens återstående skyddande skikt genom att skala av det.
   3. Följ instruktionerna i steg 3.2.
2. Kammarberedning för experiment med celler i inneslutning
   OBS: För att exakt begränsa celler kan monodisperse-mikropartiklar med en känd diameter användas som distanser mellan de två täckglasen.
   1. Tillsätt 10 μm polystyrenpärlor till suspenderade celler i en koncentration av ¹⁰⁴ pärlor/μL.
   2. Lägg en 10 μL droppe lösning som innehåller celler och pärlor på ett 22 x 60 mm täckglas.
   3. Smöra provet mycket försiktigt med ytterligare 22 x 60 mm täckglas så att droppen sprider sig i hela området och inga bubblor observeras. För att placera det övre täckglaset försiktigt (undvik att det faller ner plötsligt) är det bekvämt att använda tång.
   4. Eftersom provet kan torka ut rekommenderas att preparatet utförs snabbt.

5. Ställa in den optiska fällan för intracellulära mätningar

OBS: Följande steg är optimerade för en kommersiell optisk pincettplattform som består av en optisk mikromanipuleringsmodul baserad på acoustooptisk avböjning (AOD) och en optisk kraftsensor baserad på direkt detektion av ljusmomentumförändringar (figur 2, referens12,40,49). Detaljer och optiska komponenter i upplägget finns i figur 2F. För att observera kraftinducerad deformation under de optiska pincettmanipulationerna kopplas ett Nipkow spinokalt konfokalmikroskop in i den vänstra porten i det inverterade mikroskopet för fluorescensavbildning med dubbla färger. Utan brist på generalitet kan detta protokoll tillämpas med alla dynamiska OTs-system utrustade med direkta kraftmätningar baserade på ljusmoment. Detaljerade steg-för-steg-procedurer finns tillgängliga för att konstruera hembyggda optiska gradientfällor för in vivo-applikationer50. De som bygger på AOD-modulering sticker ut för eventuella experiment med flera fällor och snabba ^{mätningar51,52}. Flera protokoll för att konstruera ett lätt-momentum baserat instrument finns i litteraturen36,39,40,53, och alla andra bildframställning modaliteter (differential interferenskontrast, widefield fluorescence, etc.) kan användas.

1. Start av optiska pincett
   1. För att optimera uteffektens stabilitet, slå på lasern med betydligt hög effekt (t.ex. 3 W) minst 30 min före experimentet.
   2. Slå på elektronikmodulen för de optiska mikromanipulations- och kraftmätningsenheterna.
      OBS: Tillämpa alla lasersäkerhetsåtgärder och använd endast utrustning som godkänts av institutionsstyrelsen. Använd aldrig okularen i det optiska mikroskopet när lasern är på. Använd alltid godkända IR-skyddsglasögon (OD7 i intervallet 950-1080 nm), blockera IR-laserljuset med slutaren i epifluorescensporten 2 och utför inte den optiska svällningsprogramvaran förrän den optiska kraftsensorns inriktning är klar efter steg 5.3. Använd i allmänhet inte ett mycket reflekterande prov, eftersom ryggreflektionen kan orsaka skador på lasern.
   3. Styr svällningseffekten med den roterande HWP (bild 2F) vid ingången till den optiska mikromanipulationsmodulen.
      OBS: Den kommersiella optiska mikromanipulationsmodulen som används i det här protokollet innehåller redan den här funktionen. För hembyggda optiska svällningssystem, integrera detta verktyg för kraftkontroll så att högre och stabilare laserkrafter kan användas.
2. Använd en tom mikrokammare för kalibrering
   1. Skär en 1 x 1 cm kvadrat på en dubbelsidig scotch tejp och fäst den på en 1 mm tjock mikroskopbild.
   2. Tillsätt vatten i torget och stäng det uppifrån med ett #1,5 täckglas (22 x 22 mm). Att tillsätta en något högre volym vatten, t.ex. 30-40 μL rekommenderas att undvika bubblor inuti den täckta kammaren. Torka kalibreringskammaren försiktigt om vatten rinner ut ur den.
3. Justering av den optiska kraftsensorn
   1. Sätt en droppe vatten på 60x / 1.2 vattensänkningsmålet. Placera kalibreringskammaren på scenen med 1,5-täckglaset mot målet. Fokusera på den nedre ytan, där cellproverna så småningom kommer att vara.
   2. Tillsätt en droppe nedsänkningsolja ovanpå den övre glasrutschbanan som täcker provet (figur 2D). Sänk kraftsensorenhetens uppsamlingslins försiktigt tills den kommer i kontakt med oljedroppen.
      OBS: Droppen måste vara tillräckligt stor så att den täcker hela linsen som samlar laserljuset som kommer ut ur fällorna. Vanligtvis räcker 200 μL för att täcka hela ytan och ge en stabil nedsänkningskontakt. Var försiktig och undvik överfyllning eftersom det kan läcka in i provet.
   3. Efter tillverkarens protokoll för justeringen av den optiska kraftsensorn, titta på provplanets bild på hjälpkameran som ska användas för att placera OTs (AUX, figur 2F). Sänk försiktigt ned den optiska kraftsensorn tills fältstoppet (FS, figur 2F-G) verkar konjugerat på provplanet. Detta säkerställer korrekta direkta kraftmätningar från provinvariant detektering av ^{ljusmomentförändringar40}.
      OBS: Stäng FS tillräckligt så att dess bild blir mindre än synfältet (FOV), och därmed synlig. Var extra försiktig och tryck inte den optiska kraftsensorns uppsamlingslins mot provet. Den optiska kraftsensorns vertikala position kan alternativt bestämmas genom analys av svällningsljusfördelningen vid BFP för ljuskoner med definierad numerisk bländare (NA).
   4. Se till att det inte finns några luftbubblor i oljedroppen; dessa kan direkt påverka kraftmätningarna. För att kontrollera luftbubblor, sätt Bertrand-linsen på plats (BL, figur 2G) och observera bildvägen genom okularet. Om smuts eller luftbubblor är synliga eller mer olja behövs (figur S1A), rengör linsen och kammaren med dammfri linsvävnad och upprepa proceduren i steg 5.3.2 och 5.3.3. En fri optisk bana visas i figur S1B.
   5. Använd sidoskruvarna som placerats på hållaren på den optiska kraftsensorn och centrera FS i FOV. För noggrannhet, öppna FS så att den nästan fyller FOV som är synlig på hjälpkameran (AUX, figur 2F).

6. Optisk pincettoptimering

OBS: Den direkta kraftmätningen bygger enbart på förändringen av ljusmomentum som uppstår till följd av den kraft som utövas på den fångade partikeln, och i motsats till indirekta metoder behöver trapstyvheten därför inte kalibreras före varje experiment. Den instrumentspecifika omvandlingen av avböjnings-/kraftfaktorn (α, pN/V, ^referens41) kalibreras av tillverkaren och är därmed experiment invariant. Men eftersom laserfläcken manipuleras över ett område på 70 μm x 70 μm är steg 6,2-6,5 avgörande för att säkerställa optimal fångst och effektstabilitet. Följande steg levereras i tillverkarens programvara så att OTs optimeras över arbetsområdet på ett halvautomatiskt sätt.

1. Starta OTs-programvaran och förvärvsprogramvaran för kamera AUX.
2. Subtrahera den ursprungliga spänningsbaslinjen genom att klicka på steg 1: Elektronikförskjutningssteget i undermenyn systemkalibrering av den optiska pincettkörningsprogramvaran.
3. Om du vill utföra svällningseffektsplatta över OT-arbetsområdet ställer du in svällningseffekten till hälften av dess maximala genom att rotera HWP i enlighet därmed. Ändra inte svällningseffekten genom att ändra laserutgången, utan med den roterande HWP (bild 2F). Klicka på Steg 2: Ström för att initiera den automatiska rutinen för platta till svällningskraft.
   OBS: Detta är ett viktigt steg för att kompensera för variationen av svällningskraften över OTs arbetsområde (figur S1D). En lyckad rutin sänker trapkraftsvariationen till 2 % över OTs arbetsområde och konvergerar efter 2 minuter.
4. För att utföra kalibrering av trapposition, ta bort IR-filtret så att ljuset från lasern är synligt på kameran. Hitta IR-platsen genom att ställa in bildplanet fokuserat på mikrochamberns nedre yta. Få minsta möjliga IR-plats genom att justera bildplanet (objektiv position) och histogramkontrasten i kamerans AUX-förvärvsprogram. Om det behövs, minska effekten på den optiska fällan genom att rotera HWP (bild 2F). Klicka på steg 3: Position för att starta den automatiska rutinen eller svällningspositioneringskalibreringen.
   OBS: Denna rutin möjliggör exakt korrespondens mellan OT: s positionskoordinater i kamera AUX till AOD-styrvinklarna. En lyckad rutin genererar vinkel-till-position-mappningen på flera sekunder.
5. Initial momentumkompensation
   OBS: Den optiska fällans rörelse över provet orsakar variationer i ljus-momentumfördelningen vid BFP (figur S1E, F). Detta leder till kraftoberoende signalförändringar relaterade till laserposition över arbetsområdet, även om trapkraften har planats ut som i steg 6.3. Konsekvensen är en variation i kraftbaslinjen på grund av position (oberoende av en faktisk kraft som verkar på den optiskt fångade pärlan) som måste korrigeras före varje experiment.
   1. Ställ in svällningskraften som ska användas i experimenten genom att rotera HWP (bild 2F).
   2. Klicka på alternativet Global Offset i undermenyn Verktyg . Detta öppnar offset cancel-assistenten för den optiska pincettprogramvaran som korrigerar den ursprungliga momentumbaslinjen.
   3. Klicka på Offset | Kompensera för att korrigera positionsvariantens initiala momentum.
      OBS: Om ingen ändring påverkar den optiska banan under de pågående veckorna förblir trapkraftsutjämningen (steg 6.3) och position (steg 6.4) invarianta. Vi rekommenderar därför att du alltid använder samma kombination av optiska element (dichroiska speglar, filter etc.) som kan påverka laserfällningsbanan eller för att utföra en ny platta rutin för trapkraft. När det gäller den ursprungliga momentumkompensationen (steg 6.5) tillhandahåller tillverkaren av OTs-plattformen en kalibrering i farten som måste ändras för varje ny fångstkraft och experimentell session. Steg 6.3 och 6.4 skall utföras på den tomma kalibreringsbild som beskrivs i steg 5.2. I ett prov som innehåller celler eller andra objekt ska steg 6.5 utföras fritt från föremål som kan ändra ljusspridningen i OTs arbetsområde.
6. Du kan också fånga en mikrosfär och flytta fällan med en känd hastighet medan du registrerar kraftsignalen. Ställ till exempel in fällan för att utföra en triangulär svängning: den inspelade kraftsignalen kommer att vara en fyrkantig signal.
   OBS: Kraftvärdet ska öka linjärt med hastigheten, beroende på dragkraften som verkar på pärlan. Detta test fungerar som en positiv kontroll av att kraftmätningar utförs ^korrekt38. Alternativt kan den optiska kraftsensorn användas för att erhålla den optiska svällningsstelheten, κ [pN/μm] och positionskalibreringsfaktorn, β [μm/V], från effektspektralanalys35. Vid korrekt inriktning är den invarianta kalibreringsfaktor som tillhandahålls av tillverkaren α = κ·β [pN/V].
   1. Initiera en realtidskraftläsning genom att klicka på plot 1 i undermenyn Åtgärder i tillverkarens programvara. Detta ger en avläsning av den nuvarande optiska fångstkraften och kraften.
   2. Öppna dialogrutan Oscillation Parameters från undermenyn Verktyg . Ange en vågformsform med trekantsrum i figur- respektive typväljarringarna. Ställ till exempel in en amplitud på 10 μm och en frekvens på 3 Hz. Detta resulterar i en viskös kraft på cirka 1 pN på en mikrob med en diameter på 1 ^μm38.
   3. Högerklicka på mikroberna i kamerans AUX-fönster och välj Starta oscillerande. Kraftavläsningen blir en fyrkantig kraftsignal med platåer på ±1 pN.
   4. Högerklicka på mikroberna och välj Sluta oscillera.

7. Snurrande diskkonokal mikroskopi

1. Slå på det konfokala mikroskopet och tillbehörsutrustningen för spinndiskar, de integrerade lasermotorerna och förvärvskamerorna.
2. Starta bildprogrammet.
3. Ställ in bildkanaler för Hoechst-färgning av kärnan och GFP för cellplasmamembranet.
   1. Aktivera linjerna 405 nm och 488 nm excitationslaser.
   2. Lägg till en multibandsdichroic för att återspegla excitationen till provet och som gör det möjligt för avsänt ljus att passera till kamerorna.
   3. Dela fluorescensutsläppet med en 500 nm lång passerkant dichroisk spegel.
   4. Använd utsläppsfiltren DAPI/BFP (~445 nm) respektive GFP (~521 nm) framför de två förvärvskamerorna. Se figur 2F,G.
   5. Ställ in exponeringstiden till 100 ms för varje kanal.
   6. Ställ in laseremission för att erhålla en effekt på 5 mW vid provplanet. För att mäta effekten, använd en kommersiell kraftmätare.
4. Ställ in bildbehandlingsprotokollet. För att undvika spektralblödning från Hoechst-kanalen till GFP-kanalen måste de två färgämnena avbildas sekventiellt.
   OBS: Om det finns en maskinvarusynkronisering mellan AOD:erna för den optiska fällan och kameraförvärvet kontrollerar du att utlösarpolariteten är korrekt konfigurerad. Om du är osäker, kontakta din anläggningschef eller mikroskoptillverkare.

8. Utföra kärnindragsexperiment

OBS: Stäng alltid av de optiska fällorna - både med hjälp av programvara och stängning av slutaren på epifluorescensport 2-när du lyfter kraftsensormodulen och ändrar provet. Om inte, kan allvarliga skador på optiska element och experimenteraren uppstå. Var försiktig med sidoavståndet mellan linshållaren och bottenkanten när du letar efter celler för att undvika att stöta in linsen i scenen/odlingsskålen (bild 2).

1. Placera provet i mikroskopet och följ steg 5.3 i detta protokoll.
2. Använd den roterande HWP (bild 2F) och ställ in svällningseffekten på 200 mW som startvärde om styvheten hos kärnan eller den intracellulära struktur som undersöks inte är känd. Översätt OTs arbetsområde (med hjälp av mikroskopstadiet) till en plats utan celler för att kompensera för den ursprungliga momentumbaslinjen genom steg 6,5.
   OBS: Beroende på den subcellulära strukturens styvhet bör svällningseffektvärdet justeras till lägre eller högre värden för att erhålla ett liknande indragsdjup.
3. Använd mikroskopstegets programvarustyrenhet och leta efter en cell med en eller två pärlor genom överförd brightfieldmikroskopi (figur 3A).
4. Definiera en svällningsbana.
   1. Öppna dialogrutan Bana i undermenyn Verktyg och välj Förskjutning i väljarringen för banatyp .
   2. Skriv förskjutningen och tiden för varje efterföljande bansteg i det numeriska bladet. Här är två exempel.
   3. För ett stressavslappningsexperiment, program trapetsformade belastningar, som visas i figur 3B. I tabell S1 tillämpades två trapetsformade indrag med ett resavstånd på 5 μm. hastighet av 5 μm/s. väntetid före återkallelse: 10 s.
   4. För ett repetitivt indenteringsexperiment med konstant hastighet för att erhålla en triangulär rutin utan uppehållstid på kärnan, ställ in banans amplitud, t.ex. 5 μm, och tiden för steget, t.ex. 2 s för en hastighet av 2,5 μm/s. I tabell S2 tillämpas detta åtta gånger med samma hastighet.
      OBS: Dessa värden måste bestämmas för varje celltyp och experiment, men följande parametrar för en trapetsformad rutin fångar den viktigaste dynamiken i experimentet som presenteras här. Väntetiden bör vara tillräcklig för att kärnan ska visa sin fullständiga stressavslappning efter indrag
5. Fånga en mikrosfär
   1. Ställ in bildplanet något ovanför pärlan med mikroskopstegens programvarustyrenhet.
   2. Aktivera fällor med hjälp av OTs-programvaran och klicka på pärlan i kamerans AUX-bildfönster (kalibrerad efter steg 6.4). Framgångsrik inneslutning av pärlan av den optiska fällan kommer starkt att minska pärlans rörelse.
   3. Klicka och dra pärlan över cytoplasman och placera den på ett avstånd av ~2 μm från kärnhöljet (figur 3A). Se till att banan är inställd så att pärlan är vinkelrät mot kärnmembranet.
6. Alternativt, om det behövs för positionsmätningar av pärlan i förhållande till fällan, skanna fällan över pärlan för att bestämma svällningsstyvheten, k [pN/μm]⁵⁴, därmed Δxbead = -F/k (se Diskussion). Den optiska mikromanipulationsmodulen som används i detta protokoll har en inbyggd rutin för detta ändamål.
   1. Öppna dialogrutan Partikelsökning i undermenyn Verktyg .
   2. Välj den svällning som du vill skanna och Högfrekvent som skanningsmetod. Välj riktningen (x eller y) för indragsbanan för skanningsmätningen av pärlor.
   3. Ett fönster visas med mätning av svällningsstyvheten. I diagrammet drar du de två markörerna för att markera det linjära svällningsområdet som motsvarar F = -kx. Den linjära anpassningen till den valda datadelen uppdateras automatiskt.
      OBS: Ställ in pärlans ursprungliga position långt från cellmembranet (~5 μm), eftersom ljus-momentumavböjningar vid mellancellsgränssnittet påverkar lämpligheten av kraftmätningar. Om kärnan ligger för nära cellmembranet, försök att dra in kärnan från motsatt plats. Kassera cellen om det inte är möjligt.
7. Starta bildförvärv genom att klicka på förvärvsknappen i bildbehandlingsprogramvaran.
8. Starta svällningspositionen och tvinga mätdata att spara genom att klicka på Data | Spara i realtidskraftavläsningsfönstret (öppnas enligt steg 6.6.1).
   OBS: Den optiska fällan är utrustad med en utlösningsingång som kan anslutas till kamerans tidsutgångsutgång. Således är bild- och kraftdata hårdvarusynkronisering och elektroniken kan kartlägga svällningscyklerna med antalet bildramar under förvärvet.
9. Initiera den tidigare inlästa banan genom att högerklicka på pärlan och välja Startbana.
10. Vänta tills banan är klar och systemet stabiliseras.
11. Stoppa sparande av mätningsdata för svällningskraft. En dialogruta för databesparing dyker upp.
    För att optimera datalagring kan data decimeras genom att välja decimeringsparametern i den här dialogrutan (10, 100 eller 1000).
12. Stoppa bildförvärvet och rita resultaten i den efterbearbetningsprogramvara som användaren väljer.
13. Om mikrosfären går förlorad under rutinen och kärnan inte kan dras in (figur S2), kassera mätningen och öka effekten. Observera att steg 6.5 måste upprepas. I våra händer är minst 95% av rutinerna framgångsrikt slutförda utan att förlora pärlan från fällan.

Representative Results

Mikroinjektion av fångstpärlor:
Mikrosfärer injiceras i zebrafiskeembryon med en cell spridda över hela djurlocket under morfogenes. För en tydligare visualisering upprepade vi injektionsprotokollet med röda fluorescerande mikrober och tog volymetriska bilder med vårt konfokala mikroskop i olika utvecklingsstadier. I figur 4A-D visualiseras injicerade pärlor i cytoplasman hos stamceller in vivo vid 5 hfp. Senare visades mikrosfärer spridas över hela embryot vid 24 hpf (figur 4E). Embryon i båda stadierna utvecklades normalt och överlevnadsgraden var jämförbar med icke injicerade eller mock-injicerade embryon (se figur S3). Detta överensstämmer med andra studier som rapporterar ostörd överlevnad av pärlinsprutad zebrafisk upp till 5 dagar efter ^{befruktning55}.

Vårt spinndiskkonfokala mikroskop är kompatibelt med flerkanalig fluorescensmikroskopi. I figur 5A visar vi isolerade stamceller med en eller två pärlor i cytoplasman. Flera fluorescerande etiketter kan användas för att undersöka olika aspekter av cellen (figur 5B). Kärnmorfologi kan spåras med ett Hoechst-färgämne eller med hjälp av ett H2A::mCherry mRNA-uttryck, medan inre kärnmembran kan analyseras med Lap2b-eGFP12. Dynamiken i aktomyosinbarken, liksom intracellulära kalciumnivåer, kan observeras med en My12.1::eGFP transgen ^linje56 respektive Calbryte-520 inkubation. Protokollet som har beskrivits här syftar till att jämföra cellkärnmekaniken hos immobiliserade vilda typceller på självhäftande substrat (senare kallad suspension) och i mekanisk inneslutning. Isolerade stamceller som är inneslutna i mikrochambers av 10 μm höjd uppvisade partiell utfällning av det inre kärnmembranet (INM) och en efterföljande ökning av actomyosin ^{contractility12}. I figur 5C visas begränsade celler med en eller två pärlor i cytoplasmans. Framgångsrik inneslutning kommer att vara synlig via platta, expanderade celler med ett bredare tvärsnitt av kärnan. Kärnmembranet utvecklas ytterligare i slutna celler och bör verka utjämnat i jämförelse med celler i suspension (figur 5C).

Force-time och force-deformation analys
Analysen av de erhållna resultaten beror starkt på det undersökta exemplaret och frågan om intresse och därför kan de inte generaliseras här. Som ett exempel är ett vanligt sätt att analysera indenteringsmätning att extrahera en Youngs modulus genom att montera en modifierad Hertz-modell på ^{kraftindragsdata57}. Antagandet för en sådan behandling måste dock noggrant bedömas och kanske inte alltid vara korrekt motiverat (såsom den undersökta strukturen är isotropisk, homogen, med linjär elasticitet och indrag som är mindre än pärlradien). Vi överväger därför endast modelloberoende mätningar här som gör att den undersökta strukturens mekaniska beteende kan jämföras mellan olika experimentella scenarier.

Som utgångspunkt ger mätning av lutningen på kraftförskjutningskurvan vid ett visst indragsdjup ett mått på en modell oberoende strukturell ^styvhet58 av kärnan. Detta värde kan sedan samlas in från flera prover och jämföras mellan olika experimentella inställningar och provperturbationer.

Mätning av indrag
I följande linjer fokuserar vi på cellkärnans mekaniska respons under celldeformation i inneslutning. Experiment i steg 8 i detta protokoll leder vanligtvis till krafttoppar på upp till 200 pN för indragsdjup på cirka 2-3 μm. Dessa värden kan dock vara i stort sett olika, beroende på celltyp och experimentella förhållanden, med mjukare kärnor som leder till lägre kraft för en given indentering. Det behövs därmed för att noggrant mäta den nukleära deformationen, tillsammans med kraft, för en noggrann mekanisk karakterisering av cellkärnan. I det här avsnittet kommer vi att få cellens kärnstelhet från representativa kraftindragsmätningar.

I figur 6 visar vi deformationerna av de distala och proximala sidorna av en kärna i en suspenderad och begränsad cell. Ett rikt mekaniskt beteende kan observeras. I en typisk suspenderad cell på ett självhäftande substrat var kärnan starkt indragen av pärlan, men också något förskjuten vid repetitiva pushing händelser. Vi mätte pärlan indentering på kärnan genom att analysera kymographs erhållna från fluorescens imaging av Hoechst-färgade cellkärnor. Kymographs beräknades enkelt med Fijis Multi Kymograph plugin längs indenteringsriktningen (figur 6A, B) och importerades till Matlab (Version 2021, Mathworks) för vidare bearbetning. En stegfunktion monterades på den råa intensitetsprofilen i syfte att spåra kärnans avgränsande kanter längs indragsrutinens bana. Som framgår har den korrekt information om den nukleära formförändringen (figur 6 och figur S2). Vi använde följande dubbel suckmoidkurva som en analytisk version av en stegfunktion:

(Ekvation 1)

Här betecknar _x1 och _x2 kärnans distala och proximala kanter, medan A och B är de maximala och bakgrundsgrå värdena för bildens blå kanal (Hoechst dye) (bild 6B). Kantbredden har beaktats (_e0 = 0,25 mm). Medan den indragna, proximala kärnan kanten (_x2) följde den bana som tillämpas av den optiska trap-rutinen efter mikrosfärkärnkontakten, visar den motsatta distala kanten (_x1) avslappningsdynamik som förväntat för ett viskoelastiskt material som cytoplasman (figur 6D). Kärnor i celler som är inneslutna i 10 μm höga mikrokammare uppvisar däremot inte ett sådant flyttningsbeteende hos kärnan vid indrag i cellen (figur 6B,D). Även i figur 6D förblir de bakre kanterna på kärnorna oförändrade av pärlan som skjuter från den proximala sidan, troligen på grund av starkare krafter som härrör från cellkontraktilitet och friktion som verkar mot indragskraften. För att få rätt deformationsdjup subtraherades förskjutningen x1 från det indragna måttet x2: Δx = x2 - _x1 (se även figur 6D).

Tvinga dataanalys
Kraften som orsakade kärndeformation mättes från förändringen i ljusmomentum som uppstod vid den optiskt fångade mikrobaden (figur 7A). Kraften vid applicering av trapetsformade banor (steg 8.4.3, figur 7B) ökade inledningsvis linjärt tills fällan slutade röra sig, men slappnade sedan av till ett stabilt tillståndsvärde. Detta beteende anges en viskoelastiskt material uppvisar förlust och lagring moduli. Direkt efter indragshändelsen nådde kraften ett toppvärde, Fp, följt av en stressavslappning (figur 7C):

(Ekvation 2)

där F0 är den lagrade kraften för den elastiska komponenten och f(t) är en dimensionslös avslappningsfunktion. Vi har analyserat detta beteende på tre sätt:

1. Med tanke på ett standardfast linjärt fast ämne med exponentiell stressavslappning, dvs.

2. Med hjälp av ett allmänt, dubbel-exponentiellt förfall:
F(t) = A + B1e-t^/τ1 + ^B2e-t/τ2.

3. Med hjälp av en maktlag följt av ett exponentiellt ^förfall59:
f(t) = ^t-pe-t/τ, monterad i figur 7C.

Även om passformen för modell 1 kan utföras enkelt, rekommenderar vi att du uppskattar de första gissningarna för (τ1, τ2) respektive (p, τ) för modellerna 2 respektive 3. Detta kan utföras genom att anpassa linjer på data i logaritmiska kontra linjära (figur 7D, vänster) och logaritmisk-kontra-logaritmiska (figur 7D, höger) skalor. Tabell S3 sammanfattar resultaten för exemplet som analyseras i figur 7. I följande avsnitt kommer vi att överväga kombinationen av en maktlag och en exponentiell lag för karakterisering av cellkärnmekaniken.

Förhållandet mellan tvångsförskjutning
På samma sätt kan den beskrivna experimentella uppsättningen användas för att erhålla förhållandet mellan tvångsförskjutning av flera indragshändelser. Genom att utföra triangulära rutiner (steg 8.4.4, figur 8A) är det möjligt att relatera kraften till deformationen och rita en kraftindragskurva. Ett föredömligt resultat visas i figur 8B, där en platt baslinje smidigt ändrade lutningen när pärlan kom i kontakt med kärnan. Att identifiera den verkliga kontaktpunkten i bullriga data är en utmaning, och man måste vara försiktig för att se om kontaktregionen är lämplig för elastiska ^modeller60. I detta särskilda experiment kunde man också se att de efterföljande indragen resulterar i kurvor med djupare kontaktpunkter, vilket tyder på för långsam återvinning av kärnformen efter återkallelse av pärlor och en förändring i den hysteretiska cykeln som definieras av de viskoelastiska materialegenskaperna hos kärnan (figur 8C). Forskaren bör därför vara medveten om detta och införliva detta i analyspipelinen, eller begränsa antalet efterföljande mätningar så att denna effekt inte ändrar mätningen.

Nucleus mekanik i celler i suspension och under 10 μm inneslutning
Det ovannämnda tillvägagångssättet användes för att analysera dynamiken i kärnan stress avslappning i suspenderade celler på lim substrat och begränsade celler. Våra resultat visar att inneslutningen resulterar i en utvidgning av det beräknade området (figur 9A), men obetydlig förändring av kärnstelheten (figur 9B). Vi mätte liknande avslappning med τ = 6,08 ± 1,1 s (obekräftad) och τ = 4,00 ± 0,6 s (inneslutning), vilket indikerar snabb viskoelastisk upplösning, följt av ett lagrat kraftvärde som motsvarar kärnans elastiska modulus. För att ta hänsyn till experimentella variationer, som kan framställas av olika inledande förhållanden i indragsrutinerna, normaliserades uppmätta lagrade krafter till indragsdjupet, som . Denna parameter står för kärnans styvhet och beskriver den kraft, eller stress, som är nödvändig för en viss indrag. Vi erhöll liknande styvhet under inneslutning och i obekräftade celler: = 20,1 ± 12,6 pN/μm respektive = 24,6 ± 13,6 pN/μm (genomsnittlig ± standardavvikelse).

Figur 1: Mikroinjektion av zebrafiskembryon i encellssteg (zygot). Plattan är tillverkad av 1% ultrapure agaros i E3 (Äggets medium). Vyer över och på sidan visas till höger. B) Embryopositionering: rikta försiktigt embryona med hjälp av en borste och orientera så att encellen är väl synlig och lättillgänglig med nålen. Vi föreslår att orientera embryona med cellen som ligger på motsatt sida av nålen, som visas i skissen. C) Injektionsförfarande i embryot i encellsstadiet: genomborra den chorion som omger embryot och den enskilda cellen med nålen. Se till att nålens spets är inne i cellen och släpp trycket för att injicera. D) Inkubera embryona vid 28–31 °C tills de utvecklas upp till blastulastadiet (4 hpf). Utför cellisoleringsprotokollet och cellfärgningen (steg 2) och förbered den optiska svällningskammaren med isolerade celler i suspension och/eller inneslutning i kombination med motsvarande substrat ytbeläggning (steg 3). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Bild 2: Förberedelse av den optiska pincettapparaten. (A) Spin-beläggningsskikt av PDMS med en definierad höjd på glasbottenfat. PDMS-fallet kommer att spridas jämnt på grund av centrifugalkraften. B) Beredning av provkammaren ur PDMS-skiktet. 1: skär en kvadrat med en skalpell, 2: täck den inre brunnen med konkavalin A (ConA), tvätta och fröceller; 3: täck med en glasrutschbana eller täckslip för att försegla brunnen. (C) Bild av kvadratskärningen med en skalpell och avlägsnande av PDMS-brunnen med tång. (D) Montering av den optiska kraftsensorns uppsamlingslins över svällningskammaren. En droppe nedsänkningsolja fungerar som ett nedsänkningsmedium mellan uppsamlingslinsen och det övre glashöljet. Schematiskt att inte skala. Var försiktig när du sänker uppsamlingslinsen för att inte vidröra provfatets glashölje. E) Bild av kraftdetekteringsenheten i kontakt med provet. F) Schemat för den experimentella uppsättningen. Den optiska mikromanipulationsmodulen använder en kontinuerlig våglaserstråle (5W, λ = 1064 nm) med effektkontroll genom en halvvågsplatta (HWP) och en polariserande stråldelare (BS). Efter att ha modulerats med ett par AODs är den kopplad till den övre epifluorescensporten i ett inverterat mikroskop. Laserstrålen reflekteras sedan av en 950 nm kortpassad dichroisk spegel (IR-DM), vilket möjliggör överföring av fluorescensexcitation och emission. Svälllasern styrs in i mikroskopets bakre epifluorescensport (övre tornet). OTs skapas vid fokalplanet i en objektiv objektiv för vattensänkning (60x, NA = 1,2). Den optiska kraftsensorn utsätts för mikroskoptornet och fångar laserljuset som kommer från OTs med en hög NA, olje-nedsänkningslins. Samtidigt möjliggör kraftsensorn ljusfältsbelysning. Den konfokala enheten med snurrande disk är kopplad till den vänstra porten. Den är utrustad med två integrerade lasermotorer (ILE) som styr sju fluorescens excitationslasrar och två bakgrundsbelysta sCMOS-kameror, vilket möjliggör dubbel fluoroforavbildning parallellt med Abb: TI, Transilluminator; FS, fältstopp; AOD, acustooptical deflector; HWP, halvvågsplatta; CAM, kamera (G) Fotografi av den optiska fångstutrustningen. Röd cirkel anger Bertrand-linsen, som kan växlas till den optiska banan manuellt. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 3: Välja rätt prov och parametrar. (A) Representativ bild av en isolerad zebrafisk stamcell med en enda mikrosfär placerad tillräckligt nära kärnan för att utföra indenteringsexperimentet. Skalstång = 10 μm. (B) Exemplarisk fälla bana; indragsdjup 5 μm; indragshastighet = 5 μm/s; avslappningstid 10 s. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Mikroberlokalisering inuti zebrafiskembryon under utveckling. 0,5 nL av 1 μm röda fluorescerande pärlor injiceras tillsammans med GPI-GFP mRNA (100 pg/embryo, plasmamembran) i WT embryon för att visualisera pärla lokaliseringar. (A-D) Fördelning av mikrosfär 5 h efter injektion inuti ett embryo monterat i 0,75% agaros. (A) Brightfield och fluorescensbild. Pärlorna sprids homogent över embryovävnaden som ses i en konfokal mikrograf. B) Maximal projektion av konfokal fluorescens z-stack. Pärlorna är färgkodade från lila till gult enligt deras z-position i bildstacken. Lila/magenta motsvarar de mest yttre pärlor/celler (EVL; epitelial omslutande skikt; eller stamceller som ligger nära EVL-ytan), gult motsvarar inre pärlor (stamceller djupa celler), som visas i skissen till höger. C) Skuren och maximal projektion av en understapel av (B) som motsvarar regionen i den orange rutan: en stor del av djupa celler innehåller 1-2 pärlor. (D) Skuren och maximal projektion av en understapel av (B) som motsvarar magentalåda: vissa EVL-celler innehåller 1-2 pärlor. (E) Brightfield-bild och maximal projektion av en z-stack av ett 24 hpf embryo monterat i 0,75% agaros och sövd med trikain. Embryon var pre-inkuberade med trikain i 15 min. Från vänster till höger: mikrosfärer (1 μm diameter), GPI-GFP och bildöverlappning. Pärlorna fördelade över hela embryots kropp. Skalstångsdimensionen som anges på varje panel. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 5: Isolerade zebrafiskstamceller med olika märkning. A) Överföringsljusmikroskopibild av suspensionsceller med 1 (överst) eller 2 (nedre) injicerade pärlor. Cyanpilar pekar på pärlor. (B) Fluorescerande konfokala bilder av suspensionsceller med olika färgningar. Uppe till vänster: Lap2b-eGFP (inre kärnmembran, 80 pg/embryo) och H2A-mCherry. Uppe till höger: GPI-GFP (plasmamembran, 100 pg/embryo) och DNA-Hoechst (färgat enligt beskrivningen i avsnitt 2). Nedre vänstra: MyI12.1-eGFP (transgen linje) och DNA-Hoechst. Längst ner till höger: Calbryte488 och DNA-Hoechst (färgade enligt beskrivningen i avsnitt 2). C) Överföring ljusmikroskopibild av begränsade celler med 1 (övre) eller 2 (nedre) injicerade pärlor. Cyanpilar pekar på pärlor. Skalningsstaplar = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6: Uppskattning av kärndeformation från spinnskivor. Skalstång 10 μm. Representativa ögonblicksbilder av en Hoechst-märkt kärnor visas 5 s före, under och 5 s efter indrag med en optiskt fångad mikrosfär (vit pilspets). Kymographs längs indenteringssegmentet (röd linje, höger panel). _x1 och _x2 är kärnans distala och proximala (nära pärlan) gränser under indenteringsexperimentet som extraheras från intensitetsprofilens passform till ekvation 1. C) Intensitetsprofiler längs indragssegmentet för tre olika bildrutor (före, under och efter indrag) och monterade på ekvation 1 för att bedöma kärnkanternas distala, _x1 och proximala, _x2. D) Representativa banor för _x1(t) i blått och _x2(t) i bärnsten under ett indenteringsförsök av suspenderade och slutna celler (10 μm). Skuggade områden anger indraget, avståndet mellan _x1 och _x2 anger kärnans diameter. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 7: Force signalbehandling. (A) Schematisk av en optiskt instängd mikrosfär som deformerar cellkärnan vid indrag. Kärnmembran och optiska krafter indikeras av de svarta pilarna. Förändringen i strålmomentum indikeras av den gröna pilen _Pout. B) Fällans bana (överst) och kraft (botten) som upplevs av den optiskt fångade mikrosfären under ett upprepat kärnindragsexperiment. (C) Tvinga avslappningsförfall efter krafttoppen vid maximalt indragsdjup. Infälld visar en schematisk standard linjär solid vars dynamik approximerar de fenomenologiska observationerna här. D) Vänster: logarithm av normaliserad kraft kontra tid. De skuggade områdena anger den datadel som används för att passa det dubbla exponentiella sönderfallet (röda linjer). Höger: logarithm av den normaliserade kraften kontra tidens logarithm. Det skuggade området anger den datadel som används för att passa maktlagen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 8: Force indenteringsrutin med triangulära trapförskjutningar. Överst: Svällningsposition. Mitten: Kärnformsanalys. Avståndet mellan _x1 och _x2 anger kärnans diameter. Botten: Kraftsignal. B) Kraft vs svällningsposition för åtta på varandra följande indrag. C) Utvecklingen av avledning, härledd från hysteresen mellan inflygningen och tillbakadragandedelen av f-d-kurvan, av kärnan för varje efterföljande indenteringshändelse. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 9. Nukleära egenskaper hos celler i suspension (självhäftande yta) och inneslutning från trapetsformade rutiner. A) Den beräknade delen av kärnan från celler i suspension och under 10 μm inneslutning. Svart stapel representerar medianvärdet. B) Cellernas kärnstelhet i suspension och under inneslutning. Svart stapel representerar medianvärdet. P-värden som härletts från Kruskal-Wallis-test med MatLab. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Kompletterande tabell 1: Trapezoidal bana definierad av den optiska pincett programvara. Första (andra) raden är x (y) avståndet som fällan kommer att förskjutas linjärt. På den tredje raden anges varaktigheten för ett visst steg i sekunder. Denna bana består av sju punkter och motsvarar trapetsoiden laddad två gånger mot kärnan i figur 7B. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Kompletterande tabell 2: Triangulär bana definierad av programvaran för optiska pincett. I likhet med tabell 2 består denna bana av 16 punkter, vilket motsvarar åtta indragshändelser med ett djup av 5 μm och en hastighet av 2,5 μm/s. Klicka här för att ladda ner tabellen.

Kompletterande tabell 3: Anpassningsparametrar för uppgifterna i figur 7. IG: första gissning. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Kompletterande figur S1: Optisk kraftsensorjustering och kompensation för momentumbaslinjen. (A) Fältstopp avbildat vid hjälpkameran (AUX, bild 2) genom Bertrand-objektivet. En luftbubbla syns i nedsänkningsoljan, som inte syns genom okularet. B) Ren optisk bana. För korrekt inriktning, öppna fältstoppet och se till att det sammanfaller med NA = 1,2 ljuskon. C) Bild av provplanet. Den röda fyrkanten anger OT-arbetsområdet. Skalstång: 20 μm. (D) Trap effekt mätt över FOV, längs vita dubbelpilar som anges i C. I rött sväller effektvariation när ingen korrigering tillämpas. I blått korrigeras svällningskraften över hela synfältet. (E) X-komponent i momentumbaslinjen längs samma intervall. I rött, icke-korrigerat spår. I blått, spåra korrigerad för fälla makt. I grönt korrigeras spårningen för momentumbaslinjen med global kompensation för kompensation i tillverkarens programvara. F) Samma som i E, för Y-komponenten. Observera att under normal drift används de skuggade komponenterna för mekanik och kraftmätningar, t.ex. x kraftkomponent under rörelse längs x-koordinaten och y-kraftkomponenten under rörelse längs y-axeln. När alla korrigeringar har genomförts erhålls ett RMSD-brus på <0,5 pN. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S2: En misslyckad rutin på grund av svaga fällor. A) Kymograph som visar en nucleus indentation från en misslyckad rutin. Endast korta, övergående deformationer är synliga på grund av en flykt av pärlan från fällan. Viktigt är att svällningslasern fortfarande rör sig utan pärlor för att slutföra den fördefinierade banan (grön prickad linje). Skalstång = 10 μm. (B) Topp: Svällningsposition kontra tid. Mitten: Kantspårningsresultat av den indragna proximala och distala kärnan kanten. Observera att distala kanten inte rör sig utan indrag som vanligt observeras för färdiga rutiner på isolerade celler på självhäftande substrat. Botten: Kraft kontra tid som visar förlusten av mikrosfären som indikeras av en minskning av termiskt brus och en plötslig minskning till noll kraft. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S3: Överlevnad av injicerade embryon. Embryon som injicerats med 1 μm pärlor och 100 pg/embryo av mRNA vid koncentrationer som beskrivs i protokollet jämfördes med oin injicerade embryon och visar inga signifikanta skillnader 24 h efter befruktning. Medelvärde och standardavvikelse för tre oberoende experiment med N > 21 embryon per villkor för varje experiment. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

I detta protokoll beskriver vi en unik metod för att förhöra de mekaniska egenskaperna hos cellkärnan inuti de levande cellerna. Till skillnad från andra kraftspektroskopitekniker, icke-invasiv optisk fångst tillät oss att frikoppla bidraget från cellmembranet och cytoskeleton från cellens kärnstelhet. Viktigt är att optisk mikromanipulering är kompatibel med multimodal mikroskopi, vilket gör det möjligt för experimenteraren att studera olika processer som är involverade i cellkärnmekanobiologi. Som ett representativt resultat använde vi DNA-Hoechst färgning för att mäta kärnan deformation vid indrag utförs av krafter i ordningen av flera hundra picoNewton.

Potentiella tillämpningar av vår metod utöver de exempel som beskrivs i detta protokoll
Möjligheten att extrahera kvantitativ mekanisk information från mätningar inuti levande celler utan yttre störtdyningar möjliggör en mängd oöverträffade möjligheter som just har börjat utforskas. Således kan det presenterade protokollet för vår optiska mikromanipulationsplattform utvidgas till mer komplexa experiment med stor mångsidighet. Acoustooptiska deflektorer (AOD) kan generera flera optiska fällor för synkron kraftmätningar på olika cellplatser, samt kan användas för aktiv mikrorheologi i ett brett ^{frekvensområde51,61}. Som nämnts kan kraftresponsen vid indrag övervinna den maximala fångstkraften, vilket leder till att pärlan flyr från den optiska fällan. I det här fallet kan en kraftåterkoppling konfigureras med AOD för att klämma fast den optiska kraften. Sammantaget kan flera mikrorheologiska metoder, såsom stressavslappningen som beskrivs i detta protokoll, men också aktiv mikrorheologi eller krypefterlevnad, experimentellt erhållas med denna plattform och noggrant analyseras av nya programvarupaket61,62,63,64,65 . Dessutom är användningen av krafter inte begränsad till kärnan utan skulle i princip kunna utföras för att mäta olika intracellulära strukturer och i komplexa vävnader, vilket visats för att fånga strömmande röda blodkroppar inuti intakta ^{blodkärl66,67} eller fånga och deformera kloroplaster och mitokondrier68 . Ljus-momentum kalibrering är oberoende av formen och storleken på det fångade objektet, vilket möjliggör direkta kraftmätningar på alla kraftsonder med godtycklig ^form38,39. Användningen av injicerade mikrosfärer gjorde det möjligt för oss att applicera höga krafter på kärnan med relativt låg lasereffekt jämfört med direkt manipulering av cellulära strukturer69,70,71. Men med tanke på en tillräckligt hög brytningsindexskillnad är ingen externt applicerad kraftsond nödvändig och intracellulära organeller kan manipuleras direkt utan injicerade pärlor (opublicerade observationer och ^referens70).

Potentiella ändringar av vår metod för att utöka applikationerna
Olika storlekar av mikrober kan injiceras beroende på experimentet, men de relativa kontrollerna måste göras. Till exempel, för att studera celler i senare skeden kan mindre pärlor injiceras. Detta minskar den maximala kraft som kan utövas av den optiska fällan (t.ex. visas i ^referens55). Större pärlor kan injiceras för att utöva högre krafter, men dessa kan påverka embryoutvecklingen beroende på deras storlek eller intressestadium. I experiment där mikrobadinjektion inte är ett alternativ kan olika organeller som uppvisar brytningsindexskillnader jämfört med cytoplasmans fortfarande manipuleras optiskt, vilket ger upphov till optiska krafter som kan mätas från ^{ljusmomentumförändringar42}. Som nämnts ovan har dessa metoder använts av Bambardekar m.fl. för att deformera cellcellskorsningar i Drosophila ^embryo70. På samma sätt har cellens kärna ett lägre brytningsindex än det omgivande ^medium44, vilket möjliggör pärlfri indrag (opublicerade observationer och ^referens72) även om den har en lägre fångststyrka. Således kan kärnan inte fångas lätt och flyr fällan.

Den spinnbelagda PDMS-distansen tillverkas via en bekväm och snabb metod men kan vara utom räckhåll för laboratorier utan tillgång till en mikro-/nanotillverkningsanläggning eller tekniska laboratorier. Således kan distansen enkelt monteras från labbband eller parafilm (steg 4). Protokollet kan också anpassas genom tillverkning av mikrofluidiska kanaler som automatiserar leveransen av enstaka celler till fördefinierade mätbrunnar eller in i en kammare med en definierad höjd för att uppskatta inneslutningseffekten inom samma prov. Sådana mikrofluidiska anordningar måste dock vara konstruerade så att de passar utrymmet mellan mikroskopmålet och den optiska kraftsensorns uppsamlingslins på cirka 2 mm (se steg 3). Observera att den optiska kraftsensorn måste placeras på lämplig höjd så att inga optiska avvikelser från defokusering påverkar fotonmomentummätningen.

Andra ändringar kan vara byte av biologiska reportrar. Vi fann att Hoechst fluorescens spektralblöder in i GFP-kanalen och vi föredrar därmed kombinationen med mCherry-taggad histon som en kärnmarkör för samtidig mätning i två fluorescerande kanaler. Alternativt kan kärndeformation enkelt spåras med en etikett riktad mot det inre kärnmembranet som Lap2b-GFP (figur 2).

Indentering på cellkärnan var i storleksordningen 2-3 mikron, som vi exakt kunde mäta genom bildanalys av diffraktion-begränsad spinning-disk confocal mikroskopi. När det gäller styvare kärnor eller mindre krafter kommer indraget knappt att vara mätbart med detta tillvägagångssätt. De absoluta kraftkalibrerade optiska pincetterna kan dock också kalibreras för positionsmätningar av den fångade pärlan på plats med hjälp av BFP-interferometri med nanometernoggrannhet51. Med denna metod kan spänningssignalen och den optiska kraftsensorn översättas till den fångade sondens position genom parametern β [nm/V], medan den invarianta parametern α [pN/V] ger kraftvärden genom ovannämnda ljus-momentumkalibrering41 (se nedan för detaljer).

Felsökning
Vi fann att följande utmaningar kunde uppstå under experimentet:

Ingen stabil fälla bildas och mikrosfären flyr lätt
Smuts på mikroskopmålet eller en felriktad korrigeringskrage kan leda till att en stabil fälla misslyckas. Om en omedelbar lösning inte hittas, mät objektivets punktspridningsfunktion. Om provexemplaret är djupt inne i en optiskt tät vävnad kan laserfokus uppleva allvarliga optiska avvikelser som leder till instabil fångst (denna effekt är vanligtvis försumbar i isolerade celler men blir tydligare i tjockare vävnader). För hög styvhet kan kärnans återställande kraft överstiga fällans utrymningskraft, så att mikrosfären går förlorad och indragsrutinen misslyckas. Inledningsvis blir kärnmembrankanten proximal till den optiska fällan knappt indragen (figur S2A). När detta inträffar påverkas inte heller svällningslasern av kraft och brownsk rörelse, vilket leder till en kraftfall till noll och en minskning av signalbruset (figur S2B). Om detta händer kan lasereffekten ökas för att ha en starkare fälla, amplituden hos trapetsformad bana som trycker pärlan i kärnan kan minskas, eller den fångade mikrobadens ursprungliga position kan ställas längre bort från kärnan.

Cellen rör sig under stimuleringen
Om cellerna inte är tillräckligt fästa, kommer den optiska gradientfällan att flytta cellerna medan de utför den intracellulära indragsrutinen, så att kärnans krafter och underliggande mekanik är artefaktuella. För att förhindra förskjutning av hela cellen rekommenderar vi att koncentrationen av cell vidhäftning molekyler på ytan, t.ex. ConA.

Initial momentumkompensation
Om en inledande momentumkompensationsrutin inte är tillgänglig i OTs-plattformen (steg 6.5) måste en artificiell, kraftoberoende baslinjesignal korrigeras för. Detta är synligt som en lutning på kraftkurvan även utan att pärlan är instängd (figur S1E). För att göra korrigeringen måste samma bana utföras utan en pärla, utanför cellen på exakt samma position. För detta flyttar du cellen bort från fällan med hjälp av scenkontrollen. Som referens ändras kraftförskjutningen 5 pN över FOV vid 200 mW i vårt system; således blir det försumbart för korta banor. Alternativt kan ett piezo-skanningsstadium användas för att flytta cellerna på provet och lämna laserpositionen konstant.

Kritiska steg i det presenterade protokollet
Mikrosfärer ska injiceras i rätt 1-cellsstadium för att säkerställa maximal fördelning över embryot. Pärlor bör inte vara fluorescerande så att inget ljus läcker in i de fluorescerande kanaler som används för avbildning. Till exempel är även typiska röd-fluorescerande pärlor tydligt synliga i den blå kanalen som används för att avbilda cellkärnan efter Hoechst-färgning på grund av deras ljusstyrka (excitation: 405 nm; emission: 445 nm). Stabil fastsättning av cellen på substratet är avgörande för att förhindra lateral förskjutning under indragningsrutinen. Om cellen rör sig under rutinen underskattas krafterna. Om detta skulle hända ofta optimerar du protokollet för bifogade filer. För vävnadsodlingsceller leder andra cell vidhäftningsproteiner, såsom fibroktin, kollagen eller poly-L-lysin, till tillfredsställande fastsättning (opublicerade observationer). Under inneslutningen utsätts cellerna för en plötslig och allvarlig mekanisk stress. Detta kan orsaka skador på cellerna och ofta kommer experimenteraren att stöta på spruckna celler om proceduren inte utförs noggrant. Om inneslutningshöjden är för liten kommer alla celler att drabbas av nukleär omslutningsbrott eller irreversibel skada. För att mildra dessa sänker du det övre täcket långsammare och/eller ökar avståndet mellan täckslipet.

Begränsningar av tekniken och förslag för att övervinna dem
En tydlig begränsning av tekniken är laserljusets penetration i djupa delar av vävnaden, vilket leder till avvikelser och instabil fångst. Således beror en lägre gräns för penetrationsdjupet på provets klarhet, avvikelsekorrigeringen som kan ^användas73 och den applicerade lasereffekten. Det bör beaktas att en högre lasereffekt leder till termisk excitation av provet i närheten av mikrosfären. Uppvärmningen av provet som härrör från laserpunkten på 1064 nm minimeras dock för att undvika rimlig värmerelaterad stress på våra biologiska ^prover74.

En annan begränsning är den maximala kraft som kan mätas. Även om direkt ljus-momentumdetektering möjliggör kraftmätningar långt bortom den optiska trapets linjära ^{responsregim40,41}, är den maximala applicerade kraften i en ordning av några hundra picoNewtons. Detta begränsas av lasereffekt och följdskadetröskeln för mjukt biologiskt material och brytningsindexskillnaderna, som normalt inte är större än 0,1 eller ^0,344. Flera metoder har föreslagits för att öka kraftdetekteringsgränsen, t.ex. med hjälp av strukturerat ^ljus75, antireflekterande belagda ^{mikrosfärer76}, högreaktiva ^{indexpartiklar77} eller mycket dopade kvantprickar78.

OTs kan användas för nanometerskalans positionsmätningar genom BFP-interferometri, så att pärlans position i fällan är Δx = β Sx, där _Sx är sensorns spänningssignal, och β [μm/V] kan kalibreras i farten enligt olika ^{protokoll35,54}. För en optisk kraftsensor kan det bevisas att spänning-till-kraft-invariant omvandlingsfaktorn α [pN/V] direkt relaterar till β och fällans styvhet, k [pN/μm], genom α = kβ ³⁷) I experiment med pärlförskjutningar som är för små för att detekteras från optisk avbildning kan denna strategi användas för att komplettera kraftmätningar med liten positionsdetektering. Ett exempel är tillämpningen av de experimentella rutiner som presenteras här på mycket styva kärnor, för vilka krafter vid rimliga laserkrafter (200-500 mW) inte är tillräckliga för att inducera indenteringsvärden som är tillräckligt stora. I så fall måste pärlan komma i kontakt med kärnan och svällningsstelheten måste kalibreras före mätningen (steg 8.6). Kärnans indrag d som en funktion av kraft kan indirekt bestämmas som:

d = _xtrap - F/k

där _xtrap är fällans position. Till skillnad från den invarianta ljus-momentumfaktorn α [pN/V], måste faktorn β [μm/V] kalibreras före varje experiment eftersom den beror på många lokala variabler som bestämmer svällningsdynamiken, såsom partikelstorlek, optisk trap spot-storlek och relativa brytningsindex.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 22 mm cover glasses	Ted Pella	260148
#1.5 22x60 mm Coverglasses	Ted Pella	260152
#1.5H glass bottom dishes	Willco	GWST-5040
10-um beads	Supelco	72986
1-mm glass capillaries	Harvard Apparatus	30-0020 GC100F-15
1-um polystyrene microbeads	Sigma	89904
1-um red-fluorescent beads	ThermoFisher	F8816
Agar	ThermoFisher	16500500
Aqcuisition cameras sCMOS	Andor	Sona-4BV11-UNI
Auxiliary camera (Figure 3, AUX)	Blackfly, FLIR	BFS-U3-200S6M-C
Calbryte 520	AAT Bioquest	520 AM
Centrifuge	Eppendorf	5453000011
Concanavalin A	Sigma	C5275
DMEM	Sigma	D2906
DNA-Hoechst	ThermoFisher	33342
Double scotch tape	Biesse Adesivi
E3	5 mM NaCl. 0.17 mM KCl. 0.33 mM CaCl2. 0.33 mM MgSO4
Eclipse Ti2	Nikon
Forceps	Fine Science Tools	11252-20
GPI-GFP
H2A-mCh
Image acquisition software	Fusion-Andor
Immersion Oil	Cargille	Type B: 16484
IR protection googles	Thorlabs	LG1
Lap2b-eGFP
Micro loader pipette	Eppendorf	GELoader
Microinjector	World Precision Instruments	SYS-PV820
MicroManager 2.0
Micromiter slide	ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 divisions
Mineral oil	Sigma	M3616
Motorized stage	ASI
Needle puller	Sutter instrument Co.	Model P-97
Optical tweezers platform	Impetux Optics	Sensocell
OTs software (LightAce)	Impetux Optics
PDMS	Sigma	Sylgard 184
PDMS Curing agent	Sigma	Sylgard 184
Post processing software (Matlab)	Mathworks
RNAse free water	Thermofisher	AM9937
Short-pass dichroic mirror (Figure 3, IR-F)	Semrock	FF01-950/SP-25
Spin-coater	Specialty Coating Systems	Spincoat G3P-8
Spinning-disk confocal microscope	Andor	DragonFly 502
Stereomicroscope	Leica M80
Triangular microinjection mold	Adaptive Science Tools	TU1
Universal oven	Memmert	UNB 200
Water immersion objective	Nikon	MRD07602